SN/T 5888-2025 出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检测方法 实时荧光PCR法

　　ICS 07.100.20 CCS X 04

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/T 5888—2025

　　出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌

　　(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检测方法

　　实时荧光 PCR 法

　　Detection method of Burkholderia gladioli(Psedomonas cocovenenans subsp. farino fermentans)in food for export—Real‑time PCR method

　　2025‑12 ‑ 11 发布 2026‑07‑01 实施

　　中华人民共和国海关总署 发 布

　　SN/T 5888—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：拱北海关技术中心、珠海粤港食品安全检测有限公司、杭州海关技术中心。

　　本文件主要起草人：冯家望、黎财慧、游淑珠、唐食明、姚丽锋、王小玉、李可、张晴阳、曾俊洁、陈敬。

　　Ⅰ

　　SN/T 5888—2025

　　出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌

　　(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检测方法

　　实时荧光 PCR 法

　　1 范围

　　本文件描述了出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)[Burkholderia gladio- li(Psedomonas cocovenenans subsp. farino fermentans)]实时荧光 PCR 检测方法。

　　本文件适用于出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 4789.29 食品安全国家标准 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　实时荧光 PCR real time PCR

　　在 PCR 扩增时加入带有荧光基团的特异性探针(TaqMan 探针)或荧光染料，使 PCR 产物的积累与荧光信号的积累完全同步，实现 PCR 产物的实时监测。

　　3.2

　　Ct 值 Cycle threshold

　　每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BHQ1：黑洞淬灭剂-1(black hole quencher-1)

　　bonM 基因：编码米酵菌酸生物合成基因簇中甲基转移酶的基因(the gene encoding O-methytransferase of bongkrekic acid biosynthentic gene cluster)

　　CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　1

　　SN/T 5888—2025

　　dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)

　　dCTP：脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)

　　dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)

　　dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)

　　FAM：6-羧基荧光素(6-carboxy fluorescein)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxy methyl)aminomethane]

　　5 方法原理

　　本方法通过特异性引物和探针进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的特异性bonM 基因序列的实时荧光 PCR 扩增，根据 Ct 值进行判定，实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的检测。

　　6 主要设备及耗材

　　6.1 天平：感量 0.1 g。

　　6.2 均质器。

　　6.3 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。

　　6.4 高速冷冻离心机：离心力 12 000g。

　　6.5 涡旋振荡仪。

　　6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

　　6.7 Ⅱ级生物安全柜。

　　6.8 实时荧光 PCR 仪。

　　6.9 不同量程移液器：100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL 。

　　6.10 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL 。

　　6.11 PCR 管。

　　7 材料与试剂

　　除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。

　　7.1 GVC 增菌液：成分和配制方法见 GB 4789.29。

　　7.2 mPDA 平板：成分和配制方法见 GB 4789.29。

　　7.3 PCFA 平板：成分和配制方法见 GB 4789.29。

　　7.4 生理盐水。

　　7.5 DNA 提取液：称取 0.1 g chelex 100 粉末，加入 100 mL 灭菌蒸馏水中，摇匀即可。也可使用商业化的 DNA 提取试剂盒。

　　7.6 Taq DNA 聚合酶。

　　7.7 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP 。

　　7.8 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)，200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2。

　　7.9 阳性质控菌株：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)BNCC 354544 或其他等效标准菌株。

　　2

　　SN/T 5888—2025

　　7.10 阴性质控菌株：大肠埃希氏菌 ATCC 25922 或其他等效菌株。

　　7.11 实验用引物探针见表 1，扩增片段序列见附录 A(GenBank：JX173632.1)。实时荧光 PCR 扩增的引物和探针加超纯水配制成 100 μmol/L 储备液，工作液需用储备液稀释至 10 μmol/L 。

　　表 1 引物探针序列

　　名称

　　引物探针序列(5 ′→ 3 ′)

　　目的基因

　　bonM-F

　　TACCACCGAGCAGTTCATGG

　　bonM

　　bonM-R

　　ATGAAGGTCTCGTCGGCTTG

　　bonM-P

　　FAM-ATACAGCCGCGACAGGTTCCAGT-BHQ1

　　8 技术路线

　　技术路线见图 1。

　　检样

　　1. 鲜银耳1 g+20 mL GVC增菌液

　　2. 其他食品25 g(mL)+225 mL GVC增菌液

　　36 ℃±1 ℃ 20 h~24 h

　　取增菌液提取DNA进行PCR扩增

　　阳性

　　36 ℃±1 ℃ 20 h~24 h

　　mPDA和PCFA

　　36 ℃±1 ℃ 24 h~48 h

　　取可疑菌落提取DNA进行PCR扩增

　　无可疑菌落

　　阳性 阴性

　　按GB 4789.29进行确证

　　结果报告

　　图 1 食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检测流程图

　　3

　　SN/T 5888—2025

　　9 实验操作步骤

　　9.1 样品处理

　　无菌操作称取 25 g(mL)样品，置入盛有 225 mL GVC 增菌液的无菌均质袋中(鲜银耳样品取 1 g，用剪刀剪碎，加入盛有 20 mL GVC 增菌液的无菌均质袋中)，用拍击式均质器拍打 1 min~2 min;或置入盛有 225 mL GVC 增菌液的无菌均质杯中，以 8 000 r/min~10 000 r/min 均质 1 min~2 min;若样品为液态，振荡混匀。

　　9.2 增菌

　　将上述样品增菌液置 36 ℃±1 ℃培养 20 h~24 h。

　　9.3 分离

　　用直径 3 mm 的接种环取增菌液一环，分别划线接种于 mPDA 平板和 PCFA 平板，36 ℃±1 ℃培养

　　24 h~48 h。观察各个平板上生长的菌落，各个平板上菌落特征见表 2。

　　表 2 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)在不同分离平板上的菌落特征

　　培养基

　　菌落特征

　　mPDA 平板

　　培养 24 h 后，菌落1 mm~2 mm，紫色，光滑，湿润、边缘整齐;培养 48 h 后，部分菌落中心可有呈草帽状凸起

　　PCFA 平板

　　培养 24 h 后，菌落 0.5 mm~1 mm，灰白色，光滑，湿润、边缘整齐

　　9.4 细菌模板 DNA 的提取

　　9.4.1 菌落 DNA 提取

　　自选择性琼脂平板上分别挑取 5 个以上典型或可疑菌落(低于 5 个全选)，将可疑菌落刮取一环重悬于 1 mL 生理盐水的无菌离心管中，旋涡混匀，8 000g 离心 5 min，吸弃上清液：加入 50 μL DNA 提取液(使 用 前 室 温 解 冻 并 充 分 混 匀 ，快 速 吸 取)，混 匀 后 沸 水 浴 5 min，12 000g 离 心 5 min，取 上 清 液 保 存 于 -20 ℃备用。

　　9.4.2 增菌液中 DNA 提取

　　取增菌液 1 mL，加到 1.5 mL 无菌离心管中，8 000g 离心 5 min，吸弃上清液：加入 50 μL DNA 提取液(使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取)，混匀后沸水浴 5 min，12 000g 离心 5 min，取上清液保存于-20 ℃备用。

　　也可使用等效的商业化 DNA 提取试剂盒并按说明制备模板 DNA 。

　　9.5 DNA 浓度和纯度的测定

　　样品 DNA 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处的吸收值，按照式(1)计算 DNA 的浓度。

　　ρ = A260 ×50 …………………………( 1 )

　　式中：

　　ρ ——DNA 质量浓度，单位为纳克每微升(ng/µL);

　　4

　　SN/T 5888—2025

　　A260 ——260 nm 处的吸光值。

　　当 DNA 质量浓度为 2 ng/µL~50 ng/µL，A260 /A280 在 1.7~1.9 之间时，适宜于实时荧光 PCR 检测。

　　9.6 实时荧光 PCR 检测

　　9.6.1 反应体系

　　按照表 3 配制实时荧光 PCR 的最终反应体系。

　　表 3 实时荧光 PCR 实验反应体系

　　试剂

　　终浓度

　　体积/μL

　　模板 DNA

　　—

　　5.0

　　10×Buffer

　　1×

　　2.5

　　10 µmol/L 上游引物

　　0.4 µmol/L

　　1.0

　　10 µmol/L 下游引物

　　0.4 µmol/L

　　1.0

　　10 µmol/L 探针

　　0.4 µmol/L

　　1.0

　　dNTP(10 mmol/L)

　　0.4 mmol/L

　　1.0

　　Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)

　　0.1 U/μL

　　0.5

　　无菌超纯水

　　—

　　13.0

　　注 1：选用含有 PCR 缓冲液、MgCl2、dNTP 和 Taq 酶等成分的基于 TaqMan 探针的实时荧光 PCR 预混液进行实时荧光 PCR 扩增。

　　注 2：反应体系中各试剂的量根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

　　9.6.2 反应参数

　　50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸 45 s，同时收集荧光，进行 40 个循环。

　　注：以上参数根据不同型号实时荧光 PCR 仪和所选 PCR 扩增试剂体系不同进行适当的调整。设置 PCR 反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法参照仪器使用说明书。

　　9.6.3 对照和平行

　　检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以 7.9 中的相对应的阳性质控菌株 DNA 或含目的片段的 DNA 作阳性对照，7.10 中阴性质控菌株 DNA 作阴性对照，用等体积的超纯水代替 DNA模板作为空白对照。每个待检样品进行 2 个平行实验。

　　10 结果分析与表述

　　10.1 质量控制

　　阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值<30.0;

　　阴性对照、空白对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0;

　　以上有一条不满足时，实验均视为无效。

　　10.2 结果判定

　　Ct 值≥40.0，可判定该样品 PCR 扩增结果为阴性。

　　5

　　SN/T 5888—2025

　　Ct 值≤35.0，可判定该样品 PCR 扩增结果为阳性。

　　35.0

　　对于 PCR 扩增阳性结果，应按照 GB 4789.29 的方法做进一步的确证和报告。

　　10.3 结果报告

　　若 增 菌 液 或 所 有 挑 取 的 典 型 或 可 疑 菌 落 PCR 扩 增 结 果 均 为 阴 性 ，或 PCR 扩 增 结 果 为 阳 性 但GB 4789.29 确证不符合者，报告未检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种);若增菌液或有挑取的典型或可疑菌落 PCR 扩增结果为阳性且 GB 4789.29 确证符合者，报告检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)。

　　11 防止交叉污染措施和生物安全措施

　　11.1 防止交叉污染措施

　　检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403—2008 附录 D 中的规定执行。

　　11.2 生物安全措施

　　为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行操作，所有培养物和废弃物按照 GB 19489的有关规定执行。

　　6

　　SN/T 5888—2025

　　附 录 A (资料性)

　　扩增片段序列

　　唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)扩增片段序列(GenBank：JX173632.1)如下：

　　TACCACCGAGCAGTTCATGGAATACAGCCGCGACAGGTTCCAGTGCCATTACGTGCC GCAGGATGCCTGGCCGAAGCTGCTGAAGGATGCCGGTTTCGAGCTGGTGGAGATCCAGG ACATCACCGCGAACGTGATGCCGTGGCTGGTGCCCAAGCTCAAGGAGGCCTTCGAGGCGC ACAAGCAGGAGATACGGACCATCGCGCCGCAAGCCGACGAGACCTTCAT

　　7