GB/T 35534-2017 胰酪蛋白胨检测方法

　　ICS 07 . 080 G 66

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35534—2017

　　胰酪蛋白陈检测方法

　　Examinationmethodsofpancreaticdigestofcasein

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35534—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本标准起草单位：北京牛牛基因技术有限公司、中国食品药品检定研究院。

　　本标准主要起草人：胡昌勤、牛刚、苏德模、马仕洪、杨美琴、伍业旭、葛秋蕙。

　　GB/T 35534—20 17

　　胰酪蛋白陈检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了胰酪蛋白陈作为培养基原料的质量检测方法。

　　本标准适用于药品、食品、化妆品或其他类别微生物检验用培养基中胰酪蛋白陈的质量检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 4789 . 28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求

　　GB 5009 . 3 食品安全国家标准 食品中水分的测定

　　GB 5009 . 4 食品安全国家标准 食品中灰分的测定

　　GB 5009 . 11—2014 食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定

　　GB 5009 . 12 食品安全国家标准 食品中铅的测定

　　GB 5009 . 15 食品安全国家标准 食品中镉的测定

　　GB 5009 . 17 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定

　　GB 5009 . 44—2016 食品安全国家标准 食品中氯化物的测定

　　GB 5009 . 124 食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 23530 酵母抽提物

　　中华人民共和国药典 2015 年版四部澄清度检查法(通则 0902)

　　中华人民共和国药典 2015 年版四部氮测定法(通则 0704)

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　胰酪蛋白陈 pancreaticdigestofcasein

　　用酪蛋白经胰酶水解、中和、过滤、浓缩精制而成的粉末。 常用名：胰酪陈、胰酶水解酪蛋白等。

　　3.2

　　酪蛋白 casein

　　哺乳动物奶中的主要蛋白质。 用于制造培养基用胰酪蛋白陈的酪蛋白主要通过牛奶脱脂后加酸或粗制凝乳酶的作用，形成的凝固沉淀物制得。 又称：干酪素、酪阮、乳酪素、奶酪素等。

　　3.3

　　耐热菌数 countofheatresistantmicroorganisms

　　胰酪蛋白陈中存在的具有热抗性的微生物，主要为耐热芽孢菌。 胰酪蛋白陈耐热菌数为 10%胰酪蛋白陈溶液在沸水浴中处理 30 min 后，经胰酪大豆陈琼脂(TSA) 平板计数得到的菌落数，以 CFU/g表示。

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　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CFU：菌落形成单位(colony forming units)

　　TSA：胰酪大豆陈琼脂培养基(soybean-casein digest agar)

　　TSB：胰酪大豆陈液体培养基(soybean-casein digest broth)

　　5 标准菌株

　　铜绿假单胞菌(pseudomonasaerginosa)[CMCC(B)10104]

　　金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)[CMCC(B) 26003]

　　藤黄微球菌(Micrococcusluteus)[CMCC(B) 28001]

　　枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)[CMCC(B) 63501]

　　乙型副伤寒沙门菌(salmonellaparatyphiB)[CMCC(B)50094]

　　白色念珠菌(candidaalbicans)[CMCC(F) 98001]

　　6 试剂配制

　　6 . 1 总则

　　除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，在未特别注明时，按照 GB 4789 . 28 规定执行。 水应符合 GB/T 6682 中三级水的规定。 未注明何种溶液配制时，均指水溶液。 未注明何种条件下灭菌时，均

　　指 121 ℃、15 min高压灭菌。

　　6 . 2 0 . 5%磷酸氢二钾

　　称取 5 g K2 HPO4 加水定容至 1 000 mL。

　　6 . 3 1 mol/L 氢氧化钠

　　称取 40 g NaOH 加水定容至 1 000 mL。

　　6 . 4 0 . 9%灭菌氯化钠溶液

　　称取 9 g NaCl加水定容至 1 000 mL,灭菌后备用。

　　6 . 5 1 mol/L 氢氧化钾

　　称取 56 g氢氧化钾加水定容至 1 000 mL。

　　6 . 6 1 mol/L 盐酸

　　取浓盐酸约 90 mL,加水适量使成 1 000 mL,摇匀备用。

　　6 . 7 TSA

　　胰酪蛋白陈 15 g, 大豆陈 5 g,氯化钠 5 g,琼脂 15 g,水 1 000 mL。

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　　6 . 8 TSB

　　胰酪蛋白陈 17 g, 大豆陈 3 g,氯化钠 5 g, 葡萄糖 2 . 5 g,磷酸氢二钾(钠)2 . 5 g,水 1 000 mL。

　　7 检测方法

　　7 . 1 外观

　　取样品适量，置明亮处，自然光下肉眼观察性状和色泽。

　　7 . 2 理化指标

　　7.2. 1 PH

　　配制 2%水溶液，采用玻璃电极测定灭菌后的 pH 值 。 同一样品两次测定值之差应不超过 0 . 04 。

　　7 . 2 . 2 水分

　　按照 GB 5009 . 3 规定执行。

　　7 . 2 . 3 灰分

　　按照 GB 5009 . 4 规定执行。

　　7 . 2 . 4 澄清度

　　取样品适量，制备 2%水溶液，灭菌后放置至室温，按照《 中华人民共和国药典》2015 年版四部澄清度检查法(通则 0902)第一法(目视法)执行。

　　7 . 2 . 5 磷酸盐沉淀

　　取样品适量，以 0 . 5%磷酸氢二钾(0 . 03 mol/L) 溶液制备成 2%溶液，如需要，调节 pH7 . 5 ± 0 . 1 , 121 ℃ 高压灭菌 30 min后，置 20 ℃ ± 10 ℃冷却，冷却后平衡 30 min观察是否有沉淀。

　　7 . 2 . 6 碱性沉淀

　　取样品适量，配制成 2%水溶液，以 1 mol/ L 氢氧化钠溶液调节 pH8 . 5 ± 0 . 5 , 121 ℃高压灭菌30 min,置 20 ℃ ± 10 ℃冷却，冷却后平衡 30 min观察是否有沉淀。

　　7 . 2 . 7 氯化钠

　　按照 GB 5009 . 44—2016 中第一法“电位滴定法”规定执行。

　　7 . 2 . 8 总氮

　　按照《中华人民共和国药典》2015 年版四部氮测定法(通则 0704)规定的方法执行。

　　7 . 2 . 9 氨基酸态氮

　　按照 GB/T 23530 规定的方法执行。

　　7 . 2 . 10 总游离氨基酸

　　按照 GB 5009 . 124 的规定执行，取消水解步骤，样品称取后直接用 pH 2 . 2 的缓冲液 1 mL溶解后供

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　　测试用。 分别测量各单个氨基酸后含量加和为总游离氨基酸。

　　7 . 2 . 1 1 总水解氨基酸

　　按照 GB 5009 . 124 的规定执行。 分别测量各单个氨基酸后含量加和为总水解氨基酸。

　　7 . 3 卫生指标

　　7 . 3 . 1 总砷

　　按照 GB 5009 . 11—2014 规定的第一法执行。

　　7 . 3 . 2 铅

　　按照 GB 5009 . 12 规定执行。

　　7 . 3 . 3 汞

　　按照 GB 5009 . 17 规定执行。

　　7 . 3 . 4 镉

　　按照 GB 5009 . 15 规定执行。

　　7 . 4 微生物指标

　　7 . 4 . 1 耐热菌数

　　7 . 4 . 1 . 1 供试液制备

　　取样品(待测胰酪蛋白陈)10 g,加 0 . 9%灭菌氯化钠溶液至 100 mL,摇匀，制成 1 ∶ 10 供试液，置沸水浴处理 30 min,冷却。

　　7 . 4 . 1 . 2 接种培养

　　取 7 . 4 . 1 . 1 中 1 ∶ 10 供试液 1 mL至无菌平皿，倾注灭菌 TSA 约 20 mL,摇匀，每一供试液稀释级至少平行制备 2 个 TSA平板，凝固后倒置于 33 ℃ ±2 ℃培养 48 h。

　　7 . 4 . 1 . 3 菌落计数

　　点计 7 . 4 . 1 . 2 培养后 TSA平板上的菌落数(CFU),以同一稀释级 TSA平板菌落数的平均值乘以稀释倍数报告样品中的耐热菌数结果。 若 TSA平板无菌落，结果以<10 CFU/g计。

　　7 . 4 . 2 细菌色素生成能力

　　7 . 4 . 2 . 1 待测平板制备

　　取样品(待测胰酪蛋白陈)20 g,氯化钠 5 g,琼脂 15 g,水 1 000 mL,混匀，必要时，用 1 mol/L氢氧化钾或 1 mol/ L 盐酸调节 pH7 . 0±0 . 5,灭菌后室温放置至约 45 ℃ ,约 20 mL/皿倾注无菌平皿，冷却，制成待测平板。

　　7 . 4 . 2 . 2 对照平板制备

　　配制胰酪大豆陈琼脂培养基，灭菌后室温放置至约 45 ℃ ,约 20 mL/皿倾注无菌平皿，冷却，制成对照平板。

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　　7 . 4 . 2 . 3 工作菌悬液制备

　　分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌至 TSB培养管，置 33 ℃ ±2 ℃培养 22 h±2 h后，以 0 . 9%灭菌氯化钠溶液 10 倍倍比稀释制成系列浓度的菌悬液。

　　分别取各稀释级菌悬液 1 mL至无菌平皿，随后参照 7 . 4 . 1 . 2、7 . 4 . 1 . 3 步骤操作，计数确定各稀释级菌悬液中的菌数。

　　选取系列菌悬液中计数为 10 3 CFU/mL稀释级的菌悬液作为工作菌悬液。

　　7 . 4 . 2 . 4 接种培养

　　分别取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的工作菌悬液适量(不超过 0 . 2 mL/皿)，同法涂布 7 . 4 . 2 . 1 中待测平板和 7 . 4 . 2 . 2 中对照平板，每种平板至少平行涂布 3 个 。

　　33 ℃ ±2 ℃倒置培养 36 h±12 h,培养期间观察各平板上的色素产生时间。

　　7 . 4 . 2 . 5 结果观察

　　36 h±12 h 内，参照对照平板，观测接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的待测平板上是否出现明显色素。 规定时间内，若对照平板未见色素表明检测体系有偏差，应重新检测。

　　7 . 4 . 3 促生长能力

　　7 . 4 . 3 . 1 待测培养管制备

　　取样品(待测胰酪蛋白陈)适量，制备 2%水溶液，必要时用 1 mol/ L 氢氧化钾或 1 mol/L盐酸调节pH7 . 0±0 . 5,灭菌后无菌分装成 10 mL/管( 中试管)，或 200 μL/孔 (96 孔酶标板)，作为待测培养管。

　　7 . 4 . 3 . 2 对照培养管制备

　　配制胰酪大豆陈液体培养基，灭菌后无菌分装成 10 mL/管，或 200 μL/孔，作为对照培养管。

　　7 . 4 . 3 . 3 工作菌悬液制备

　　按照 7 . 4 . 2 . 3 方法制备藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌系列菌悬液。

　　按照 7 . 4 . 2 . 3 方法计数确定各菌悬液中的菌数。

　　选取各菌株菌悬液中菌数在 10 CFU/mL~100 CFU/mL范围内的稀释级，以及再经 0 . 9%灭菌氯化钠溶液 10 倍倍比连续稀释 2 级的稀释级，分别作为 10 2 CFU/ mL、10 1 CFU/ mL、1 CFU/ mL 3 个稀

　　释级的工作菌悬液。

　　7 . 4 . 3 . 4 接种培养

　　分别取 7 . 4 . 3 . 3 中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌 10 2 CFU/ mL、 10 1 CFU/ mL、1 CFU/ mL 3 个稀释级的工作菌悬液各 1 mL,分别接种至 7 . 4 . 3 . 1 待测培养管(中试管，

　　10 mL/管)和 7 . 4 . 3 . 2 对照培养管(中试管，10 mL/管)。每一稀释级工作菌悬液平行接种每一种培养管均不少于 3 管 。

　　若采用 96 孔酶标板进行实验，上述工作菌悬液应依次上推一个稀释级，即采用相应 10 3 CFU/ mL、 102 CFU/ mL、10 1 CFU/ mL 3 个稀释级的工作菌悬液，每孔分别接入各稀释级工作菌悬液 20 μL,每稀释级工作菌悬液平行接种不少于 6 孔 。

　　各培养管(孔)置 33 ℃ ± 2 ℃培养 36 h± 12 h, 观察记录待测培养管和对照培养管阳性生长管(孔)数。

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　　7 . 4 . 3 . 5 结果观察

　　在相同观察时间点分别累计每一菌株待测培养管和对照培养管的阳性生长管(孔)数，按式(1)分别计算待测培养管对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌的促生长能力：

　　犜

　　犛

　　× 100% …………………………( 1 )

　　式中：

　　犚 — 促生长能力;

　　犜 — 待测培养管阳性生长管(孔)数;

　　犛 — 对照培养管阳性生长管(孔)数。