GB/T 35517-2017 化学品 鱼类生殖毒性短期试验方法

　　ICS 13 . 300 ; 13 . 020 . 40 A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35517—2017

　　化学品 鱼类生殖毒性短期试验方法

　　Chemicals—Fishshortterm reproductiontoxicityassay

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35517—20 17

　　GB/T 35517—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准技术内容与经济合作与发展组织 (Organization for Economic Cooperation and Development,

　　OECD) 测试导则 229(2012 年)《鱼类短期生殖毒性测试(2012)》(英文版)技术内容一致。

　　本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC 251)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国合格评定国家认可中心、宁波出入境检验检疫局、广东省微生物分析检测中心、中国化工经济技术发展中心、上海市检测中心。

　　本标准主要起草人：程艳、崔媛、唐伟、孙运、陈会明、李海山、谢文平、曹梦然、殷浩文、张京佶、曾国驱、梅承芳。

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　　引 言

　　本试验方法描述了一种体内筛选试验方法，将性成熟的雄鱼和处于产卵期的雌鱼一起暴露于化学品中 21 d。在 21 d暴露期结束时，对雄鱼和雌鱼的生物标志物终点进行测定，作为测试化学物质内分泌活性指标。 这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性特征对黑头呆鱼、日本青鳍和斑马鱼可进行卵黄蛋白原测定，而第二性征只能在黑头呆鱼和 日本青鳍上测定。 在整个测试过程中每天都要监测繁殖力;保留性腺，可通过病理组织学来评估测试动物的生殖健康，也为其他测试终点提供更有力的证据。

　　卵黄蛋白原通常受循环的内源性雌激素的刺激，由雌性卵生脊椎动物的肝脏产生。 卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前体，一旦在肝脏中产生，由血流进入卵巢，被发育中的卵吸收并修饰。 卵黄蛋白原在未成熟的雌鱼和雄鱼的血浆中几乎检测不到，因为它们缺乏足够的循环雌激素，但在受外源性的雌激素的刺激下，肝脏能够合成并分泌卵黄蛋白原。

　　卵黄蛋白原的测定能够检测不同雌激素作用模式的化学品，对雌激素类化学品的检测，有可能通过测量雄鱼的卵黄蛋白原的产生。 在雌性体内的雌激素循环水平的降低，例如通过抑制转化内源性雄激素为天然雌激素 17β-雌二醇的芳香酶，会引起卵黄蛋白原水平的降低，这一点被用来检测具有芳香酶抑制性质的化学品。

　　采用已建立标准化的常规检测方法。 采用免疫化学的物种特异性的酶联免疫吸收分析(ELISA) 方法，收集黑头呆鱼的血液、斑马鱼的血液或头/尾的匀浆以及青鳍的肝脏，作为 VTG 测定的样品。 对于青鳍，在血液中测量的 VTG 与肝脏中所测具有良好的相关性。 附录 A 提供了对于卵黄蛋白原分析的样品收集的推荐程序。 卵黄蛋白原可采用不同的试验方法，但都得基于验证的物种特异性 ELISA方法。

　　特定物种雄鱼的第二性征是可观察的，与内源性雄激素循环水平呈定量响应性，这些特性在黑头呆鱼和青鳍上能体现，但斑马鱼没有体现，因为斑马鱼不具备可定量的第二性征。

　　对于黑头呆鱼，外源受试物暴露的主要指标是位于雌鱼唇部珠星的数量。 对于青鳍，乳突物的数目组成了雌鱼的外源性暴露于雄激素受试物的主要标志物。 附录 B 分别说明了对于黑头呆鱼和青鳍的性特征评价的过程。

　　为期 21 d 的鱼类测试包括定量产卵量和性腺组织病理学检测。 试验中可能会需要额外的终点对受试生物生殖健康进行更完整的评估，或者防止卵黄蛋白原和第二性征对化学品暴露没有响应。 虽然某些终点是可得出明确结论(例如雄性诱导形成卵黄蛋白原、雌性诱导形成珠星)，但并不是测试的所有终点(例如生殖力和性腺组织病理学)直接表明毒性作用机制。 另外，对于某些终点，可通过内分泌干扰来推测。 虽然不是特定的内分泌作用，但由于对内分泌干扰活性物质表现出敏感性，所以生殖力是可考虑的重要终点。 因为当它和其他终点不受影响时，能够更加确定的是此化合物很可能不具有内分泌干扰活性。 而当生殖力受到影响，会对推论提供强有力的证据。 本测试提供了进一步进行数据结果解释和测试结果可接受性的指导。

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　　化学品 鱼类生殖毒性短期试验方法

　　1 范围

　　本标准规定了化学品鱼类生殖毒性短期试验方法的方法概述、质量保证与质量控制、仪器设备、试验准备、试验程序、试验过程、数据和报告。

　　本标准适用于化学品鱼类生殖毒性试验。

　　2 术语、定义和缩略语

　　2 . 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　2 . 1 . 1

　　承载率 loadingrate

　　单位体积水中鱼的湿重。

　　2.1.2

　　承载密度 stockingdensity

　　单位体积水中鱼的数目。

　　2.1.3

　　卵黄蛋白原 vitellogenin;VTG

　　一种磷脂糖蛋白，蛋黄蛋白的前体，一般出现于所有卵生动物的性成熟雌性个体。

　　2.1.4

　　最大耐受浓度 maximum toleratedconcentration;MTC

　　受试物引起小于 10%死亡率的最高试验浓度。

　　2 . 2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CV：变异系数 (coefficient of variation)

　　ELISA：酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)

　　HPG轴：下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis)

　　3 方法概述

　　将处于繁殖期的雌鱼和雄鱼共同暴露于受试物中。 根据所选受试鱼物种对其相关生物标志物终点指标进行测定。 其中性特征可在解剖后目测确认，其他生物测试指标参见附录 C。 设置 3 个受试物浓度以及一个空白对照，必要时可采用溶剂对照。 对于青鳍和斑马鱼，每个受试浓度至少有 2 个试验容器(每个试验容器中包括 5 尾雄鱼和 5 尾雌鱼);对于黑头呆鱼，每个受试浓度至少有 4 个试验容器(每个试验容器中包括 2 尾雄鱼和 4 尾雌鱼)。暴露进行 21 d,在第 21 天暴露时对鱼进行取样。

　　在第 21 天取样时，所有动物处以安乐死。 对于黑头呆鱼和青鳍进行第二性征检测，参见附录 B;取斑马鱼和黑头呆鱼血液样本，或者取斑马鱼的头/尾组织匀浆样本检测卵黄蛋白原，参见附录 A;对于青鳍，收集肝脏检测卵黄蛋白原(参见附录 A),解剖后将性腺整体固定用作病理学评估。

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　　4 质量保证与质量控制

　　质量保证与质量控制要求如下：

　　a) 试验结束时对照的死亡率不超过 10% ;

　　b ) 试验期间溶解氧浓度不低于空气饱和值(ASV)的 60% ;

　　c) 试验期间各试验容器间的水温不超过± 1 . 5 ℃ ,并应保持在受试生物适宜温度的± 2 ℃范围内，参见附录 C ;

　　d) 受试物浓度在配制浓度的 ±20%之内。

　　5 仪器设备

　　所需仪器设备如下：

　　a) 溶氧仪和 pH 计 ;

　　b ) 水硬度计和碱度计;

　　c) 温度控制及连续测温的设备;

　　d) 用化学惰性材料制成的试验容器，参见附录 C ;

　　e) 斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基质，参见附录 D 中的图 D. 1 和图 D. 2 ;

　　f) 适宜的精密天平(至少精确到±0 . 5 mg) 。

　　6 试验准备

　　6 . 1 试验用水

　　6 . 1 . 1 水质

　　试验用水应保证试验用鱼的存活和生长。 试验期间水质保持恒定。 试验用水的 pH 值在 6 . 5~8 . 5之间，变化保持在 ±0 . 5 的范围内。 定期分析水样，测定重金属(如 Cu、Pb、Zn、Hg、Cd 和 Ni) ,主要的

　　阴、阳离子(如 Ca2+ 、Mg2+ 、Na+ 、K+ 、Cl- 和 SO- )、农药(如总有机磷和有机氯农药)和总有机碳和悬

　　浮物。 合格稀释水可参见附录 E 中的表 E. 1 。

　　6 . 1 . 2 试验溶液

　　通过稀释贮备液的方法来配制所确定浓度的试液。 贮备液的配制推荐采用机械方式(例如搅拌或超声)使受试物在稀释水中进行简单的混合或搅动。 饱和度(溶解度)可用来获得适当浓度的贮备液。不推荐使用助溶剂或分散剂，但需使用时应设置溶剂对照。 对于难溶物，推荐使用溶剂[22] 。溶剂的选择由物质的化学性质决定。 建议溶剂最高浓度为 100 μL/L。

　　流水式试验需具备连续分配和稀释受试物贮备液的系统。 定期检查贮备液和稀释水的流速，试验期间的变化不大于 10%。

　　6 . 2 鱼的驯养

　　6 . 2 . 1 试验鱼应来自单一种群，并来 自 同一批卵或幼鱼。 试验前应与试验相同的条件下驯养 14 d 以上 。相关试验条件参见附录 C。

　　6 . 2 . 2 经过 48 h 的适应期，根据下列标准记录死亡率：

　　a) 7 d 内死亡率小于 5%,可用于试验;

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　　b ) 7 d 内死亡率在 5%~10%,继续驯养 7 d,如果死亡不再发生，该批试验鱼可用于试验;

　　c) 7 d 内死亡率大于 10%,舍弃整组鱼。

　　试验开始前的两周内及试验期间不对鱼进行任何疾病处理。

　　6 . 3 预暴露和鱼的选择

　　推荐采用 7 d 的预暴露期，并采用与正式试验相同的容器。 在整个驯养和暴露期间，鱼适量投喂。在受试鱼产卵活跃时开始暴露：黑头呆鱼在 25 ℃ ±2 ℃条件下进行培养，应为 20( ±2)周龄;日本青鳍在 25 ℃ ±2 ℃条件下进行培养，应为 16(±2)周龄;斑马鱼在 26 ℃ ±2 ℃条件下进行培养，应为 16 ( ±2)周龄。

　　7 试验程序

　　7 . 1 -般说明

　　试验设计 3 个受试物浓度，1 个对照以及 1 个溶剂对照(如必要)。对试验组和对照组进行数据分析，以确定是否具有统计学显著性差异。

　　对于斑马鱼和青鳍，在试验的第 21 天，每个浓度组和对照组中取样(2 个平行样，每个平行样 5 尾雄性和 5 尾雌鱼)测试卵黄蛋白原以及第二性征。 对于黑头呆鱼，在暴露的第 21 天，每个浓度组和对照组中取样(4 个平行样，每个平行样 2 尾雄性和 4 尾雌鱼)测试卵黄蛋白原和第二性征。

　　将性腺组织固定待病理组织学检测，来进行生殖力的评估。

　　7 . 2 试验浓度的选择

　　针对试验目的，最高试验浓度应由 MTC决定。 使用这种方法的前提是已有急性致死数据或其他毒性数据可以用来估算 MTC。

　　设置 3 个浓度组，浓度间隔系数不超过 10,稀释水作为空白对照组(必要时采用溶剂对照)。 推荐浓度间隔系数在 3 . 2~10 之间。

　　应尽量避免使用助溶剂，如必须使用，其在所有试验容器中的浓度不能超过 100 μL/L。

　　8 试验过程

　　8 . 1 受试鱼的选择与称重

　　试验开始时保持试验鱼的重量差异小。 推荐试验用鱼的大小范围参见附录 C。 试验用鱼的个体体重应在平均体重的 ±20%内。 试验前取部分鱼样品称量以测定平均体重。

　　8 . 2 暴露条件

　　8 . 2 . 1 时间

　　在预暴露之后，试验时间为 21 d。

　　8 . 2 . 2 驯养

　　投喂适当饵料(附录 C) 。每天喂食的量可分为同等的两份或多份，并分次投喂，每次间隔至少 3 h。取样或解剖前 12 h 内不投喂。

　　对于投喂的饵料应进行污染物评估，如有机氯农药、多环芳烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs) 。避免使用含有较高水平的植物雌激素的饵料。

　　每周至少两次用吸管清除容器底部的饵料残渣和排泄物。

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　　8 . 2 . 3 灯光和温度

　　光照和水温参见附录 C。

　　8 . 3 测试频率

　　试验期间定期测定受试物浓度。

　　每天检测稀释水与受试物贮备液的流速，流速变动不得超过 10%。试验开始时及其后每周 1 次 ，测定受试物浓度。 试验结果应以测定浓度为准。 试验期间受试物浓度保持在配制浓度的 ±20%内，结果可采用配制浓度。

　　对样品进行离心或过滤(例如使用 0.45 μm孔径滤膜)，推荐离心。

　　试验期间应测定所有试验容器中的溶解氧、水温和 pH 值 。测定对照组和 1 个最高浓度组中的总硬度和 pH 值 。至少在 1 个试验容器中连续监测水温。

　　8 . 4 观察

　　8 . 4 . 1 死亡率

　　在试验期间每天观察鱼，记录死亡率，尽早移去死掉的鱼。 试验期间死掉鱼的性别需通过观察性腺来确定。

　　8 . 4 . 2 行为和表观

　　注意任何异常行为(相对于对照组)，如呼吸困难、游动不协调、失衡、厌食。 另外也需要注意表面异常(如出血、变色)。在进行数据解释时，需仔细考虑这些毒性表现1) 。

　　在移除受试鱼时需对外观(如颜色)进行观察。 对于黑头呆鱼，具有内分泌活性化学品可能诱发以下表面特征的变化：体色(明或暗)、着色模式(垂直带的存在)和体形(头部和胸部区域)。 因此在试验期间及试验结束时，需对鱼的外观进行观察。

　　8 . 4 . 3 生殖力

　　每天记录观察产卵量。 每天记录的存活的雌性数量和产卵量。 每天从试验容器中移出卵。 产卵基板应放在试验容器中，以便黑头呆鱼和斑马鱼能够在正常条件下产卵，参见附录 D。

　　8 . 4 . 4 鱼的安乐死

　　在 21 d暴露结束时，使用 100 mg/L~500 mg/L三卡因甲烷磺酸(Metacain, MS-222, CAS号 886- 86-2)对受试鱼实施安乐死，采用 300 mg/L NaHCO3 缓冲(小苏打，CAS 号 144-55-8),减少黏膜刺激。

　　取血或组织进行卵黄蛋白原检测，如附录 A所示。

　　8 . 4 . 5 第二性征的观察

　　具有内分泌活性化学品可诱发特定的第二性征的变化2)(雄性黑头呆鱼珠星的数目、雄性青鳍乳突物)。黑头呆鱼和青鳍的第二性征评价推荐程序，参见附录 B。

　　1) 这类行为观察可以提供有用的定性信息。 例如，黑头呆鱼暴露于雄性激素时，能观察到正常的雄性或雄性化的雌鱼的领域性行为;斑马鱼暴露于雌激素或抗雄激素后，其交配和在拂晓光照产卵的特征行为有所减少或抑制。

　　2) 特定作用模式的化学品可能会导致动物异性的异常第二性征发生;例如雄激素受体激活剂，如去甲雄三烯醇酮、甲睾酮和双氢睾酮，可能会导致雌性黑头呆鱼形成明显的婚珠星或雌性青鳍形成乳突物。 雌激素受体激活剂会减少珠星数目和成年雄性颈背背垫的尺寸。 总体的形态学观察可以提供有用的定性和定量信息。 黑头呆鱼珠星的数量和尺寸大小以及青鳍的乳突物可以直接量化或更切实的保存标本。

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　　8 . 4 . 6 卵黄蛋白原测定

　　采用肝素钠润洗的毛细管从尾静脉取血或肝素钠润洗注射器穿刺心脏动脉取血。 黑头呆鱼每尾鱼收集的血的体积为 5 μL~60 μL,每尾斑马鱼 5 μL~15 μL。 血浆通过血液离心得到，加蛋白酶抑制剂后在 -80 ℃中储存待用。 青鳍可采用肝脏样品、斑马鱼可采用头/尾匀浆液进行卵黄蛋白原测定，参见附录 A。

　　使用标准品对卵黄蛋白原测定进行质量控制。 对每个 ELISA 方法，都应进行基质效应试验(样品稀释效应)以确定最低样品稀释倍数。 用来进行 VTG 分析的 ELISA 板包括下列质量控制样品：至少 6 个校准标准品，其浓度范围涵盖预期的卵黄蛋白原浓度，至少 1 个非特异性结合分析试验空白样(一式两份)。这些空白样的吸光度应小于最高校准标准吸收的 5%。 至少对每个样品稀释液的两个等份(平行样)进行分析。 平行样如果差异大于 20%,需要重新分析。

　　校准曲线的相关系数(R2 ) 应大于 0 . 99 。 校准曲线计算出的每个标准的浓度，应在配制浓度的70%~120%之内。 如果配制浓度趋势远离校准回归线的趋势(例如在低浓度)，可能需要将校准曲线分为低浓度和高浓度范围，或者采用非直线模型以充分拟合吸收数据。 如果曲线分为两段，每段曲线的

　　R2 >0.99。

　　检测限(LOD)为最低分析标准品的浓度，定量限(LOQ) 为最低分析标准品的浓度乘以最低稀释倍数。

　　每天进行卵黄蛋白原的测定，采用加标进行批间标准品分析，参见附录 F。

　　8 . 4 . 7 性腺组织病理学评价

　　解剖后将性腺固定用作病理学检测。 性腺内分泌相关的现象可用来评估受试物内分泌活性。 相关现象包括：睾丸卵母细胞的存在、睾丸间质细胞增生、降低卵黄的形成、增加精原细胞和滤泡增生;其他性腺方面的损伤，如卵母细胞闭锁、睾丸性腺病变变形和阶段的变化。

　　9 数据和报告

　　9 . 1 采用方差分析(ANOVA)对生物标志物响应进行评价

　　采用方差分析(ANOVA)对受试组和对照组之间的响应进行比较来确定化学品是否具有内分泌活性 。如使用了溶剂对照，对于每个终点，稀释水和溶剂对照之间进行统计分析。 所有的生物学响应数据应按性别分别处理和报告。 如所选参数方法不能满足非正态分布(如 Shapiro-Wilk 检验)或方差不齐(Bartlet检验或 Levene检验)，应该考虑在方差分析之前将数据转换进行均一性方差分析或加权方差

　　分析。多个两两比较的 Dunnett检验(参数)或具有 Bonferroni 校正的 Mann-Whitney(非参数)可以用于非单调的剂量反应。 如果剂量反应近似单调，也可以用其他统计检验(如 Jonckheere-Terpstra 检验或 Williams 检验)。 附录 G 中图 G. 1 提供了统计流程图以确定选择最合适的统计检验。

　　9 . 2 试验结果报告

　　9 . 2 . 1 测试机构：

　　— 负责人员及其研究责任;

　　— 每个实验室应具备熟练使用各种代表性化学品的能力。

　　9 . 2 . 2 受试物：

　　— 受试物的特性;

　　— 物理属性、相关的物理-化学特性;

　　— 贮备液的制备方法及试液更新的频率;

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　　— 稳定性和生物降解性。

　　9 . 2 . 3 溶剂：

　　— 溶剂特性(性质、所用浓度);

　　— 选择溶剂的理由(如选用水以外的溶剂)。

　　9 . 2 . 4 受试动物：

　　— 物种和品系;

　　— 供应商及特定的供应商设施;

　　— 在试验开始时鱼龄和生殖/产卵状态;

　　— 详细的动物驯化过程;

　　— 试验开始时鱼的重量。

　　9 . 2 . 5 试验条件：

　　— 试验程序，如方法、时间、负荷等;

　　— 贮备液的配制方法和试液更新的频率;

　　— 试验设置浓度、实测浓度、平均值及标准差，以及分析测定方法;

　　— 稀释水特性：包括 pH 值、硬度、碱度、温度、溶解氧浓度、残留氯水平、总有机碳、悬浮物以及其他测定的特性;

　　— 试验容器中的水质，pH 值、硬度、温度、溶解氧浓度;

　　— 驯养的详细资料：如料类型、来源、驯养数量和频率以及可能的相关的污染分析(如 PCBs、 PAHs 和有机氯农药)。

　　9 . 2 . 6 结果：

　　— 对照符合试验质量控制和质量保证要求;

　　— 试验浓度组和对照组中的死亡率;

　　— 采用的统计分析方法及理由;

　　— 生物观测终点数据，包括第二性征和卵黄蛋白原;

　　— 数据分析结果;

　　— 鱼的任何异常反应;

　　— 对偏离测试准则之处加以说明，试验结果阐释和可接受性的标准见附录 H。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　进行卵黄蛋白原分析的样品收集推荐程序

　　A.1 避免交叉污染

　　注意避免雄鱼和雌鱼 VTG样品的交叉污染。

　　A.2 步骤 1A：黑头呆鱼尾静脉/动脉取血

　　在麻醉后，采用外科手术刀片将尾柄切开，用肝素钠润洗的毛细管从尾静脉进行血液收集。 血液收集后，在 15 000g 离心 3 min(或者在 4 ℃时 15 000g 离心 10 min)快速分离血浆。 如果需要，可在离心后测定血细胞比容百分比。 将血浆从毛细管中分离至离心管中，加入 0 . 13 单位的抗蛋白酶肽，储存于 -80 ℃中待测。 根据黑头呆鱼的尺寸(与性别有关)，可收集的血液体积一般在 50 μL/尾 鱼~

　　60 μL/尾鱼。

　　A.3 步骤 1B：黑头呆鱼心脏收集血液

　　用肝素钠润洗的注射器进行心脏穿刺采血(1 000 单位肝素钠/mL) 。 血液转移至离心管(用冰冷冻)，然后离心(5 min, 7 000g，室温)。血浆转移至干净的离心管(如果血浆体积允许，进行等分)，快速冷冻至 -80 ℃中待测。

　　A.4 步骤 2A：日本青鳞肝脏的切除

　　A.4 . 1 将受试鱼从试验容器中移出：

　　a) 采用小的捞网将受试鱼从试验容器中移出，小心不要将受试鱼掉入其他试验容器中;

　　b ) 受试鱼移出时采用以下顺序：对照、溶剂对照(如使用)、最低浓度、中间浓度、最高浓度和阳性对照。 另外，在雌鱼移出前，所有的雄鱼都应已移出此试验容器;

　　c) 每尾受试鱼的性别根据外部第二性征来确定(如臀鳍的形状);

　　d) 将受试鱼放在一个容器内以便转移，运送到工作台以备切除肝脏用;检查试验容器和转移容器的标签正确，确认试验容器中移出的鱼的数目正确，保证留在试验容器中的鱼的数目与预期相符;

　　e) 如果鱼的性别无法由外观确认，将所有受试鱼从试验容器中移出。 在这种情况下，鱼的性别应由在显微镜下观察性腺或第二性征来确定。

　　A.4.2 肝脏的切除(图 A.1~图 A.8) :

　　a) 用小捞网将受试鱼从容器中转移到麻醉溶液中;

　　b ) 在受试鱼麻醉后，用镊子将受试鱼转移到滤纸(或纸巾)上。 当夹取鱼时，镊子接触头侧部。 防止弄断尾巴;

　　c) 在滤纸(或纸巾)上擦拭干受试鱼表面水;

　　d) 将鱼腹部朝上放置。 然后用解剖剪在腹部颈部区域和中间-腹部区域切出小的横向切口 ;

　　e) 将解剖剪伸入小切口，沿着腹部中线，从接近鳃覆盖物尾部的一点到肛门的头盖边，切开腹部;

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　　小心不要将解剖剪伸入太深，防止毁坏肝脏和性腺;

　　f) 在体视显微镜下进行操作;

　　g) 将受试鱼腹部朝上放置在纸巾上(另准备玻璃盘或载玻片);

　　h) 用精密镊子将腹腔扩展，取出腹内器官;必要时可通过移去腹腔的一边来去除内部器官;

　　i ) 用另一对精密剪刀将肝和胆囊的连接部分暴露出来。 然后抓住胆管，切除胆囊。 小心不要碰碎胆囊;

　　j) 抓住食道，采用同样方式从肝上切除胃肠道;小心不要使得胃肠道渗漏;从肛门切除尾部胃肠道，移除腹腔上的胃肠道;

　　k) 从肝脏外围修剪脂肪和其他组织。 小心不要刮伤肝脏;

　　l ) 采用精密镊子抓住肝脏入口部分，从腹腔内移去肝脏;

　　m ) 将肝脏放置在载玻片上。 如果需要的话，采用精密镊子，从肝脏表面移去另外的脂肪和外部组织;

　　n) 称量肝重。 在工作单上记录数值(精确至 0 . 1 mg) 。在微量管的标签上确认相关信息;

　　o ) 把装有肝脏的微量管盖上盖。 于冷却的架子上(或冰架上)储存;

　　p) 在切除了肝脏后，清洗解剖仪器或换用新的仪器;

　　q) 摘取转移容器内所有鱼的肝脏;

　　r) 在转移容器中所有鱼的肝脏摘取后(如所有的雄鱼或雌鱼在一个试验容器中)，将所有的肝脏样品放入试管中，贴上标签以便确认，并储藏于冷藏室中。 当肝脏样品在切除后马上用于预处理试验时，样品转移至另一个处于冷却架子上(或冰架上)的工作台。

　　A.4 . 3 在肝脏切除后，鱼的尸体可用于第二性征的测量。

　　A.4 . 4 标 本：如 果 在 切 除 受 试 鱼 的 肝 脏 后 并 不 马 上 用 于 预 试 验，将 取 自 受 试 鱼 的 肝 脏 标 本 储 藏于 ≤-70 ℃。

　　图 A.1 用剪刀沿着胸鳍前剪开

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　　图 A.2 用剪刀沿着腹部中线伸入腹部离肛门头部大约 2 mm处

　　图 A.3 采用手术钳撑开腹壁，暴露肝脏以及其他内部器官(或者将腹壁横向固定)

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　　图 A.4 采用手术钳缓慢分离和切除肝脏

　　图 A.5 采用手术钳缓慢摘取肠道

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　　图 A.6 肠道以及任何肠系膜的附属物的终端采用剪刀切割

　　图 A.7 (雌鱼)对于雌鱼过程相同

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　　图 A.8 完成整个过程

　　A.5 步骤 2B：日本青鳞(oryziaslatipes)，肝的卵黄蛋白原测定的预试验

　　A.5 . 1 试验前准备

　　从 ELASA试剂盒中拿出匀浆缓冲液用瓶，用碎冰冷却( 溶液温度 ≤4 ℃ ) 。 如果采用从 EnBio ELISA 系统中的匀浆缓冲液，在室温下溶解溶液，然后用碎冰冷却瓶。

　　A.5 . 2 计算匀浆缓冲液

　　基于体重计算来自肝脏的匀浆缓冲液的体积(在每毫克质量的肝脏中加入 50 μL匀浆缓冲液)。例如，如果肝脏质量是 4 . 5 mg,肝脏的匀浆缓冲液的体积是 225 μL。 对于所有肝脏样品制备一系列匀浆缓冲液。

　　A.5 . 3 制备肝脏样品

　　为预试验制备肝脏样品：

　　a) 在预试验前，从冷冻器中取出装有肝脏样品的 1 . 5 mL微量管;

　　b ) 雄鱼肝脏的预试验应在雌鱼之前进行，以防止卵黄蛋白原的污染。 另外，试验组的预试验应按如下顺序进行：对照，溶剂对照(有必要时)，最低浓度，中间浓度，最高浓度和阳性对照;

　　c) 在给定时间，从冷冻器中取出的装有肝脏样品的 1 . 5 mL微量管数目不超过同时能够进行离心的数目;

　　d) 按照冰架上样品标本的编号，对含有肝脏样品的 1 . 5 mL 的微量管进行排序(不必要溶解肝脏)。

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　　A.5 . 4 预试验的操作

　　A.5 . 4 . 1 加入匀浆缓冲液

　　加入匀浆缓冲液步骤如下：

　　a) 检查用于特定肝脏样品匀浆缓冲液体积的列表，调整微量吸管(体积范围为：100 μL~1 000 μL)至适当体积。 在微量吸管上装上干净的洗头吸头;

　　b ) 从试剂瓶中取出匀浆缓冲液，在装有肝脏样品的 1 . 5 mL微量管中加入缓冲液;

　　c) 在所有装有肝脏的 1 . 5 mL微量管中加入匀浆缓冲液。 在新的样品中不需要更换移液器吸头。然而，如果吸头被污染，或者怀疑被污染，应该更换吸头。

　　A.5 . 4 . 2 肝脏样品的匀浆

　　肝脏样品的匀浆步骤如下：

　　a) 在微量管匀浆器中接上一个新的匀浆杆;

　　b ) 将匀浆杆插入 1 . 5 mL微量管中。 扶住微量匀浆器，使得肝脏样品挤压在匀浆杆的表面以及

　　1 . 5 mL 微量管的内壁之间;

　　c) 启动微量管匀浆器 10 s~20 s。 在操作中采用碎冰冷却 1 . 5 mL微量管;

　　d) 将匀浆杆从 1 . 5 mL微量管中提起，停顿约 10 s。 然后对悬浮液状态进行目测检查;

　　e) 如果在悬浮液中可观察到肝脏样品的尾状，重复操作 c) 和 d), 直至制备令人满意的肝脏匀浆液;

　　f) 在冰架上冷却悬浮的肝脏匀浆液，直至离心;

　　g) 对于每个匀浆，更换一个新的匀浆杆;

　　h) 根据上面描述的程序采用匀浆缓冲液对所有肝脏进行匀浆。

　　A.5 . 4 . 3 离心

　　对悬浮的肝脏匀浆液进行离心：

　　a) 确认冷冻离心机面板的温度设定 ≤5 ℃ ;

　　b ) 将装有悬浮的肝脏匀浆液的 1 . 5 mL微量管插入离心机的转子中(如果有必要，进行平衡校正);

　　c) 对悬浮的肝脏匀浆液在 ≤5 ℃ , 13 000g 离心 10 min。 然而，如果悬浮物足够完全分离，可对离心力和时间进行必要的校正;

　　d) 在离心后，检查悬浮液已完全分离(表层：油脂，中间层：悬浮物，底层：肝脏样品);如果分离不完全，在同样条件下再次离心悬浮液;

　　e) 将所有样品从离心机中取出，按顺序排放在冰架子上;小心不要使得已分离的各层再次混合在一起。

　　A.5 . 4 . 4 收集悬浮物

　　悬浮物的收集步骤如下：

　　a) 在试管架上放置四个 0 . 5 mL 的微量管，准备储存悬浮液;

　　b ) 每个悬浮液收集 30 μL(分离后的中间层)，放入一个 0 . 5 mL 的微量管中。 注意不要收集表层的油脂或者底层的肝脏样品;

　　c) 采用上述相同的方法，收集悬浮液，分散至另外两个 0 . 5 mL 的微量管中;

　　d ) 收集剩下的悬浮液(如果可能，≥100 μL) 。然后分散至剩下的那个 0 . 5 mL微量管中。 注意不要收集表层的油脂或者底层的肝脏样品;

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　　e) 盖上 0 . 5 mL微量管的盖子，在标签上写上悬浮液体积。 然后在冰架上快速冷却微量管;

　　f) 对于每个悬浮液，更换一个新的移液器吸头。 如果大量液体吸附于枪头，快速更换一个新的，避免油脂污染肝脏提取液;

　　g) 根据上述程序，分散所有离心后的悬浮液至四个 0 . 5 mL微量管中;

　　h) 在分散了悬浮液至 0 . 5 mL微量管中后，将所有管放入试管架上，贴上标签，然后在冷冻器中快速冷冻;如果在预试验后马上进行 VTG 浓度测量，则可在试管架上保持一个 0 . 5 mL 的微量管(装有 30 μL悬浮液)冷却，在进行 ELASA 试验时转移至工作台上;在这种情况下，试管架上剩下的微量管在冷冻器中冷冻;

　　i ) 在收集完悬浮液后，完全扔弃残留物。

　　A.5 . 5 样品的储存

　　样品储存于 ≤- 70 ℃,直至准备用于 ELISA试验。

　　A.6 步骤 3A：斑马鱼，尾部静脉/动脉采血

　　在麻醉之后将尾部横向切断，用肝素钠润洗的毛细管从尾部静脉/动脉进行血液收集。 根据鱼的大小，取血体积范围为 5 μL~15 μL。 在微量毛细管中加入同样体积的抗蛋白酶肽缓冲液(在 PBS缓冲液中，6 μL/mL),通过离心(600g，离心 5 min),将血浆从血液中分离出来。 将血浆收集到试验试管中，储存在 -20 ℃中待测。

　　A.7 步骤 3B：斑马鱼，心脏穿刺法收集血液

　　为避免血液的凝固和蛋白质的降解，收集的样品中放入含肝素钠(1 000 units/mL)和蛋白酶抑制剂抑肽酶(2 TIU/mL) 的磷酸盐缓冲液(PBS) 。血液取样推荐使用有固定细针头的注射器(1 mL) 。 注射器应预先充满缓冲液(约 100 μL) 。血液样本通过心脏穿刺法采集。 首先，鱼采用 MS-222(100 mg/L)麻醉 。在穿刺心脏时，用很小的压力推压注射器的活塞。 收集的血液体积范围在 20 μL~40 μL 范围内。在心脏刺穿后，血液/缓冲液混合液装入试管中。 血液中的血浆通过离心(20 min, 5 000g)分离，储存于 -80 ℃待测。

　　A.8 步骤 3C：斑马鱼，头和尾的匀浆

　　头和尾的匀浆步骤如下：

　　a) 鱼进行麻醉，实施安乐死;

　　b ) 如图 A. 9 所示，对鱼头和鱼尾进行切分。 注意在处理每尾鱼时，所有的解剖工具和解剖板都应清洗干净(例如用 96%的乙醇)，防止污染;

　　c) 对每尾鱼头部和尾部合并称重，体重测量精确到 mg;

　　d) 称重后，放置于试管中(例如，1 . 5 mL 的离心管)，进行匀浆;

　　e) 匀 浆 后，添 加 组 织 质 量 4 倍 的 冰 冻 匀 浆 缓 冲 液。 匀 浆 缓 冲 液 组 成 为：12 mL Tris-HCl (50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4)和 120 μL蛋白酶抑制(1%蛋白酶抑制剂)的混合物。匀浆缓冲液当天配制当天使用。 在冰上进行操作。 继续匀浆直至混合物匀质化。 每尾鱼换用新的匀浆杆;

　　f) 试样在 4 ℃ , 50 000g条件下离心 30 min;

　　g) 将移液器的尖端伸入表面的脂肪层下，吸取无脂肪或颗粒部分的上清液，吸取 20 μL悬浮液分

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　　散到至少两个试管中;

　　h) 试管储存于 -80 ℃待测。

　　图 A.9 斑马鱼鱼头鱼尾的切分

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　检测特定内分泌活性物质对黑头呆鱼和青鳞的第二性征的评估

　　B.1 黑头呆鱼第二性征的评估

　　B.1 . 1 概述

　　B.1 . 1 . 1 成年黑头呆鱼在内分泌干扰物检测中潜在的重要的物理外观特征包括身体颜色(如亮/暗)，颜色图案(如存在或缺乏垂直尾纹)，体型(如头部和胸部形状，腹部的鼓胀)，和特殊的第二性征(如珠星的数目和尺寸，背垫和产卵器官的尺寸)。

　　B.1 . 1 . 2 珠星位于繁殖活性的雄性黑头呆鱼的头部(背垫)，通常分布为双边对称样式。 对照雌鱼和幼年的雄鱼和雌鱼表现出没有珠星的发育。 在雄鱼眼睛和鼻孔周围最多有 8 个单独的珠星。 数目最多和尺寸最大的珠星位于鼻孔下面及嘴巴上面紧接的两个平行线上。 许多鱼类在下颚有珠星群，那些最接近嘴巴的珠星通常单独成对出现，而大多数腹部由最多 4 个珠星组成。 珠星的实际数目通常很少大于 30(范围在 18~28 之间)。显著的珠星(在数量上)体现为一个单独的、相对圆的结构，高度约等于半径。大多数繁殖活跃的雄鱼也有或至少有一些扩大和突出的珠星，使他们作为单独的结构难以区分。

　　B.1 . 1 . 3 某些类型的内分泌干扰化学品可能会导致异性的某些第二性征发生异常，例如，雄激素受体激活剂，17β-甲基睾丸素或 17β-去甲雄三烯醇酮，可能会导致雌性黑头呆鱼产生珠星，而雌激素受体激活剂可能会减少雄性珠星的数量或尺寸。

　　B.1 . 1 . 4 黑头呆鱼珠星的特征描述，是根据美国环境保护署设在明尼苏达的德卢斯实验室所使用的程序制定的。 具体产品和/或设备可用同类可获得的材料代替。 最佳的浏览方式是使用照明放大玻璃或3 倍的照明解剖镜。 查看鱼背侧和头部朝前(鱼头朝向观看者)。

　　a) 将鱼放在小 Petri 培养皿中(例如，直径为 100 mm),头部朝前，腹部朝下。 聚焦以识别珠星。轻柔缓慢的将鱼从一边翻到另一边来确定珠星区域。 对珠星数计数和评分;

　　b ) 在 Petri 培养皿中将鱼背部朝前，重复观察腹侧头表面;

　　c) 每个鱼的观察在 2 min 内完成。

　　B.1 . 2 珠星的计数和分级

　　B.1 . 2 . 1 已经确定了六个具体领域，来评价成年黑头呆鱼珠星的存在和发育。 模板的形式是为了绘制现有珠星的位置和数量，见图 B. 1 。 记录珠星的数 目 和尺寸，对每个生物体定量分级为：0 — 缺乏、 1 — 存在、2 — 扩大和 3 — 明显，见表 B. 1 。

　　B.1 . 2 . 2 等级 0 表示缺乏任何珠星。 等级 1 表示存在，是确定为有一个单独的点的任何珠星，其高度几乎相当于它的半径(直径)。等级 2 表示扩大，是从外观上看起来像星号、从组织上确定的珠星，通常有一个大的径向槽沟或从中心收缩。 珠星高度往往有缺口，但有时可以呈圆形。 等级 3 表示明显，通常是相当大和圆，结构上较少定义。 有时这些珠星连接起来，形成一个单独的个体或组合群区域(以下所述的 B、C 和 D) 。颜色和设计类似于等级 2,但有时难以区分。 利用这种分级体系，拥有珠星数在 18~20之间的普通雄鱼参比的珠星评分为<50。

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　　图 B.1 黑头呆鱼珠星的数目和尺寸

　　B.1 . 2 . 3 在特殊的等级领域，某些鱼珠星的实际数目可能大于模板评级框，见表 B. 1 。如果发生这种情况，其他等级数字可被标记在框内的右边或左边。 因此，该模板没有显示对称性。 可在一个单独的框中对两个珠星进行双标记分级评分，采用绘制沿着嘴的平面的水平面的垂直配对的或连接的珠星的其他技术。

　　B.1 . 3 绘制区域

　　B.1 . 3 . 1 A— 珠星位于眼周围。 沿着眼部前边沿绘制背部到腹部区域。 通常在成熟雄鱼对照中有多个，雌鱼对照中没有，一般成对(每只眼睛附近一个)或在暴露于雄激素的雌鱼中单个。

　　B.1 . 3 . 2 B— 珠星位于鼻孔之间(感应管道孔)，通常在发育的水平升高的雄鱼对照中成对(2 — 扩大或 3 — 明显)。有时在对照雌鱼中不存在，雌鱼暴露于雄激素会发展。

　　B.1 . 3 . 3 C— 珠星位于紧靠鼻孔前部，与嘴平行，一般在成熟的对照雄鱼中增大或明显，在较少发育的雄鱼或雄激素处理的雌鱼中存在或增大。

　　B.1 . 3 . 4 D— 珠星位于嘴线的平行处。 一般在对照雄鱼中分级发育，在雌鱼对照中缺乏，但在雄激素暴露的雌鱼中存在。

　　B.1 . 3 . 5 E— 珠星位于下颚，靠近嘴，通常很小以及一般成对，在对照或处理的雄鱼，以及处理的雌鱼有所不同。

　　B.1 . 3 . 6 F— 珠星位于 E 的腹侧。 通常很小并成对，在雄鱼对照和雄激素暴露的雌鱼中存在。

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　　表 B.1 黑头呆鱼珠星模板

　　珠星模板 评分数

　　编号 1 — 存在

　　日期 2 — 扩大

　　总评分 3 — 明显

　　珠星模板 评分数

　　编号 1 — 存在

　　日期 2 — 扩大

　　总评分 3 — 明显

　　B.2 青鳞的第二性征的评估

　　B.2 . 1 对青鳍的第二性征 — 乳突物的测定的描述。 乳突物通常只出现在成年雄鱼身上，并且发现于

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　　从臀鳍后尾部开始算起的、从第二个到第七个或第八个鳍尾部位，见图 B. 2 和图 B. 3 。但是，突起很少出现于臀鳍后尾部的第一个鳍尾上。 以下是第一个鳍尾突起的测量方法(鳍尾数目是指从臀鳍后尾部开始的顺序)。

　　a) 在肝切除后，参见附录 A,鱼体放在含有大约 10 mL 的 10%中性福尔马林缓冲液的圆锥型试管中(上面：头，下面：尾巴)。如果性腺固定在 10%的中性福尔马林缓冲液以外的溶液中，在臀鳍前部和肛门之间用剃刀沿着鱼体横向切断，注意不要损害生殖孔和性腺本身，见图 B. 4 。将鱼身的头盖部放入固定剂溶液中来保存性腺，将鱼身的尾部如上所述放入 10%的中性福尔马林缓冲液中;

　　b ) 在将鱼身放入 10%的中性福尔马林缓冲液后，用镊子夹起臀鳍的前部并伸展约 30 s保持臀鳍打开。 当用镊子夹起臀鳍时，小心地夹住臀鳍的前部区域不要抓伤乳突物;

　　c) 在保持臀鳍打开 30 s后，将鱼身在室温下储存于 10%的中性福尔马林缓冲液中，直到进行乳突物测量(测量至少在固定 24 h后开始进行)。

　　B.2 . 2 测量方法：

　　a) 在将鱼身固定在 10%中性福尔马林缓冲液中至少 24 h后，从圆锥型试管中取出鱼体，在过滤纸上(或用纸巾)擦拭福尔马林;

　　b ) 将鱼腹部朝上放置。 然后用小型解剖手术刀仔细的切开臀鳍(最好随着小数量的鳍尾切开臀鳍);

　　c) 用镊子夹起已切断的臀鳍的前部区域，放置在滴有几滴水的玻璃片上。 然后在臀鳍上盖上玻璃片。 在用镊子夹取臀鳍时要小心不要划伤乳突物;

　　d) 用显微镜(正置显微镜或倒置显微镜)的计数器对乳突物的接合板的数量进行计数。 当一个小突起的形成在接合板的后缘是可见的时，乳突物可被识别出。 记录每个鳍尾上乳突物的接合板的数目(例如，第 1 个鳍尾：0,第 2 鳍尾：10,第 3 个鳍尾：12,等)和每尾鱼的突起的总数。 如有必要，拍下臀鳍的照片，并在图片中数出乳突物的接合板的数目;

　　e) 在测量完成后，将臀鳍放入圆锥型试管中储存。

　　图 B.2 臀鳍形状和尺寸的性别差异

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　　图 B.3 臀鳍线的结合板上的突起过程

　　B.2 . 3 图 B. 4 是鱼身的照片，显示了当性腺固定在除了 10%的中性福尔马林缓冲液以外的固定液中时的切割点。 在这种情况下，剩下的身体用切刀(红色线)在臀鳍前部区域和肛门之间切割开，且鱼身的头部放在为性腺准备的固定溶液中，鱼身的尾部放在 10%的中性福尔马林缓冲液中。

　　图 B.4 带有切割点的鱼身照片

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　鱼类内分泌筛选试验的实验条件

　　鱼类内分泌筛选试验的实验条件见表 C. 1 。

　　表 C.1 鱼类内分泌筛选试验的实验条件

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　　表 C.1(续)

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　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基板

　　D.1 斑马鱼产卵基板

　　D.1 . 1 产卵托盘：全玻璃仪器盘，例如 220 mm×150 mm×55 mm(长 ×宽 ×高)，表面覆盖有可移动的不锈钢金属网格(网宽 2 mm) 。 网格应在边缘下某一水平处覆盖仪器盘开口 。

　　图 D.1 斑马鱼产卵基板

　　D.1 . 2 产卵基板固定在托盘上，可放绿色塑料作为人工水生植物装饰(注意：应考虑受试物在塑料材料上可能的吸附)。

　　D.1 . 3 托盘和网格之间的距离至少应为 30 mm, 以确保产卵不会超出托盘进行。 托盘上产的卵落入网格中，可在光照开始后 45 min~60 min 的时间内收集。 透明的卵不粘连易分辨，在光源下计数。 每个容器中有 5 尾雌鱼，每天产卵的数量为 20 个时视为低产量，到 100 时视为中等，100 个以上的视为高产量 。移除产卵托盘，收集卵，产卵托盘可傍晚尽量晚时或清早尽量早时再次放入试验容器中。 再次放入的时间间隔不应超过 1 h,否则产卵底质可能作为一种暗示引发单体在非常时期的交配和产卵。 如果需要晚些时间放入产卵托盘，应在光照开始后至少 9 h进行。

　　D.2 黑头呆鱼产卵基板

　　D.2 . 1 混合塑料、陶瓷、玻璃或不锈钢的产卵盘和托盘放置于每个试验容器中(例如，80 mm 长的灰色半圆形排水材料，坐落于 130 mm 长的唇型盘)，见图 D. 2 。

　　D.2 . 2 产卵盘进行打磨以提高粘附性。 托盘也应进行筛选，防止鱼进入落下的卵中。

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　　图 D.2 黑头呆鱼产卵基板

　　D.2 . 3 该基板的设计是为了装载那些不粘附于陶瓷表面因而下降到容器底部的卵(或那些直接产在塑料基地平板上的卵)。所有产卵基板在使用前应在稀释水中过滤至少 12 h。

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　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　可接受的稀释水的一些化学特性

　　可接受的稀释水的一些化学特性见表 E. 1 。

　　表 E.1 可接受的稀释水的一些化学特性

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　　附 录 F

　　(资料性附录)

　　卵黄蛋白原加标和批间标准品分析

　　F.1 每天进行卵黄蛋白原测定试验时，要对 1 个加标进行批间标准品分析。

　　F.2 加标采用在雄鱼血浆对照样品中加入一定已知量的批间标准品分析标准品。 所制成的样品卵黄蛋白原浓度加强至对照雄鱼样品卵黄蛋白原水平的 10 倍 ~ 100 倍 。加强的对照雄鱼血浆样品可来 自于一尾单独的鱼或几尾鱼的混合体。

　　F.3 没有进行加强的样品可在至少两个平行板中进行分析。 加标也应在至少两个平行板中进行分析。两个未加强对照样品中卵黄蛋白原的平均量将加入到计算加标的卵黄蛋白量中，以确定设置浓度。 记录当天进行的分析试验结果和设置浓度与测量浓度的比值。

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　　附 录 H

　　(规范性附录)

　　试验结果阐释和可接受性的标准

　　H.1 当受试物表现出明显毒性效应或对受试生物的状态造成影响时，结果应慎重解释。

　　H.2 在设计试验浓度时，不要超过最大耐受浓度。 至少一个处理组没有毒性效应现象发生。 应对疾病情况和毒性效应进行完全的评估。 例如，雌鱼中的 VTG 的产生也会受一般毒性和非内分泌的毒性作用模式的影响，如肝毒性。 然而，对效应的解释也能由其他没受系统毒性影响的处理水平而强化。

　　H.3 对于试验结果的可接受性有几个方面需要考虑。 黑头呆鱼和斑马鱼对照组的雄鱼和雌鱼 VTG水平为 3 个数量级的显著差异，青鳍为 1 个数量级。 对照组和处理组中所遇到的数值范围的范例可在验证报告中得到。 对照组雄鱼的高水平的 VTG 数值可能会影响分析的响应能力，以及检测弱雌激素受体激活剂的能力。 对照组雌鱼的低水平的 VTG 数值可能会影响分析的响应能力，以及检测芳香酶抑制剂和雌激素拮抗剂的能力。

　　H.4 产卵量是影响分析测试能力的重要系数(CV 可在 20%~60%范围内变化)，在 CV接近 50%或以上时，检测到产卵量明显下降小于 70%;当 CV 处于较低的值(约 20%~30%) 时，测试可接受的能力(80%)检测到 40%~50%产卵量的下降。

　　H.5 如实验室未进行过相关试验，或发生重大变化后(如鱼品系或供应商变化)，最好进行能力测试。建议采用涵盖许多试验终点的物质。 推荐每个实验室建立自己的雄鱼和雌鱼历史对照数据，并进行导致雄鱼 VTG水平升高的雌激素活性的阳性对照化学品的试验(如 100 ng/L 的 17β-雌二醇或者已知的弱激活剂)，导致雌鱼 VTG水平降低的芳香酶抑制的阳性对照化学品的试验(如 300 μg/L 的法倔唑或咪酰胺)，以及诱导雌性黑头呆鱼和青鳍的第二性征的雄激素活性的阳性对照化学品的试验(如 5 μg/L的 17β-去甲雄三烯醇酮)。所有这些数据可与验证试验中得到的数据进行比较，以确保实验室能力。

　　H.6 与对照组相比，至少在试验的最高剂量，雄鱼的 VTG水平显著升高(P<0 . 05),或雌鱼显著降低(P<0 . 05),并缺乏一般毒性的迹象，则卵黄蛋白原测量可被认为是阳性。 剂量-响应曲线之间的生物学可能性关系的表示可进一步支持阳性结果。 卵黄蛋白原水平的降低可能不一定完全来源于内分泌;但阳性结果一般解释为体内内分泌干扰活性。

　　H.7 在卵黄蛋白原或第二性征为阳性(例如卵黄蛋白原升高或降低或第二性征有诱导)时，不需要进行性腺组织学病理评价。

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　　参 考 文 献

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　　[2] OECD ( 2006b) . Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B) . OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61 , ENV/JM/MONO(2006) 29.

　　[3] OECD (2007) .Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the De- tection of Endocrine Active Substances. Phase 2 : Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78 , ENV/JM/MONO(2007) 25.

　　[4] Owens JW (2007) .Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay.CEF- IC LRI Project, Endocrine.http://www.cefic-lri.org/index.php? page=projects (accessed 18/09/08) .

　　[5] US EPA 2007.Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report.Unpublished report dated 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washing- ton, DC.104 pp.Dodd MHI, Dodd JM (1976) Physiology of Amphibia.Lofts, B. (ed.) , Academic Press , New York , 467-599 .

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