SN/T 5887-2025 出口食品中β型溶血性链球菌检测方法 实时荧光PCR法
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资料介绍
ICS 07.100.30 CCS X 04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5887—2025
出口食品中 β 型溶血性链球菌检测方法
实时荧光 PCR 法
Method for the detection of β-hemolytic streptococcus in food for export—
Real-time PCR method
2025-07-25 发布 2026-02-01 实施
中华人民共和国海关总署 发 布
SN/T 5887—2025
前 言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：拱北海关技术中心、广东产品质量监督检验研究院、珠海粤港食品安全检测有限公司、大连海关技术中心。
本文件主要起草人：姚丽锋、王小玉、张娟、黎财慧、杨爱馥、游淑珠、冯家望、张晴阳、唐食明、曾俊洁、李清岚。
Ⅰ
SN/T 5887—2025
出口食品中 β 型溶血性链球菌检测方法
实时荧光 PCR 法
1 范围
本文件描述了出口食品中 β 型溶血性链球菌(Streptococcus)的实时荧光 PCR 检测方法。
本 文 件 适 用 于 食 品 中 β 型 溶 血 的 化 脓 链 球 菌(Streptococcus pyogenes)和 无 乳 链 球 菌(Streptococcus agalactiae)的快速检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.11 食品安全国家标准 食品微生物学检验 β 型溶血性链球菌检验
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
实时荧光 PCR real‑time PCR
在 PCR 扩增时加入带有荧光基团的特异性探针(Taqman 探针)或荧光染料，荧光信号的增加可反映 PCR 产物量的增加，实现 PCR 产物的实时监测。
3.2
Ct 值 cycle threshold value
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHQ1：黑洞淬灭基团(black hole quencher 1)
cfb：成孔蛋白 CAMP 毒力因子(CAMP factor pore-forming toxin)
DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)
dCTP：脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
1
SN/T 5887—2025
dTTP：脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)
FAM：6-羧基荧光素(6-carboxy fluorescein)
PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
spy1258：化脓链球菌 1258 基因(Streptococcus pyogenes 1258)
Taq：水生栖热菌(Thermos aquaticus)
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxy methyl)aminomethane]
5 方法原理
根据 β 型溶血的化脓链球菌和无乳链球菌各自特有的靶基因序列，化脓链球菌选用其转录调节基因spy1258 基因，无乳链球菌选用编码溶血素基因的 cfb 基因，设计特异性的 PCR 引物和荧光标记探针，提取 模 板 DNA 进 行 实 时 荧 光 PCR 检 测 ，从 而 对 食 品 中 β 型 溶 血 的 化 脓 链 球 菌 和 无 乳 链 球 菌 进 行 快 速检测。
6 主要设备及耗材
6.1 实时荧光 PCR 仪。
6.2 离心机(≥12 000 r/min)。
6.3 不同量程微量移液器：0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL。
6.4 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。
6.5 高压灭菌器。
6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计(测定波长 280 nm 和 260 nm)。
6.7 天平：感量 0.01 g。
6.8 均质器。
6.9 涡旋振荡仪。
6.10 生物安全柜。
6.11 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL。
6.12 PCR 反应管。
6.13 不同量程移液器的配套吸头。
7 材料与试剂
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。
7.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤(modified tryptone soybean broth，mTSB)：成分和配制方法见 GB 4789.11。
7.2 哥伦比亚 CNA 血琼脂平板：成分和配制方法见 GB 4789.11。
7.3 Taq DNA 聚合酶。
7.4 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
7.5 细菌 DNA 提取试剂盒。
7.6 10 倍 PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)，200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2。
7.7 引物和探针
引物和探针序列见表 1，其中探针的 5’端标记 FAM，3’端标记 BHQ1 。spy1258 基因、cfb 基因扩增
2
SN/T 5887—2025
的靶标序列参见附录 A 。
表 1 引物和探针序列
引物/探针
序列(5 ’→ 3’)
β 型溶血性链球菌
GenBank no .
spy1258
F：ATAGAGAATTTATAACCGCACTCGCTAC
R：ACTGGCAAGGTAAACTTCTAAAGCAT
P：CCGCAACTCATCAAGGATTTCTGTTACCAA
streptococcus pyogenes
(化脓链球菌)
CP043530.1
cfb
F:GTTAATGAGGCTATTACTAGTGTT
R:GGCTTCTACACGACTACCA
P:CATAAACTGTCTCAGGGTTGGC
streptococcus agalactiae
(无乳链球菌)
MK134700.1
注：探针
的荧光标记物能根据基因扩增仪功能的不同进行调整。
8 检验程序
β 型溶血性链球菌检验程序见图 1。
样品25 g (或mL ) + 225 mL mTSB
36 ℃±1 ℃ 18 h ~24 h
取增菌液提取DNA进行PCR扩增
阳性
36 ℃±1 ℃ 18 h ~24 h
划线接种哥伦比亚CNA血琼脂平板
36 ℃±1 ℃ 18 h~24 h,厌氧培养
取可疑菌落提取DNA进行PCR扩增
无可疑菌落 阳性 阴性
按GB 4789.11进行确证
结果报告
图 1 β 型溶血性链球菌检验程序
3
SN/T 5887—2025
9 检测步骤
9.1 样品处理及增菌、分离
按照 GB 4789.11 的方法进行样品制备和增菌、分离。
9.2 细菌模板 DNA 的制备
9.2.1 增菌液模板 DNA 的制备
吸取 1 mL 增菌液加入 1.5 mL 无菌离心管中，12 000 r/min 离心 2 min，吸弃上清液;采用试剂盒中的细菌悬浮液重悬细菌，并按照细菌 DNA 提取试剂盒说明书制备模板 DNA 。
9.2.2 可疑菌落模板 DNA 的制备
对于分离到的可疑菌落或菌体，可直接挑取可疑单菌落于 100 μL 无菌生理盐水混匀，12 000 r/min离心 2 min，吸弃上清液;采用试剂盒中的细菌悬浮液重悬细菌，并按照细菌 DNA 提取试剂盒说明书制备模板 DNA 。
9.3 DNA 浓度和纯度的测定
取适量 DNA 溶液原液加超纯水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm和 280 nm 处的吸收值，DNA 的浓度按照式(1)计算。
ρ =A260 ×N×50 ……………………………( 1 )
式中：
ρ ——DNA 浓度，单位为微克每毫升(µg/mL);
A260 ——260 nm 处的吸光值;
N ——核酸稀释倍数。
当 DNA 浓 度 在 10 µg/mL~100 µg/mL ，A260 /A280 在 1.7~1.9 之 间 时 ，适 宜 于 实 时 荧 光 PCR检测 。
9.4 实时荧光 PCR 扩增
9.4.1 反应体系
按表 2 配制实时荧光 PCR 的最终反应体系。
表 2 实时荧光 PCR 反应体系
试剂
终浓度
体积/μL
10×荧光定量 PCR 反应混合液
1
2.5
上游引物(10 µmol/L)
0.4 µmol/L
1.0
下游引物(10 µmol/L)
0.4 µmol/L
1.0
探针(10 µmol/L)
0.4 µmol/L
1.0
dNTP(10 mmol/L)
0.4 mmol/L
1.0
Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)
0.1 U/μL
0.5
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SN/T 5887—2025
表 2 实时荧光 PCR 反应体系(续)
试剂
终浓度
体积/μL
模板 DNA
—
2
超纯水加至
—
25.0
注 1：也能选用含有 PCR 缓冲液、MgCl2、dNTP 和 Taq 酶等成分的基于 Taqman 探针的实时荧光 PCR 预混液进行实时荧光 PCR 扩增。
注 2：反应体系中各试剂的量能根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。
9.4.2 反应参数
95 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸 45 s，在退火延伸阶段收集 FAM 荧光;进行 40 个循环。
注：以上参数能根据不同型号实时荧光 PCR 仪不同进行适当的调整。设置 PCR 反应管荧光信号收集条件，需与探针标记的报告基团一致。具体设置方法参照仪器使用说明书。
9.4.3 对照和平行
检测过程中设阴性对照、空白对照、阳性对照各 1 个。空白对照以超纯水替代 DNA 模板。阴性对照 为 非 目 标 菌 DNA 模 板 。 阳 性 对 照 为 含 有 扩 增 片 段 的 质 粒 DNA 或 溶 血 性 链 球 菌 标 准 菌 株 DNA (spy1258 基因阳性对照用化脓性链球菌标准菌株 CICC 10373，cfb 基因阳性对照用无乳链球菌标准菌株ATCC 27956，或其他来源于正规保藏机构的合格菌株)。每个待检样品设 2 个平行试验。
10 结果分析与报告
10.1 质量控制
空白对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0。
阴性对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0。
阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值应<30.0。
否则，试验视为无效。
10.2 结果分析
目标基因 Ct 值≥40.0，该样品未检出目标基因。
目标基因 Ct 值≤35.0，该样品检出目标基因。
目标基因 Ct 值>35.0 而<40.0，样本应重做。重做结果 Ct 值≥40.0，该样品未检出目标基因，否则报告该样品检出目标基因。
10.3 结果报告
样品中 spy1258 和 cfb 基因均未检出，可判定该样品扩增结果为阴性，直接报告未检出 β 型溶血的化脓链球菌和无乳链球菌。
样品中 spy1258 和 cfb 任一基因检出，可判定该样品扩增结果为阳性。
对于阳性结果，应按 GB 4789.11 中的方法做进一步的生化鉴定和报告。
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SN/T 5887—2025
11 生物安全和防污染措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测，所有培养物和废弃物应按照 GB 19489中的有关规定执行。
防止污染措施应符合 GB/T 27403 的规定。
6
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附 录 A
(资料性)
β 型溶血性链球菌特征基因扩增靶标参考序列
A.1 spy1258 基因参考序列(GenBank no.CP 043530. 1)
5 ,‑ATAGAGAATTTATAACCGCACTCGCTACTATTTCTTACCTCAAATTTCCGCAACT CATCAAGGATTTCTGTTACCAATTTTTGACTACTATTACTGGTTTCCAAGACATTGTGA CCAATCAATACCATATTCCTTATCCCTATGCTTTAGAAGTTTACCTTGCCAGT‑3 ,
A.2 cfb 基因参考序列(GenBank no.MK 134700. 1)
5 ,‑GTTAATGAGGCTATTACTAGTGTTGAAAAATTAAAGACTTCATTGCGTGCCAACC CTGAGACAGTTTATGATTTGAATTCTATTGGTAGTCGTGTAGAAGCC‑3 ,
7
