GB/T 33121-2016 玉米褐条霜霉病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33121—2016

　　玉米褐条霜霉病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofSclerophthorarayssiae Kenneth,

　　Kaltin etWahlvar. zeae Payak etRenfro

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33121—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、中华人民共和国中山出入境检验检疫局 、中华人民共和国福清出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :王宏毅 、陈定虎 、黄智辉 、林谷圆 、郑万里 、黄蓬英 、方志鹏 、林石明 、严进 。

　　玉米褐条霜霉病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了玉米褐条霜霉病菌(Sclerophthorarayssiae Kenneth,Kaltin etWahlvar.zeae Payak etRenfro)的形态学检疫鉴定方法 , 明确了样品现场采集 、实验室鉴定 、标本制作和样品保存等方法 。

　　本标准适用于玉米(Zea mays)植株及其谷物中的玉米褐条霜霉病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 18085—2000 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法

　　GB/T 18086—2000 植物检疫 烟霜霉病菌检疫鉴定方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　孢子囊 sporangium

　　孢囊梗顶端膨大 ,并在下方生出横隔与菌丝分开形成囊状结构的无性繁殖器官 。

　　注 1: 成熟后易脱落 ,并在囊内形成游动孢子 。

　　注 2: 孢子囊的英文复数形式为“sporangia”。

　　3.2

　　孢囊梗 sporangiophore

　　支持孢子囊的菌丝分枝 。

　　3.3

　　藏卵器和雄器 oogonium& antheridium

　　生殖菌丝生出两个大小不同的异形配子囊 ,大的为雌配子囊 ,能在囊内形成一个雌配子(卵子) , 即为藏卵器 ;小的能产生雄配子 , 即为雄器 。

　　注 1: 玉米褐条霜霉病菌的藏卵器与雄器同体 。

　　注 2: 藏卵器与雄器的英文复数形式分别为“oogonia”“antheridia”。

　　3.4

　　卵孢子 oospore

　　藏卵器中的卵子与雄器的雄配子相配合后形成 。

　　4 病原菌基本信息

　　中文名 :玉米褐条霜霉病菌 ,又称褐条指疫霉菌玉蜀黍变种 。

　　GB/T 33121—2016

　　英文名 :Brown stripe downy mildew of corn,简称 BSDM。

　　学名 :Sclerophthorarayssiae Kenneth,Kaltin etWahlvar.zeae Payak etRenfro,1967。

　　分类地位 :藻菌界 Chromista,卵菌门 Oomycota,卵菌纲 Oomycetes,霜霉 目 Peronosporales,霜霉科 Peronosporaceae,指疫霉属 Sclerophthora Thirumalachar, Shaw & Narasimhan, 1953, 褐 条 指 疫 霉菌 Sclerophthorarayssiae Kenneth,Koltin etWahl,1964。

　　传播途径 :该病菌可以由被病原菌污染过的种子 ,或带病植株 , 以及混杂于货物中的病残体作远距离传播 。

　　玉米褐条霜霉病菌的其他信息参见附录 A。

　　5 方法原理

　　本标准主要以玉米褐条霜霉病菌的为害症状 ,病原菌的孢囊梗 、孢子囊和卵孢子形态特征为鉴定依据 。玉米褐条霜霉病菌的为害症状参见附录 B 和附录 C,病原菌的孢子囊和卵孢子形态特征见附录 D。

　　6 仪器设备和试剂

　　6. 1 仪器设备和器具

　　6. 1. 1 仪器设备

　　生物显微镜(配带 100倍油镜且最大观察倍数不低于 1 000 倍 , 配备图像采集系统和图像分析软件 ,或至少配带照相功能和镜台测微尺) 、体视显微镜(总放大倍数不低于 50倍) 、超净工作台 、振荡器 、高压灭菌锅 。

　　6. 1.2 器具

　　医用解剖刀 、解剖针 、眼 科 手 术 剪 刀 、胶 头 滴 管 、微 量 可 调 加 样 器 (2 μL~ 20 μL) 、枪 头 (2 μL~ 20 μL) 、滤筛(孔径为 0. 18 mm) 、烧杯(250mL) 、离心管(10 mL或 20 mL) 、三角瓶(500 mL) 、培养皿(直径为 150 mm~ 200 mm) 。

　　6.2 试剂和材料

　　6.2. 1 试剂

　　无菌水 、75%乙醇溶液 、吐温 20、10%氢氧化钠 、席尔氏缓冲液(配制方法按 GB/T 18085—2000执行)和 0. 05%苯胺蓝(棉蓝)乳酚油(配制方法按 GB/T 18086—2000执行) 。

　　6.2.2 材料

　　无菌滤纸 、铝箔纸 、Parafilm 膜 、载玻片和盖玻片 。

　　7 检疫和鉴定

　　7. 1 检疫

　　7. 1. 1 现场检疫

　　7. 1. 1. 1 植株症状检查

　　现场对玉米植株的检疫 ,要在光线充足处 ,仔细检查植株叶片是否带有可疑症状 ,参见附录 B 和附

　　录 C。

　　7. 1. 1.2 种子和原粮的检疫

　　现场对玉米种子和原粮的检疫 ,要在检疫的现场仔细检查种子或原粮中是否夹带有可疑症状叶片及其他病残体 ,参见附录 B 和附录 C。

　　7. 1.2 抽取样品

　　对于植株样品的扦取 ,主要按照 SN/T 1157执行 ;对于种子样品的扦取 , 主要按照 SN/T 2122执行 ;对于原粮样品的扦取 ,主要按照 SN/T 2504执行 。

　　7. 1.3 送检

　　将现场检疫获取的抽取样品,连同现场发现的病残体 ,送实验室作进一步的室内检疫及玉米褐条霜霉病病原鉴定 。

　　7.2 实验室病原菌观察、记录

　　7.2. 1 直接镜检

　　对于现场送检的带有可疑症状病叶或病残体 ,置于体视显微镜下观察 ,用解剖针挑取叶片病斑背面上的霉状物 ,放在加有 1 滴约 10μL席尔氏缓冲液的载玻片上 ,盖上盖玻片 ,先在显微镜下用 40倍物镜观察有无病菌的孢囊梗 、孢子囊 ,再用 100倍油镜记录其形态特征 ,测量其大小 ,并拍照留存 。

　　7.2.2 保湿培养

　　对于未带有可疑症状的病叶或病残体 ,用流水充分冲洗 ,用 75%乙醇溶液浸泡 1 min进行表面灭菌 ,无菌水冲洗 3 次 ,置于灭菌的培养皿(垫有充分吸取无菌水的三层无菌滤纸) 中 ,用 Parafilm 膜封 口后 ,置于 21 ℃培养箱中 ,在相对湿度 100%、黑暗条件下保湿培养过夜 ,诱发孢子囊产生后 ,按 7. 2. 1 方法镜检观察 、测量和病原鉴定 。

　　7.2.3 组织透明法检验卵孢子

　　对于病斑上霉状物稀少的老病叶 ,用眼科手术剪刀剪成约 10 mm×10 mm ,置于小烧杯中 ,加适量10%氢氧化钾溶液,煮沸 5 min~ 10 min至叶组织透明 ,平整放入用胶头滴管加上 1 滴 0. 05%苯胺蓝(棉蓝)乳酚油作浮载剂的载玻片上 ,置于显微镜下 ,用 40倍物镜或 20倍物镜逐片观察有无卵孢子 。如发现有卵孢子 ,用 100倍油镜记录其形态特征 ,测量其大小 ,并拍照留存 。

　　7.2.4 洗涤检查

　　对于玉米种子和原粮 ,每份样品充分混匀后 , 随机取 100g置于 500mL三角瓶内 ,加入适量蒸馏水(约 150mL)浸软后 ,再用胶头滴管加入 1滴 ~ 2滴吐温 20,用铝箔纸将三角瓶口封住 ,用振荡器激烈振荡 5 min,将洗涤液经滤筛过滤到烧杯后 ,倒进离心管 , 以转速 1000 r/min离心 5 min,必要时可重复离心 1 次 ,将上层清液全部倒去 ,最后用胶头滴管加入数滴席尔氏缓冲液至沉淀液充分混匀 ,再用微量可调加样器吸取 15μL沉淀液置载玻片上 ,盖上盖玻片 ,按 7. 2. 1 方法镜检观察有无玉米褐条霜霉病菌的孢子囊 ,每份样品洗涤液至少检查 20个玻片 。在镜检时 ,如发现孢子囊干瘪变形 ,将镜检玻片封固后 ,连同沉淀液放置于 5 ℃的冰箱中过夜 ,等孢子囊形态恢复后 ,继续按 7. 2. 1方法镜检观察和测量 。

　　8 病原菌鉴定特征

　　玉米褐条霜霉病菌鉴定特征 :孢囊梗短小 ,小于 5 μm , 由气孔下的菌丝伸出 , 能形成 2 个 ~ 6 个孢子囊 ;孢子囊无色 , 卵 圆 至 圆 柱 形 , 顶 部 有 镜 片 状 孔 口 , 脱 落 , 有 一 小 柄 , 大 小 (29 μm ~ 66. 5 μm) × (18. 5 μm~ 26μm) ;孢子囊萌发时产生 4个 ~ 8个透明 、球形的游动孢子 ,直径 7. 5 μm~ 11 μm。藏卵器分散产生在叶肉中 ,近球形 ,壁薄 ,无色至淡黄色 ,直径 33 μm~44. 5 μm ,每个藏卵器附有 1 个 ~ 2 个侧生的雄器 ;卵孢子中等大小 ,球形至近球形 ,光滑而发亮 ,与藏卵器壁愈合 ,直径 29. 5 μm~ 37μm。

　　玉米褐条霜霉病菌形态特征图见附录 D。

　　9 结果判定

　　经实验室的进一步检疫和病原观察 、测量 ,如果检出的病原菌孢囊梗 、孢子囊和卵孢子形态特征与鉴定特征相符 ,则检出的病原菌可鉴定为玉米褐条霜霉病菌 ,样品判定为阳性样品 。

　　10 样品保存

　　10. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人 签 字 后 妥 善 保 存 。对 检 出 玉 米 褐 条 霜 霉 病 菌 的 种 子 或 原 粮 样 品,应 保 存 于4 ℃的冰箱中 ,或存放于具防虫 、防鼠 、防霉变和防污染的环境中真空密封保存 ,保存期约 6 个月 , 以备复核 ;另外 ,对检出病菌的玉米植株或病残体 ,要制作成干标本(制作方法参见附录 E) ,可长期保存 。

　　以上样品保存期满后 ,除少量有必要作长久保存的样品外 ,其余须经高压灭菌后方可作弃置处理 。

　　10.2 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法 、结果 、症状和病菌显微照片等 ,并有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　玉米褐条霜霉病菌的相关信息

　　A. 1 地理分布

　　主要分布在亚洲的印度大部分地区(北部的比哈尔邦 、北方邦 、德里 ,西部的古吉拉特邦 、拉贾斯坦邦 ,西北部的哈里亚纳邦 、喜马偕尔邦 、查谟和克什米尔 、旁遮普邦 , 西南部的卡纳塔克邦 , 中部的中央邦 ,东北部的梅加拉亚邦 , 东 南 部 安 得 拉 邦 , 东 部 的 西 孟 加 拉 邦 , 以 及 锡 金) 、巴 基 斯 坦 、尼 泊 尔 、缅 甸 、泰国 。

　　该病在我国无分布 ,但分布区与我国广泛接壤 。

　　A.2 寄主范围

　　玉米褐条霜霉病菌的主要寄主是玉米(Zea mays) ,该病菌也能危害马唐草(Digitaria sanguina- lis) 。

　　A.3 生物学和生态学

　　玉米褐条霜霉病是唯一一种诱发局部症状的玉米霜霉病 。病菌可以卵孢子的形态在土壤病残体中或在野生马唐草内越冬 ,在土壤病残中至少存活 3 年 ,抗逆性强 ;卵孢子在春季萌发产生孢子囊 ,并释放出游动孢子 ,成为主要的初浸染来源 ,游动孢子依靠风雨传播 ,玉米出苗后 1 个月左右最易感病 。孢子囊一般在 20 ℃ ~ 22 ℃产生 ,孢子囊的形成与侵染需要 12h~ 96h 的水膜 ,游动孢子萌发的温度范围为15 ℃ ~ 30 ℃ ,最适温度在 22 ℃ ~ 25 ℃;卵孢子则在较高的温度下形成 。土壤温度在 28 ℃ ~ 32 ℃时 ,该病害极易流行 。

　　病害发生与流行显著受降雨及温湿度影响 ,在受害最严重的印度 ,年雨量在 1 000 mm~ 2 000 mm地区发病最重 ,年雨量在 600 mm~ 1000 mm 地区中等发病 ,年雨量在 400 mm~ 600 mm 地区发病轻 。虽是一种局部侵染的病害 ,但该病在印度造成玉米生产轻者损失 20%以上 ,重者损失 70%以上 。

　　A.4 病原菌传播途径

　　该病菌可以由被病原菌污染过的种子 ,或带病植株 , 以及混杂于货物中的病残体作远距离传播 。

　　A.5 该病菌与其所在属其他种的关系

　　指疫霉属是因大孢指疫霉菌 , 即玉米疯顶病菌的无性阶段似疫霉 ,有性阶段似指梗霉 ,于 1953年由Thirumalachor、Shaw 和 Narasihan将 其 从 指 梗 霉 属(Sclerospora) 中 的 大 孢 指 梗 霉 菌(S. macrospore Saccardo,1890) 独 立 出 来 成 为 1 个 新 的 属 , 指 疫 霉 属(Sclerophthora) , 大 孢 指 疫 霉 菌[S. macrospore (Sacc) Thirumalachar,Shaw etNarasimsha,1953]亦成为该属的模式种 。 目前该属迄今已知 4 种 : 大孢指疫霉菌[S.macrospore (Sacc) Thirumalachar, Shaw et Narasimsha] 、喜冷指疫霉菌(S. cryophila Jones) 、黑麦草指疫霉菌(S. loliiKenneth)和褐条指疫霉菌(S.rayssiae Kenneth,Kaltin etWahl) ,均寄

　　生于禾本科(Gramineae)植物 ,引起霜霉病 。其中褐条指疫霉菌出现 2 个变种 ,Payak 等(1970) 认为褐条指疫霉菌原变种(S.rayssiae var.rayssiae Kenneth,Koltin etWahl,1964)不危害玉米 ,而褐条指疫霉菌玉蜀黍变种 , 即玉米褐条霜霉病菌(S.rayssiae Kenneth, Kaltin etWahl var.zeae Payak et Renfro, 1967)主要侵染玉米 。

　　该属分类检索表如下 :

　　孢子囊柠檬形

　　卵孢子大 ,直径 42 μm~ 75 μm ,多产生在维管束周围

　　孢子囊(60 μm~ 100 μm) × (43 μm~ 64μm) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … S.macruspora卵孢子中等 ,直径在 29. 5 μm~ 44μm 之间 ,分散产生在叶肉中

　　孢子囊(29μm~ 66. 5 μm) × (18. 5 μm~ 26μm) … … … … … … … … … … … … … … … S.rayssiae var.zeae

　　孢子囊(29μm~ 55 μm) × (19μm~ 28μm) … … … … … … … … … … … … … … … S.rayssiae var.rayssiae卵孢子小 ,直径 25 μm~ 29μm ,分散产生在叶肉中

　　孢子囊(41 μm~ 55 μm) × (25 μm~ 35 μm) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … S. lolii孢子囊倒梨形

　　卵孢子大小差异大 ,直径 20 μm~ 37. 5 μm ,分散产生在叶肉中

　　孢子囊(22. 5 μm~ 45. 5 μm) × (11. 5 μm~ 22. 5 μm) … … … … … … … … … … … … … … … … … S.cryophila

　　以上检索表中的前 两 种 : 大 孢 指 疫 霉 菌(S.macrospore) 和 褐 条 指 疫 霉 菌 玉 蜀 黍 变 种(S. rayssiae var.zeae) 主 要 侵 染 玉 米 , 后 3 种 菌 在 以 色 列 、英 国 、加 拿 大 、印 度 侵 染 大 麦 、黑 麦 草 、鸭 茅 等 , 不 侵 染玉米 。

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　玉米褐条霜霉病菌的为害症状

　　发病初期 ,植株叶片病斑狭长 ,颜色为黄色或褪绿色 ,长度不等 ,宽为 3 mm~ 7 mm。 随病情加重 ,受叶脉限制 ,病斑边缘明显 , 随后病斑变红紫色 ,使病叶似日灼状 。在空气相对湿度大时 ,病斑背面密布淡灰色霜霉状物 , 即病菌的孢囊梗与孢子囊 。苗期发病 ,植株因叶片受害造成矮缩 ,节间缩短 ,但病株不畸形 ,病苗受害严重时死亡 ,造成田间缺苗断垄 ;抽花时发病 ,会使籽粒发育受阻 ,种子不饱满 ,重者植株提前死亡 。

　　病菌为害症状照片见图 B. 1。

　　说明 :

　　A — 植株叶片症状 ;

　　B — 田间发病情况 。

　　图 B. 1 玉米褐条霜霉病菌为害症状(仿 CABICPC,2011)

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　玉米褐条霜霉病菌与玉米疯顶病菌(S.macrospore)的主要区别玉米褐条霜霉病菌与玉米疯顶病菌的主要区别见表 C. 1。

　　表 C. 1 玉米褐条霜霉病菌与玉米疯顶病菌的主要区别

　　说明 :

　　A — 玉米褐条霜霉病菌的为害症状 ;

　　B — 玉米疯顶病菌的为害症状 。

　　图 C. 1 玉米褐条霜霉病菌与玉米疯顶病菌在为害症状上的区别(仿 CABICPC,2011)

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　玉米褐条霜霉病菌的形态特征图

　　玉米褐条霜霉病菌的形态特征图见图 D. 1。

　　说明 :

　　A — 孢囊梗短小 ,正在从由气孔下的菌丝伸出(1bar= 10 μm) ;

　　B — 孢子囊正在从孢囊梗顶端形成(1bar= 10 μm) ;

　　C — 孢子囊形态(1bar= 10 μm) ;

　　D — 分散产生在叶片组织中的藏卵器(1bar= 30 μm) ;

　　E — 卵孢子形态(1bar= 30 μm) 。

　　图 D. 1 玉米褐条霜霉病菌形态特征(仿 CABICPC,2011)

　　附 录 E (资料性附录)干标本的制作

　　干标本采用分层叠压 ,用标本夹制作 。每层将染病的植株 、叶片或病残体 ,放在两层用于制作植物标本的专用吸水纸(每层厚 3 张 ~4 张)中间(不重叠) ,如有必要 ,用镊子纠正植株 、叶片或病残体在纸上的姿态 ;叠放整齐压在标本夹中 。每个标本夹的总厚度以不超过 4 cm 为宜 ,并根据温湿度情况 , 以保证标本不变色发霉为前提 ,及时更换标本纸 。可自然干燥 ,也可采用烘箱快速干燥 ;烘箱快速干燥时烘箱温度以控制在 45 ℃ ±3 ℃为宜 ,采用快速烘干法 ,换标本纸间隔时间应不超过 2 h。直到标本含水量在 20% ~ 30%为宜 。

　　干标本可置于垫有棉絮和樟脑丸的标本盒中进行保存 。

　　参 考 文 献

　　[1] 戴芳澜 . 中国真菌总汇[M] . 北京 :科学出版社 ,1979.

　　[2] 方中达 . 植物病害研究方法[M] . 北京 : 中国农业出版社 ,1998.

　　[3] 肖明纲 , 王 晓 鸣 . 玉 米 疯 顶 病 在 中 国 的 发 生 现 状 与 病 害 研 究 进 展[J] . 作 物 杂 志 , 2004, (5) : 41-44.

　　[4] 王宏毅 . 玉米褐条霜霉病及其检疫 . 2008年进出境植检学术研讨会论文集[C] . 151-153.

　　[5] 王圆 ,吴品珊 . 玉米霜霉病对我国农业生产的潜在威胁及检疫对策[J] . 植物检疫 , 1994,8(3) : 129-134.

　　[6] 王圆 ,吴品珊 , 陈克 ,等 . 指疫霉属及所引致的玉米霜霉病[J] . 植物检疫 ,1995,9(5) :285-288.

　　[7] 张中义 ,刘云龙 ,王英祥 ,等 . 中国指疫霉属 Sclerophthora分类研究[J] . 西南农业大学学报 , 1987,9(2) :154-158.

　　[8] CABI.Crop Protection Compendium. CAB International,2011.

　　[9] CMI.Distribution Maps ofPlantDiseases(Edition2) . CAB International,1991.

　　[10] DonaldG. W. Compendium ofCorn Diseases(Edition3) . APS Press,1980.

　　[11] McGee D. C. Maize Diseases.APS Press,1988.

　　[12] PayakM. M. ,RenfroB. L. ,Sangam Lal.Downy mildew diseasesincited byScletophthora. In- dian Phytopathology,1970,13:183-193.

　　[13] PupipatU. Host range, geographic distribution and physiologic races of the maize downy mildews.Trop. Agric.Res. Ser. ,1974,8:63-80.