SN/T 5864-2025 出口肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 EMA-芯片式数字PCR法

　　ICS 07. 100. 30 CCS X 04

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/T 5864—2025

　　出口肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 EMA-芯片式数字 PCR 法

　　Method for detection of Listeria monocytogenes in exported meat product—

　　EMA combined with chip digital PCR method

　　2025-12-11发布 2026-07-01 实施

　　中华人民共和国海关总署 发 布

　　SN/T 5864—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：中华人民共和国泰安海关、山东农业大学。

　　本文件主要起草人：王超、李建亮、贝峰、王一新、栾晓宁、徐瑞雪、赵成新、韦伟、郭云、王炳军、吴伟、刘敏。

　　Ⅰ

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　　出口肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 EMA-芯片式数字 PCR 法

　　1 范围

　　本文件描述了出口肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的 EMA 结合芯片式数字 PCR 检测方法。

　　本文件适用于出口肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌(活菌)的快速定性检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　芯片式数字 PCR chip digital PCR

　　基于微反应室/孔板的数字 PCR 系统即芯片式数字 PCR(cdPCR)是在荧光 PCR 基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，通过制备高密度纳升级反应阵列，将单个 DNA 分子转移入独立的反应室/孔，PCR 扩增反应后，对荧光信号进行检测分析，通过阳性率和泊松分布计算，实现单分子的绝对定量。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BHQ1：黑洞淬灭基团 1(black hole quenchers 1)

　　cdPCR：芯片式数字 PCR(chip digital PCR)

　　DMF：N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　EDTA：乙二胺四乙酸( ethylenediamine tetraacetic acid)

　　EMA：叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide)

　　FAM：6-羧基荧光素(6-carboxy fluorescein)

　　hly：溶血素基因(hemolysin gene)

　　LLO：单核细胞增生李斯特氏菌溶血素 O(listeriolysin O)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　SDS：十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)

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　　Tris-HCl：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐[Tri(hydroxymethyl)amino methane mydrochloride]

　　5 方法原理

　　本方法结合 EMA 前处理，选用编码 LLO 的 hly 基因的检测结果来确定待检样品中是否存在单核细胞增生李斯特氏菌。 EMA 能选择性地渗透损伤菌或死菌的细胞膜，与菌体 DNA 发生共价交联，阻断DNA 分子的 PCR 扩增。利用 hly 基因特异性的引物和探针，通过提取活菌基因组 DNA 和 cdPCR 方法，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果，得到样品中靶标基因的含量。

　　6 主要设备及耗材

　　6.1 天平：感量 0.1 g。

　　6.2 冰箱：-20 ℃~4 ℃ 。

　　6.3 高速台式冷冻离心机：≥12 000 r/min。

　　6.4 恒温摇床：室温~60 ℃ 。

　　6.5 恒温水浴锅：室温~100 ℃ 。

　　6.6 涡旋振荡仪。

　　6.7 生物安全柜。

　　6.8 cdPCR 系统(含仪器配套耗材)。

　　6.9 不同量程移液器：100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL。

　　6.10 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL。

　　6.11 卤钨灯：500 W 。

　　7 材料与试剂

　　7.1 仅使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级水。

　　7.2 EMA 工作液：见附录 A。

　　7.3 RNA 酶(10 mg/mL)。

　　7.4 cdPCR 反应体系有关试剂。

　　7.5 阳性质控菌株：单核细胞增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes ATCC 19111、CMCC 54004 或其他等效标准菌株。

　　7.6 阴性质控菌株：非致病性李斯特氏菌[如：英诺克李斯特氏菌 Listeria innocua ATCC 33090、伊氏李斯特氏菌 Listeria ivanovii ATCC 19119、斯氏李斯特氏菌 Listeria seeligeri ATCC 35967、格氏(默氏)李斯特氏菌 Listeria grayi(murrayi)ATCC 25401，或其他等效标准菌株]。

　　7.7 试验用引物探针序列及选用：选择 hly 基因保守区，设计特异性引物和探针。在探针 3'端用淬灭荧光染料 BHQ1 标记，5'端用报告荧光染料 FAM 标记，合成特异性引物和探针。引物和荧光探针序列如表 1 所示，扩增序列见附录 B。

　　表 1 单核细胞增生李斯特氏菌 cdPCR 引物探针序列

　　基因

　　引物/探针名称

　　序列

　　hly

　　上游引物(hly-F)

　　5'-CCATCAATCAAAATAATGCAGACAT-3'

　　hly

　　下游引物(hly-R)

　　5'-AATGAATCACGTTTTACAGGGAGAA-3'

　　hly

　　探针(hly-P)

　　5'-FAMTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGBHQ1-3'

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　　8 试验操作步骤

　　8.1 样品制备、增菌培养

　　按照 GB 4789.30 进行一次增菌，获得增菌液。

　　8.2 模板的制备

　　吸取 1 mL 8.1 中增菌液，加入 EMA 工作液至其终浓度为 20 μg/mL，卤钨灯光照 20 min，后 6 000 r/min离 心 10 min，倒 掉 上 清 液 ，获 得 菌 体 沉 淀 。加 入 250 μL 的 TE 缓 冲 液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，使 菌 体 重 新 悬 浮 。 后 加 入 30 μL 10%SDS 溶 液 ，15 μL 蛋 白 酶 K(20 mg/mL)，5 μL RNA 酶(10 mg/mL)，充分混匀后，37 ℃ 水浴 1 h。加等体积的酚- 三氯甲烷- 异戊醇(25∶24∶1)，混匀， 12 000 r/min 离心 10 min。取上清液，加等体积的三氯甲烷-异戊醇(24∶1)混匀，12 000 r/min 离心 10 min。取上清，加 2.5 倍体积无水乙醇，颠倒混匀后置于-20 ℃下保温 30 min。然后 10 000 r/min 离心 10 min，收集沉淀，用 75% 乙醇 600 μL 洗涤后，相同条件下再次离心 5 min。空气中干燥沉淀 5 min。用 200 μL超纯水溶解 DNA，置于-20 ℃下保存备用。

　　也可使用等效的商业化的细菌 DNA 提取试剂盒并按其说明制备模板 DNA。

　　8.3 cdPCR 检测

　　8.3.1 反应体系

　　按照表 2 配制 cdPCR 的最终反应体系，并用涡旋振荡仪混匀。

　　表 2 cdPCR 试验反应体系

　　试剂

　　终浓度

　　体积/μL

　　Digital PCR Master Mix v2

　　—

　　7.3

　　模板

　　1.5 mg/L

　　1.4

　　上游引物

　　0.6 µmol/L

　　1.0

　　下游引物

　　0.6 µmol/L

　　1.0

　　探针

　　0.25 µmol/L

　　1.0

　　超纯水加至

　　—

　　15.0

　　8.3.2 反应参数

　　反应扩增条件为 96 ℃ , 10 min;60 ℃ , 2 min，98 ℃ , 30 s，42 个循环;60 ℃ , 2 min，10 ℃ ,保存。

　　注：以上参数根据不同型号芯片式数字 PCR 仪和所选 PCR 扩增试剂体系不同进行适当的调整。具体设置法参照仪器使用说明书。

　　8.3.3 加样扩增

　　将按照 8.3.1 中配制好的体系通过 cdPCR 系统仪器自动加载到芯片上各微孔中，体系加载完成后使用 Immersion Fluid 覆盖芯片表面并将芯片密封。之后将芯片放置于平板 PCR 仪上进行扩增。扩增结束后，待芯片恢复到室温，然后将芯片置入 cdPCR 读取仪中读取并初步分析芯片结果，再经软件二次分析试验数据，获得定性结果。

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　　8.3.4 对照和平行

　　检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以 7.5 中相对应的阳性质控菌株 DNA 或含目的片段的 DNA 作阳性对照，7.6 中阴性质控菌株 DNA 作阴性对照，用等体积的超纯水代替 DNA 模板作为空白对照。每个待检样品应有 2 个平行试验。

　　9 结果分析与表述

　　9.1 质量控制

　　空白对照：阳性微孔数少于或等于 1。

　　阴性对照：阳性微孔数少于 5。

　　阳性对照：阳性微孔数大于 5。

　　以上质控条件有一项不符合者，试验结果视为无效。

　　阴性、阳性结果参照附录 C 中图 C.1。

　　9.2 结果分析

　　9.2.1 数据分析

　　目标基因检测阳性微孔数<5，可判定该样品不含所检基因。

　　目标基因检测阳性微孔数>5，可判定该样品含有所检基因。

　　目标基因检测阳性微孔数等于 5，应调整模板浓度，重做数字 PCR。再次扩增后的检测阳性微孔数仍等于 5，且阴性对照阳性微孔数少于 5，则可判定为该样品含所检基因。再次扩增后的检测阳性微孔数少于 5，且阴性对照阳性微孔数少于 5，则可判定为该样品不含所检基因。

　　对于判断含有所检基因的样品，应按照 GB 4789.30 的方法做进一步的确证和报告。

　　9.2.2 结果判定与报告

　　若该样品不含所检基因，或该样品含有所检基因但 GB 4789.30 确证不符合者，判定结果为阴性，报告“未检出单核细胞增生李斯特氏菌”;若该样品含有所检基因且 GB 4789.30 确证符合者，判定结果为阳性，报告“检出单核细胞增生李斯特氏菌”。

　　10 生物安全和防污染措施

　　10.1 生物安全措施

　　为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行操作，所有培养物和废弃物参照 GB 19489中的有关规定。

　　10.2 防污染措施

　　防污染措施应符合 GB/ T 27403 的规定。

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　试剂

　　A.1 EMA 工作液成分

　　叠氮溴化乙锭 5.0 mg

　　DMF 5.0 mL

　　A.2 EMA 工作液制法

　　5 mg 叠氮溴化乙锭溶于 5 mL DMF 中，充分混匀，分装后于−20 ℃避光保存。

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　单核细胞增生李斯特氏菌 hly 基因扩增序列

　　CCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTAT CCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCC

　　TGTAAAACGTGATTCATT注：详见 GenBank：LC259945.1。

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　EMA‑cdPCR 方法特异性试验结果

　　EMA-cdPCR 方法特异性试验结果见图C.1。

　　a)阳性结果图 b ) 阴性结果图注：蓝色为阳性微孔，黄色为阴性微孔。

　　图 C.1 EMA‑cdPCR 方法特异性试验结果

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