SN/T 5865-2025 出口茯砖茶冠突散囊菌平板计数

　　ICS 67. 050 CCS X 04

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/T 5865—2025

　　出口茯砖茶冠突散囊菌平板计数

　　Plate count of Eurotium cristatum in Fu Zhuan Tea for export

　　2025‑12 ‑ 11 发布 2026‑07‑01 实施

　　中华人民共和国海关总署 发 布

　　SN/T 5865—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：厦门海关技术中心、厦门市江平生物基质技术股份有限公司、福建省泉州市裕园茶业有限公司、咸阳泾渭茯茶有限公司、杭州海关技术中心、漳州城市职业学院、漳州市隆泰农业开发有限公司、湖南中茶茶业有限公司。

　　本文件主要起草人：周赞虎、彭小莉、李可、方靓、徐敦明、陈泳、郑俊超、林杨闻、黄伙水、韩阿火、林俊杰、曾丹磊、庄燕煌、张帆、胡歆、张樟。

　　Ⅰ

　　SN/T 5865—2025

　　出口茯砖茶冠突散囊菌平板计数

　　1 范围

　　本文件描述了出口茯砖茶冠突散囊菌计数方法。

　　本文件适用于茯砖茶冠突散囊菌计数，其他产品参照本方法检验。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 8302 茶 取样

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　3 术语、定义和缩略语

　　3.1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1.1

　　实时荧光 PCR real‑time polymerase chain reaction

　　实时荧光聚合酶链式反应。

　　注：是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

　　3.1.2

　　Ct 值 cycle threshold

　　每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

　　3.2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　bp：碱基对(base pair)

　　DEPC：焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dNTP：脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)

　　dUTP：脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)

　　EDTA：乙二胺四乙酸( ethylenediaminetetraacetic acid)

　　ITS1：rRNA 基因与 5.8S rRNA 基因间的内转录 1 区(internal transcribed spacer-1)

　　1

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　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　RBP1：RNA 聚合酶 Ⅱ 亚基 1(DNA-directed RNA polymeraseⅡ subunit 1)

　　SDS：十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate)

　　Taq：Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)

　　Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

　　UNG 酶：尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase)

　　4 方法提要

　　本文件采用形态学和基因鉴定相结合方法，观察特定平皿上菌落形态，显微镜观察其孢子结构，同时结合实时荧光 PCR 技术鉴定冠突散囊菌。以 ITS1 基因作为真菌的内源基因;RBP1 基因用于辅助属内种的鉴定。用所选择计数的每个平板上典型冠突散囊菌的菌落总数，乘以相应平板上已确认为冠突散囊菌的菌落数与所挑取的代表性的菌落数之比，以此求出所选用的同一稀释度 2 个计数平板上的冠突散囊菌菌落数并计算平均值，再乘以该稀释倍数，得出冠突散囊菌数。

　　5 试剂和材料

　　除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。

　　5.1 引物：扩增引物见表 1，扩增的靶标序列见附录 A 。

　　表 1 引物序列

　　基因

　　引物名称

　　序列(5 ’→ 3’)

　　RPB1

　　RPB1-2-F

　　CTCTGAGAACCTGATTCTGGGT

　　RPB1-2-R

　　CGTAGGCGAGTAACTCAACGT

　　ITS1

　　Ls-F1-F

　　CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA

　　Ls-F1-R

　　CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG

　　5.2 10×ThermoPol 缓冲液：0.2 mol/L tris-HCl、0.1 mol/L 氯化钾、0.1 mol/L 硫酸铵、20 mmol/L 硫酸镁、1% Triton X-100。

　　5.3 dNTPs：每种核苷酸浓度 10 mmol/L 。

　　5.4 DNA 提取液：0.2 mol/L Tris-HCl(pH7.5)、0.5 mol/L 氯化钠、10 mmol/L EDTA 、1%(质量分数) SDS 。

　　5.5 RNA 酶液(10 mg/mL)。

　　5.6 酚- 三氯甲烷-异戊醇混合液(体积比，25∶24∶1)。

　　5.7 三氯甲烷-异戊醇混合液(体积比，24∶1)。

　　5.8 显色液：SYBR GreenⅠ 荧光染料，10 000× 。

　　5.9 阳性对照：冠突散囊菌 CICC 2650，或含目的片段的 DNA 。

　　5.10 1.5 mL 离心管。

　　5.11 DEPC 水：在 1 000 mL 去离子水中加入 100 µL DEPC，静置过夜后高压灭菌。

　　5.12 生理盐水：按附录 B 中 B.1。

　　5.13 孟加拉红琼脂：按 B.2。

　　5.14 磷酸盐缓冲液：按 B.3。

　　2

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　　6 仪器和设备

　　6.1 培养箱：28 ℃±1 ℃ 。

　　6.2 拍击式均质器及均质袋。

　　6.3 电子天平：感量 0.1 g。

　　6.4 无菌锥形瓶：容量 500 mL 。

　　6.5 无菌试管：18 mm×180 mm 。

　　6.6 旋涡混合器。

　　6.7 无菌平皿：直径 90 mm 。

　　6.8 移液器及枪头：量程 0.5 µL~10 µL;量程 10 µL~100 µL;量程 100 µL~1 000 µL 。

　　6.9 高速台式离心机：≥7 000 g。

　　6.10 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

　　6.11 接种钩。

　　6.12 研钵。

　　6.13 水浴锅。

　　7 检验程序

　　冠突散囊菌平板计数法检验程序见图 1。

　　检样25 g(mL)样品+225 mL稀释液,均质

　　10倍系列稀释

　　选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,接种

　　孟加拉红琼脂平板

　　28 ℃±1 ℃ 72 h~120 h

　　疑似菌落观察记录

　　挑选疑似菌落鉴定试验

　　实时荧光PCR试验

　　显微镜检

　　三点法接种

　　28

　　℃±1 ℃ 72 h~120 h

　　结果观察及计算

　　报告

　　图 1 冠突散囊菌平板计数法检验程序

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　　8 操作步骤

　　8.1 样品的准备

　　8.1.1 按照 GB/T 8302 进行茶叶取样。

　　8.1.2 样品的均质：取 25 g 样品至盛有 225 mL 无菌稀释液(蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液)的适宜容器内(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或无菌均质袋中，充分振摇或用拍击式均质器拍打 1 min~ 2 min，制成 1 ∶10 的样品匀液。

　　8.1.3 取 1 mL 1∶10 样品匀液注入含有 9 mL 无菌稀释液的试管中，另换 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹吸，或在旋涡混合器上混匀，此液为 1 ∶100 的样品匀液。

　　8.1.4 按照 8.1.3 操作，制备 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次换用 1 支 1 mL 无菌吸管。

　　8.1.5 选择 2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液，在进行 10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取 1 mL样品匀液于 2 个无菌平皿内。同时分别取 1 mL 无菌稀释液加入 2 个无菌平皿作空白对照。

　　8.1.6 及时将 20 mL~25 mL 冷却至 46 ℃的孟加拉红琼脂(可放置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。

　　8.2 培养

　　琼脂凝固后，正置平板，置 28 ℃±1 ℃培养箱中培养，培养 5 d~7 d。

　　8.3 疑似菌落观察和记录

　　孟加拉红平板上黄色菌落为疑似菌落，在不开培养皿盖子的情况下，选择菌落数在 10 CFU~150 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板记录黄色疑似菌落数，低于 10 CFU 的平板记录具体菌落数，大于 150 CFU的可记录为多不可计。

　　8.4 疑似菌落挑选及确认

　　8.4.1 通则

　　至少选 5 个疑似菌落(小于 5 个全选)。每个菌落都应进行以下 3 种试验：三点法接种于孟加拉红平板、显微镜检和实时荧光 PCR 试验。

　　8.4.2 三点法接种

　　用接种针以三点法接种疑似菌落于孟加拉红平皿，培养 5 d;冠突散囊菌在孟加拉红平板上典型菌落形态特征：2d~3 d 时菌落为白色毛絮状圆形菌落，3d~4 d 后转为灿金色圆形菌落，5d~7 d 的菌落形态如附录 C 中图 C.1，边沿灿金色，中央黑褐色，并常有渗出液的圆形菌落，菌落和培养基结合紧密。

　　8.4.3 显微镜检

　　用接种环沾取无菌水，刮取疑似菌落镜检;冠突散囊菌显微特征如下：

　　显微视野下，可见子囊和子囊孢子，在 10×10 倍镜视野中可见冠突散囊菌子囊果(产囊体)，具体见图 C.2;在 10×40 倍镜视野中可见冠突散囊菌的子囊和子囊孢子，见图 C.3，8 个子囊孢子被菌丝以网袋形式包裹，子囊呈球形至近球形，直径 10 µm~14 µm;子囊孢子球形，黄色，直径 4 µm~6 µm 。

　　4

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　　8.4.4 实时荧光 PCR 试验

　　8.4.4.1 样品 DNA 的提取与纯化

　　灭菌研钵用液氮预冷。用接种钩钩取培养基上疑似菌落部分组织(0.1 g 以上)到研钵中，挑取真菌应 在 生 物 安 全 柜 内 操 作 以 防 孢 子 飞 扬 。加 液 氮 研 磨 菌 丝 至 粉 末 状。 加 入 500 µL DNA 提 取 液 入 研 钵继续研磨使粉末状菌丝成悬浮液，菌丝悬浮液吸入灭菌的 2.0 mL 无菌 PCR 管中。加 5 mL RNA 酶液(10 mg/mL)，37 ℃水浴 10 min 后，再加约等体积的酚- 三氯甲烷-异戊醇混合液(体积比，25∶24∶1)后，剧烈振荡 1 min 。4 ℃下 2 300 g 离心 10 min。收集上清液转移到新无菌 PC 管中，加等体积的三氯甲烷-异戊醇混合液(体积比，24∶1)混匀后再同样离心 10 min。上清液转移至新的 2.0 mL 的无菌 PCR 管中，添加 10% 体积乙酸钠，2.5 体积无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃下保温 1 h。然后 4 ℃下 9 300 g 离心10 min，收集沉淀，用 75% 乙醇 600 µL 洗涤后相同条件下再次离心 5 min。空气中干燥沉淀 5 min。最后将 200 µL DEPC 水溶解的 DNA 样品置于-20 ℃下保存备用。

　　或采用具有相同效果的真菌基因组 DNA 提取试剂盒进行 DNA 提取。

　　8.4.4.2 DNA 浓度和纯度测定

　　取适量 DNA 原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm和 280 nm 处的吸收值，按照公式(1)计算 DNA 的浓度。

　　ρ =A260 ×N×50 …………………………( 1 )

　　式中：

　　ρ ——DNA 质量浓度，单位为微克每毫升(µg/mL);

　　A260 ——260 nm 处的吸光值;

　　N ——核酸稀释倍数。

　　当 DNA 质量浓度为 0.1 µg/mL~100 µg/mL，A260 /A280 在 1.8~2.0 之间时，适宜于检测。

　　8.4.4.3 实时荧光 PCR 检测

　　8.4.4.3.1 实时荧光 PCR 反应体系

　　实时荧光 PCR 反应体系配制见表 2。每个样品设置 2 个平行重复。

　　表 2 实时荧光 PCR 反应体系

　　名称

　　储液浓度

　　终浓度

　　10×PCR 缓冲液

　　10×

　　1×

　　MgCl2 溶液

　　25 mmol/L

　　2.5 mmol/L

　　dNTP(含 dUTP)

　　2.5 mmol/L

　　0.2 mmol/L

　　UNG 酶

　　5 U/μL

　　0.075 U/μL

　　上游引物

　　10 μmol/L

　　见附录 A、附录 B

　　下游引物

　　10 μmol/L

　　见附录 A、附录 B

　　Taq 酶

　　5 U/μL

　　0.05 U/μL

　　SYBR GreenⅠ

　　10 000×

　　1×

　　DNA 模板

　　—

　　50 ng~250 ng

　　5

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　　表 2 实时荧光 PCR 反应体系(续)

　　名称

　　储液浓度

　　终浓度

　　超纯水

　　—

　　补足至 25 μL

　　注 1：可选用含有 PCR 缓冲液、MgCl2、dNTP 和 Taq 酶等成分的基于 Taqman 探针的实时荧光 PCR 预混液进行实时荧光 PCR 扩增。

　　注 2：ROX 荧光试剂仅在具有 ROX 校正通道的实时荧光 PCR 仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补足。

　　注 3：反应体系中各试剂的量根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

　　8.4.4.3.2 实时荧光 PCR 反应程序

　　实时荧光 PCR 反应参数为：50 ℃/2 min、95 ℃/5 min、95 ℃/10 s、55 ℃/20 s，40 个循环。

　　注：以上参数根据不同型号实时荧光 PCR 仪和所选 PCR 扩增试剂体系不同作调整。

　　8.4.4.3.3 实验对照的设立

　　每个样品应有 2 个平行实验，同时每次检测应设立 3 个对照：

　　——空白对照：以 DEPC 水替代 DNA 模板;

　　——阴性对照：以黑曲霉 CICC 2463 DNA(或其他曲霉菌标准菌株 DNA)代替模板 DNA;

　　——阳性对照：将冠突散囊菌标准菌株 CICC 2650 接种于孟加拉红平板 28 ℃±1 ℃培养 72 h~120 h，按照 8.4.4.1 提取模板 DNA，或采用含扩增目的片段的质粒 DNA 。

　　8.4.4.4 质量控制

　　下述指标有一项不符合者，实验结果视为无效，查找原因后再次进行实时荧光 PCR 检测：

　　——空白对照：ITS1 基因检测 Ct 值大于或等于 40，RPB1 基因检测 Ct 值大于或等于 40;

　　——阴性对照：ITS1 基因检测 Ct 值小于或等于 30，RPB1 基因检测 Ct 值大于或等于 40;

　　——阳性对照：ITS1 基因检测 Ct 值小于或等于 30，RPB1 基因检测 Ct 值小于或等于 35。

　　8.4.4.5 实时荧光 PCR 结果判定

　　实时荧光 PCR 结果判定如下。

　　——测试样品检测 RPB1 基因 Ct 值大于或等于 40，ITS1 基因检测 Ct 值小于或等于 30，则可判定该样品阴性。

　　——测试样品检测 RPB1 基因 Ct 值小于或等于 35，ITS1 基因检测 Ct 值小于或等于 30，判定该样品阳性。

　　——测试样品检测 RPB1 基因 Ct 值在 36~40 之间 ，应重做实时荧光 PCR。再次扩增后的 RPB1基因检测 Ct 值仍小于 40，则可判定为该样品阳性。再次扩增后的 RPB1 基因检测 Ct 值大于或等于 40，则可判定为该样品阴性。

　　8.4.4.6 防污染措施

　　检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 中的规定执行。

　　8.4.5 确认

　　显微结构显示子囊球内含 8 个黄色子囊孢子，三点法接种孟加拉红平板菌落为外周金黄色、中间黑

　　6

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　　色、并有外泌水珠，实时荧光 PCR 结果阳性，同时符合以上特征的菌落确认为冠突散囊菌(见表 3)。

　　表 3 冠突散囊菌特征与其他散囊菌的区别

　　菌种

　　显微结构(散囊菌属)

　　三点法接种孟加拉红平板菌落特征

　　实时荧光 PCR 结果

　　冠突散囊菌

　　营养菌丝上形成产囊体(子囊果)，子囊果里有多个子囊，子囊 球 形 或 近 球 形 ，内 含 8 个 子囊孢子，通常为黄色

　　生长良好;外周金黄色 ;中间黑色，并有外泌水珠

　　阳性

　　蜡叶散囊菌

　　生长旺盛;黄色，表层有蜡质;中间无黑色，无外泌水珠

　　阳性

　　肋状散囊菌

　　生长;黄色;中间无黑色，无外泌水珠

　　阳性

　　匍匐散囊菌原变种

　　生长;白色;中间无黑色，无外泌水珠

　　阳性

　　赤散囊菌

　　生长，赤黄色;中间无黑色，无外泌水珠

　　阴性

　　阿姆斯特丹散囊菌

　　生长;黄色;菌落中间有乳状突起 . 中间无黑色，无外泌水珠

　　阴性

　　谢瓦散囊菌

　　生长;黄色;中间无黑色，无外泌水珠

　　阴性

　　高渗散囊菌

　　不生长或微弱生长

　　阴性

　　9 结果计算

　　9.1 若只有一个稀释度平板的疑似菌落数在 10 CFU~150 CFU 之间，计数该稀释度平板上的疑似菌落，按公式(2)计算。

　　T=AB/Cd …………………………( 2 )

　　式中：

　　T ——样品中冠突散囊菌菌落数;

　　A ——某一稀释度疑似菌落总数的二分之一;

　　B ——某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;

　　C ——某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;

　　d ——稀释因子。

　　9.2 若最低稀释度平板的疑似菌落数小于 10 CFU，计数该稀释度平板上的疑似菌落，按公式(2)计算。

　　9.3 若某一稀释度平板的疑似菌落数大于 150 CFU，但下一稀释度平板上没有疑似菌落，计数该稀释度平板上的疑似菌落，按公式(2)计算。

　　9.4 若某一稀释度平板的疑似菌落数大于 150 CFU，而下一稀释度平板上虽有疑似菌落但不在 10 CFU~

　　150 CFU 范围内，应计数该稀释度平板上的疑似菌落，按公式(2)计算。

　　9.5 若 2 个连续稀释度的平板疑似菌落数均在 10 CFU~150 CFU 之间，按公式(3)计算。

　　T=(A1B1 /C1 +A2B2 /C2)/(n1 +0.1n2)d …………………………( 3 )

　　式中：

　　T ——样品中冠突散囊菌菌落数;

　　A1 ——第一稀释度(低稀释倍数)疑似菌落的总数;

　　B1 ——第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;

　　C1 ——第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;

　　A2 ——第二稀释度(高稀释倍数)疑似菌落的总数;

　　B2 ——第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;

　　7

　　SN/T 5865—2025

　　C2 ——第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;

　　n1 ——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;

　　n2 ——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;

　　d ——稀释因子(第一稀释度)。

　　10 报告

　　根据公式(2)或公式(3)计算结果，报告每 g(mL)样品中冠突散囊菌数，以 CFU/g 或 CFU/mL 表示;如 T 值为 0，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告。

　　11 生物安全措施

　　为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测冠突散囊菌，所有培养物和废弃物应按照 GB 19489 中的有关规定执行。防止污染措施应符合 GB/T 27403 的规定。

　　8

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　冠突散囊菌RPB1 基因扩增序列

　　冠突散囊菌 RPB1 基因扩增靶标参考序列：

　　CTCTGAGAACCTGATTCTGGGTCAGATGGCACCCGCTGGTACGGGAGAATTCGACATC TACCTGGACCAGAACCTGCTCAACACCGTCGTCTCGAACAACGCACGGTATGGTGTTATG GGATCGATCGGTGCCAAGGATGCTATCATCTCTGACGGTGCTGCGACCCAATACGACACT GGTTCTCCCATGCAGGAGAGTGCGTACATCGGCACTCCCGACCCCGAATCGAACTTCTCT CCGATTCGCCAGGCCGGCGCCGAGACTCCTGGTGGCTTTACAGACTACCAGCCATCTGCT GGGTTTGGTGGATTCAGTCCAGGGCCGACAAGCCCGGCTGGATACTCCCCGACAAGCCCA TTCAACACAAGCCCAACGTCTCCTGGCTATTCTCCGACGTTGAGTTACTCGCCTACG

　　注：加粗部分为引物合成参考序列。

　　9

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　　附 录 B (规范性)

　　培养基和试剂

　　B.1 生理盐水

　　B.1.1 成分

　　氯化钠 8.5 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B.1.2 制法

　　氯化钠加入 1 000 mL 蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装后，121 ℃灭菌15 min，备用。

　　B.2 孟加拉红琼脂

　　B.2.1 成分

　　蛋白胨 5.0 g

　　葡萄糖 10.0 g

　　磷酸二 1.0 g

　　硫酸镁(无水) 0.5 g

　　琼脂 20.0 g

　　孟加拉红 0.033 g

　　氯霉素 0.1 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B.2.2 制法

　　上述各成分加入蒸馏水中，加热溶解，补足蒸馏水至 1 000 mL，分装后，121 ℃灭菌 15 min，避光保存备用。

　　B.3 磷酸盐缓冲液

　　B.3.1 成分

　　10

　　磷酸二氢钾蒸馏水

　　

　　34.0 g 500 mL

　　B.3.2 制法

　　贮存液：称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 mL 蒸馏水中，用大约175 mL 的 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.2±0.1，用蒸馏水稀释至 1 000 mL 后贮存于冰箱。

　　稀释液：取贮存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　冠突散囊菌特征菌落与显微结构附图

　　冠突散囊菌特征菌落与显微结构见图 C.1~图C.3。

　　标引序号说明：

　　1——子囊果。

　　图 C.1 冠突散囊菌 5 d~7 d 菌落形态 图 C.2 冠突散囊菌子囊果

　　1

　　2

　　标引序号说明： 1——子囊;

　　2——子囊孢子。

　　图 C.3 冠突散囊菌子囊及子囊孢子

　　11