GB/T 35535-2017 大豆、油菜中外源基因成分的测定 膜芯片法

　　ICS 07 . 080 A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35535—2017

　　大豆、油菜中外源基因成分的测定

　　膜芯片法

　　Detectionofgeneticallymodifiedcomponentsinsoybeanandcanola—

　　Membrane-basedgene-chipmethod

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35535—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心(黑龙江)、四川华汉三创生物科技有限公司、安徽省食品药品检验研究院、上海泽衡生物科技有限公司。

　　本标准主要起草人：彭丽萍、黄广平、姜雯、陈潇、王志强、曾莲、孔鲁裔、周均、郭尚、王海宽、谢长江、徐凤霞、李新利。

　　GB/T 35535—20 17

　　大豆、油菜中外源基因成分的测定

　　膜芯片法

　　1 范围

　　本标准规定了膜芯片法检测大豆、油菜中外源基因成分的防污染措施、抽样与制样、原理、试剂与标准品、仪器与设备、试验方法和流程、结果判断、确证实验、结果表述。

　　本标准适用于大豆、油菜中外源基因成分的定性检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 19495 . 1 转基因产品检测 通用要求和定义

　　GB/T 19495 . 2 转基因产品检测 实验室技术要求

　　GB/T 19495 . 3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

　　GB/T 19495 . 7 转基因产品检测 抽样和制样方法

　　SN/T 1204 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光 PCR定性检验方法

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　AminolinkerC6 : 6 个碳原子作为连接臂的氨基标记(C6 Amino linker)

　　BAR：草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetylatransferase gene)

　　BARNASE：来 源 于 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌(Bacillusamyloliquefaciens)的 编 码 核 糖 核 酸 酶 的 基 因(Bacillusamyloliquefaciensribonuclease gene)

　　BARSTAR：来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的编码核糖核酸酶抑制物的基因 (inhibitor of Bacillusamyloliquefaciensribonuclease gene)

　　CaMV35S-P：来自于花椰菜花叶病毒的 35S启动子(35S promoter from cauliflower mosaic virus)

　　CaMV35S-T：来 自 于 花 椰 菜 花 叶 病 毒 的 35S 终 止 子 ( 35S terminator from cauliflower mosaic

　　virus)

　　Cry1Ac：苏 云 金 芽 孢 杆 菌 杀 虫 毒 蛋 白 cry1A(c) 基 因[Bacillusthuringiensis Insecticidal toxin cry1A(c) gene]

　　dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)

　　dCTP：脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)

　　dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)

　　dTTP：脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)

　　GB/T 35535—20 17

　　dUTP：脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)

　　EPSPS:5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因 (5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene)

　　FMV35S-P：玄参花叶病毒 35S启动子(35S promoter from figwort mosaic virus)

　　GAT4601：草甘膦乙酰转移酶基因(glyphosate acetyltransferase gene)

　　GOX：草甘膦氧化还原酶基因(glyphosate oxidoreductase gene)

　　Lectin：凝集素基因(lectin gene)

　　NC：阴性对照(Negative control)

　　NOS-3′：胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of the nopaline synthase gene)

　　NPT-Ⅱ：新霉素-3-磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferase gene)

　　PAT：草丁膦乙酰 CoA转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)

　　PC：阳性对照(Positive control)

　　PEP：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(phosphoenolpyruvate carboxylase gene)

　　Taq：ThermusAquaticus DNA 聚合酶(ThermusAquaticus DNA polymerase)

　　UDG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶(Uracil N-glycocasylase)

　　4 防污染措施

　　检测过程中防止交叉污染的措施应按照 GB/T 19495 . 2 的规定执行。

　　5 抽样与制样

　　应符合 GB/T 19495 . 7 的相关规定。

　　6 原理

　　待检样品经 DNA模板提取和核酸定量，采用多重 PCR 扩增体系，扩增其中可能含有的转基因大豆、油菜中常见外源基因特异性扩增序列。 PCR扩增产物与固定有 目标外源基因特异性探针的膜芯片进行杂交后，检测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。

　　7 试剂与标准品

　　7 . 1 总则

　　除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 三级水的规定。

　　7 . 2 试剂组分

　　本标准中试剂组分和存放条件参见附录 A 和 7 . 3~7 . 5 的规定。

　　7 . 3 引物

　　大豆 PCR反应使用的引物序列应符合表 1 的规定、油菜 PCR 反应使用的引物序列应符合表 2 的规定。

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　　表 1 大豆 PCR反应使用的引物序列

　　表 2 油菜 PCR反应使用的引物序列

　　GB/T 35535—20 17

　　表 2(续)

　　7 . 4 探针

　　膜芯片表面包被的目标基因探针序列大豆应符合表 3 的规定、油菜应符合表 4 的规定。

　　表 3 大豆目标基因探针序列

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　　表 3(续)

　　表 4 油菜目标基因探针序列

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　　表 4(续)

　　7 . 5 其他试剂

　　7.5. 1 氢氧化钠(NaOH)。

　　7.5.2 氯化钠(NaCl)。

　　7.5.3 磷酸二氢钠(NaH2 PO4 · H2 O)。

　　7.5.4 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。

　　7 . 5 . 5 十二烷基磺酸钠(SDS) 。

　　7.5.6 碱性磷酸酶标记链霉亲和素 (AP-streptavidin) 。

　　7 . 5 . 7 碱性磷酸酶化学显色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰(NBT/BCIP) 。

　　7.5.8 多重 PCR 即用型预混液(Multiplex PCR Master Mix)。

　　7.5.9 多重 PCR 引物预混液(Multiplex PCR Primer Mix)：每条引物 2 μmol 。

　　7.5. 10 20×SSPE缓冲液：3 mol NaCl , 200 mmol NaH2 PO4 , 20 mmol EDTA, pH 7.4 。

　　7.5. 1 1 去活化液：100 mmol NaOH 。

　　7.5. 12 去活化清洗液：2 × SSPE,0.1 % SDS 。

　　7.5. 13 杂交液：2 × SSPE,0.1 % SDS 。

　　7.5. 14 杂交清洗液：2 × SSPE,0.5 % SDS 。

　　7.5. 15 酶孵育液：2 × SSPE,0.5 % SDS 。

　　7.5. 16 孵育清洗液 1 : 2 × SSPE,0.5 % SDS 。

　　7.5. 17 孵育清洗液 2 : 2 × SSPE 。

　　7.5. 18 底物显色液：碱性磷酸酶化学显色底物 NBT/BCIP,含 0.15 mg/mL BCIP, 0.30 mg/mL NBT, 100 mmol/L Tris-HCl , 5 mmol/L MgCl2 , pH 9.5。

　　7.5. 19 膜芯片耗材：尼龙膜，Biodyne C 型号，厚度 0.45 μm。

　　7 . 6 标准品

　　7.6. 1 A2704-12 转基因大豆标准品：包含 PAT, CaMV35S-P, CaMV35S-T转基因成分。

　　7 . 6 . 2 DP356043 转基因大豆标准品：包含 GAT4601 转基因成分。

　　7.6.3 GTS40-3-2 转基因大豆标准品：包含 EPSPS, CaMV35S-P, NOS-3′转基因成分。

　　7.6.4 MON87701 转基因大豆标准品：包含 Cry1Ac转基因成分。

　　7 . 6 . 5 MON89788 转基因大豆标准品：包含 EPSPS, FMV35S-P转基因成分。

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　　7 . 6 . 6 GT73/RT73 转基因油菜标准品：包含 EPSPS, GOX, FMV35S-P转基因成分。

　　7.6.7 Ms1 转基因油菜标准品：包含 NPT-II, BAR, BARNASE, NOS-3′转基因成分。

　　7.6.8 Rf2 转基因油菜标准品：包含 NPT-II, BAR, BARSTAR, NOS-3′转基因成分。

　　7.6.9 Topas 19/2 转基因油菜标准品：包含 PAT, NPT-II, CaMV35S-P, CaMV35S-T转基因成分。

　　7.6. 10 Non-Modified Soybean非转基因大豆标准品。

　　7.6. 1 1 Non-Modified Canola非转基因油菜标准品。

　　8 仪器与设备

　　8 . 1 基因扩增仪：升降温速度 >1 . 5 ℃/s,孔间温度差异<1 . 0 ℃ 。

　　8 . 2 核酸微量分光光度计。

　　8 . 3 纯水仪。

　　8 . 4 分析天平：准确到 0 . 001 g。

　　8.5 芯片识读仪：300 dpi。

　　8.6 台式离心机：转速 12 000 r/min。

　　8.7 分子杂交炉：37 ℃ ~60 ℃ , ±0.5 ℃。

　　8.8 芯片自动杂交仪：37 ℃ ~60 ℃ , ±0.5 ℃。

　　9 试验方法和流程

　　9 . 1 膜芯片法检测流程

　　膜芯片法检测流程参见附录 B。

　　9 . 2 样品

　　9 . 2 . 1 实验室样品代表性应符合 GB/T 19495 . 7 的规定。

　　9 . 2 . 2 标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照 GB/T 19495 . 1 的规定执行。

　　9 . 2 . 3 所有测试样品的制备操作应按照 GB/T 19495 . 2 的规定执行。

　　9 . 3 样品制备

　　9 . 3 . 1 DNA 的提取

　　样品中 DNA 的提取，应按照 GB/T 19495 . 3 中的规定执行，或采用同等功能的植物基因组 DNA提取试剂盒。 每个测试样品提取时应做两个提取重复。

　　9.3.2 PCR扩增

　　将 9 . 3 . 1 的核酸提取物加入到 PCR反应体系进行扩增。

　　9.3.3 PCR反应体系

　　按照表 5、表 6 配制 PCR 反应体系。 每次实验中，利用转基因大豆、油菜标准品的基因组 DNA 作为阳性质控，非转基因大豆、油菜标准品的基因组 DNA作为阴性质控，用缓冲液或水代替样品进行核酸提取作为空白质控，以对后续的 PCR扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控。

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　　表 5 PCR反应体系体积(50 μL)—大豆

　　表 6 PCR反应体系体积(50 μL)—油菜

　　9 . 3 . 4 PCR 反应循环参数

　　按照表 7 设计 PCR反应参数。

　　表 7 PCR反应参数

　　9 . 4 . 3 酶孵育体系

　　按照表 9 配制酶孵育体系液，使用时重新配制。

　　表 9 酶孵育体系

　　9 . 4 . 4 杂交，酶联及显色

　　9 . 4 . 4 . 1 杂交检测方式

　　本步骤有手动操作和自动杂交仪测定两种选择。

　　9 . 4 . 4 . 2 手动过程

　　将膜芯片置于杂交盒内，按表 10 进行手动杂交。 杂交过程在分子杂交炉中进行，类似仪器应满足实验要求。

　　表 10 膜芯片手动杂交过程

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　　表 10(续)

　　9 . 4 . 4 . 3 自动杂交仪测定过程

　　按芯片自动杂交仪操作说明书进行开机，预热，之后将包装有膜芯片的杂交盒放入自动杂交仪中开始杂交过程，依次自动完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤，自动完成杂交过程。

　　具体过程如表 11 所示。

　　表 1 1 自动杂交仪测定过程

　　9 . 5 膜芯片结果判读

　　9 . 5 . 1 目测判读

　　显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果。 阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点。 如果杂交点部位没有显色，和膜芯片背景相同，则判读为阴性杂交信号。

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　　9 . 5 . 2 膜芯片识读仪判读

　　膜芯片显色后，使用芯片识读仪进行扫描分析。 如果杂交点部位显色，则判读为阳性杂交信号。 如果杂交点部位没有显色，和膜芯片背景相同，则判读为阴性杂交信号。

　　10 结果判断

　　10 . 1 质量控制

　　10 . 1 . 1 质量控制原则

　　实验中设置 10 . 1 . 2~10 . 1 . 4 所述的质控对照，其膜芯片杂交检测结果应符合相应情况。 如果出现非 10 . 1 . 2~10 . 1 . 4 中所述的杂交结果，则应判断实验不成功，需重做实验。

　　10 . 1 . 2 核酸提取空白对照和多重 PCR扩增试剂空白对照

　　膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性，外源基因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳性，阴性对照探针点杂交信号阴性。

　　10 . 1 . 3 非转基因标准品对照

　　膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性，外源基因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳性，阴性对照探针点杂交信号阴性。

　　10 . 1 . 4 转基因标准品对照

　　膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性，外源基因探针点杂交信号阳性，阳性对照探针点杂交信号阳性，阴性对照探针点杂交信号阴性。

　　10 . 2 结果判断

　　10 . 2 . 1 样本检测结果中阳性对照探针点杂交信号阴性，可初步判读膜芯片杂交过程不成功，应确认各杂交试剂是否过期或保存条件不当，更换可疑试剂后重新实验。

　　10 . 2 . 2 样本检测结果中阴对照探针点杂交信号阳性，可初步判读膜芯片杂交过程不成功，应确认各杂交试剂是否过期或保存条件不当，更换可疑试剂后重新实验。

　　10 . 2 . 3 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阴性，表明未能从样本中提取出适宜多重 PCR 扩增的核酸模板，需要重新进行样本核酸提取和多重 PCR扩增。

　　10 . 2 . 4 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性，外源基因探针点杂交信号阴性，表明样本核酸提取、多重 PCR扩增和膜芯片杂交过程正常，判断样本中未检出转基因成分。

　　10 . 2 . 5 样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性，各外源基因探针点杂交信号部分或全部阳性，表明样本核酸提取、多重 PCR扩增和膜芯片杂交过程正常，判读样本中存在阳性信号点对应的转基因成分。

　　1 1 确证实验

　　转基因成分膜芯片检测阳性样本可进一步进行确证实验，确证实验方法按照 SN/T 1204 中规定的方法执行。

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　　12 结果表述

　　12 . 1 未检出

　　在阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点检测结果正常的情况下，未检出本标准所包含的外源基因成分。

　　12 . 2 检出

　　检出× × × ×基因，阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　膜芯片法试剂组分和存放条件

　　膜芯片法试剂组分和存放条件参见表 A. 1 。

　　表 A.1 膜芯片法试剂组分和存放条件

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　膜芯片法检测流程

　　膜芯片法检测按照图 B. 1 流程进行。

　　图 B.1 膜芯片法检测流程

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　膜芯片制作与质量控制

　　C.1 膜芯片制作

　　采用微定量喷点式膜芯片点样仪，将各个核苷酸探针(探针终浓度 25 μmol/L)分布在带负电荷尼龙膜芯片上的特定位置区域。 芯片表面包被的探针布局如图 C. 1、图 C. 2 。

　　杂交阳性对照：PC,监测芯片杂交过程是否正常。

　　大豆内对照：Lectin,膜芯片上用来质控 PCR扩增过程是否正常的对照，使用大豆特异性内源基因Lectin扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针。

　　油菜内对照：PEP,膜芯片上用来质控 PCR 扩增过程是否正常的对照，使用油菜特异性内源基因PEP扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针。

　　阴性对照：NC,膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照。 一般使用一段与靶标分子序列相近或无关的寡核苷酸作为探针。

　　图 C.1 大豆芯片探针布局

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　　图 C.2 油菜芯片探针布局

　　C.2 膜芯片的质量控制

　　膜芯片点样后扫描无漏点、连点，位点规则，大小均匀一致，点与点的距离为 300 μm~500 μm;杂交后阳性质控实验杂交信号清晰可见。