GB/T 35518-2017 化学品 土壤中的固有生物降解性试验

　　ICS 13 . 300 ; 13 . 020 . 40 A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35518—2017

　　化学品 土壤中的固有生物降解性试验

　　Chemicals—Inherentbiodegradabilityinsoiltest

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35518—20 17

　　GB/T 35518—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准和经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则 No.304 A(1981 年)《土壤中的固有生物降解性》(英文版)的技术性内容相同。

　　本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC 251)提出并归口 。

　　本标准起草单位：环境保护部固体废物与化学品管理技术中心、北京师范大学、环境保护部南京环境科学研究所、上海市检测中心、沈阳化工研究院安评中心、浙江省农业科学院、浙江省化工研究院、广东省微生物研究所。

　　本标准主要起草人：刘纯新、竺建荣、于丽娜、刘济宁、陈晓倩、蔡磊明、汤保华、刘新洋、曾 国驱、陈杰。

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　　化学品 土壤中的固有生物降解性试验

　　1 范围

　　本标准规定了化学品土壤中的固有生物降解性试验的术语和定义、受试物信息、试验原理、参比物质、试验方法概述、试验操作、质量保证与质量控制、数据与报告。

　　本标准适用于测定14 C 同位素标记的化学品在土壤微生物作用下的矿化率。

　　本标准适用于对土壤中微生物活性无明显抑制的挥发性或非挥发性、水溶性或非水溶性的化学品(包括放射性标记物或非标记物)。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　衡法

　　GB/T 27854 化学品 土壤微生物 氮转化试验

　　GB/T 27855 化学品 土壤微生物 碳转化试验

　　GB/T 27856 化学品 土壤中好氧厌氧转化试验

　　OECD化学品测试导则 No.104 蒸气压(Vapour Pressure)

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　土壤 soil

　　矿物和有机质的混合物。 有机质包括含有碳、氮量较高的大分子化合物，并包含有活的小型生物(大部分是微生物)。

　　注：土壤可以按以下两种状态处理：

　　a) 原状土，随时间的推移，形成不同特性的土壤层;

　　b) 扰动土，通常在耕地时或挖掘取样时发生扰动的土壤，本标准的试验中用到的即为扰动土。

　　3.2

　　矿化过程 mineralization

　　有机物分子的彻底降解。

　　注：在此过程中，标记的碳原子( 14 C)被定量地氧化，并释放出相应数量的 14 CO 2 。

　　4 受试物信息

　　4 . 1 必备信息

　　受试物必备信息包括：

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　　a) 14 C在所标记分子结构中的位置和标记的特征;

　　b) 蒸气压(GB/T 22228、GB/T 22229 和 OECD 104)。

　　4 . 2 其他信息

　　其他指导信息包括：

　　c) 受试物对微生物的抑制数据(GB/T 21796) ;

　　d) 受试物对土壤微生物的毒性(GB/T 27854 和 GB/T 27855) ;

　　e) 受试物在土壤中的厌氧降解数据(GB/T 27856) 。

　　5 试验原理

　　5 . 1 基本试验

　　经用14 C标记的受试物处理的少量土样，放入生物计量瓶中，然后培养。 受试物降解释放的14 CO 2的量，经碱吸收后用液体闪烁计数仪测定。

　　5 . 2 供选试验

　　5 . 2 . 1 挥发试验

　　若受试物的蒸气压高于 0 . 0133 Pa,则将一个聚氨基甲酸乙酯泡沫塞，放入生物计量瓶，以吸收标记的受试物可挥发成分和挥发性代谢物，用于液体闪烁计数。

　　5 . 2 . 2 残留试验

　　当受试物矿化率达到 50%时，对供试土壤进行提取。 受试物的可提取部分，及其留在土壤中的代谢产物的可提取部分，可用液体闪烁计数仪测定。 可通过灼烧土壤，然后测定释放的14 CO 2 来取得有关结合残留物部分的矿化率数据。

　　6 参比物质

　　参比物质主要用于校准某个新方法是否可行，比对不同方法的结果。

　　7 试验方法概述

　　7 . 1 仪器设备

　　试验中可能需要下列仪器设备：

　　a) 液体闪烁计数仪;

　　b) 用于燃烧放射性物质的氧化器;

　　c) 超声水浴，500 mL 以上;

　　d) 生物计量瓶(见图 1)包括：250 mL锥形瓶，熔接的 50 mL 圆底管;25 mL注射器;15 号注射针头(国际通用标准，内径 1.36 mm) ,长 15 cm; 100 μL注射器;25 mL具塞量筒;

　　e) 1 mL 吸管 ;

　　f) 索氏抽提装置;

　　g) 液闪瓶(管);

　　h) 聚氨基甲酸乙酯塞，其直径为 30 mm,长 30 mm,密度 16 kg/m3 ;

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　　i) 用于理化分析及生物检测的实验室常规设备和玻璃器具。

　　图 1 试验装置示意图

　　7 . 2 化学试剂

　　试验中可能需要下列试剂：

　　a) 氢氧化钾、重铬酸钾、硫酸、盐酸、过氧化氢、焦磷酸钠(Na4 P2 O7),均为分析纯;

　　b) 氯化钙(CaCl2 ·2H2 O)、氯化钡(BaCl2 ·2H2 O)、氯化镁(MgCl2 ·6H2 O),均为分析纯;

　　c) 丙酮、甲醇、正己烷、三乙醇胺，均为分析纯;

　　d) 指示剂：溴甲酚绿、甲基红;

　　e) 烧碱石棉剂;

　　f) 闪烁液。

　　7 . 3 受试物溶液

　　将14 C标记的受试物溶解于水或丙酮中，使放射性达到 370 Bq/μL~1 850 Bq/μL。用未标记的受试物使该溶液达到所要求的浓度(例如：5 μg/μL,相当于每千克土中含受试物约 10 mg;或视受试物的毒性而定)。

　　7 . 4 试验用土壤

　　7 . 4 . 1 土壤的选择

　　7 . 4 . 1 . 1 淋溶土

　　pH 值在 5.5~6.5 之间;有机碳含量在 1%~1.5%之间;黏粒含量(颗粒直径<0.002 mm)在10%~ 20%之间;土壤阳离子交换量在 10 cmol/kg~15 cmol/kg。

　　7 . 4 . 1 . 2 灰土

　　pH 值在 4 . 0~5 . 0 之间;有机碳含量在 1 . 5% ~ 3. 5 %之间;黏粒含量 ≤10%;土壤阳离子交换量

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　　<10 cmol/kg。

　　7 . 4 . 1 . 3 新成土

　　pH 值在 6 . 6~8 . 0 之间;有机碳含量在 1%~4 %之间;黏粒含量在 11%~25 %之间;土壤阳离子交换量>10 cmol/kg。

　　7 . 4 . 1 . 4 其他土

　　在特殊情况下，宜增加另两种土壤进行试验，其中的一种含有较高含量的粉粒(直径在0 . 002 mm~ 0 . 063 mm 之间)，另一种含有较高含量的黏粒(30 % ) 。

　　7 . 4 . 2 土壤的准备

　　试验用土壤风干后在 4 ℃贮存，再次吸收水分使土壤含水量达到最大持水量的 40%,在 22 ℃ ± 2 ℃ 的黑暗条件下培养两周，准备用于试验。

　　7 . 4 . 3 土壤特性的测定方法

　　7.4.3. 1 测土壤 PH 的方法

　　将 10 g 风干土样悬浮于 25 mL,浓度为 0 . 01 mol/ L CaCl2 溶液中。 样品多次搅拌混匀，静置过夜，用 pH 计或电位计测定。 在测定前，应用样品预期测定值范围内的两种 pH 值标准溶液对仪器进行校准。

　　7 . 4 . 3 . 2 测定土壤中有机碳含量的方法

　　称量 1 g 风干土置于容器中，加入 15 mL 2 mol/ L 的 K2 Cr2 O7 溶液与 20 mL浓 H 2 SO4(分析纯，密度 1.84 g/cm3 ) ,在 145 ℃ ~ 155 ℃加热 15 min, 冷却至室温，用蒸馏水定容至 150 mL。离心后取20 mL 上清液，以蒸馏水为空白对照，用 1 cm 比色皿，于 590 nm 波长下，进行分光光度测定。 应用不加土壤的两份空白样品对照测定 K2 Cr2 O7 的自分解性。 用式(1)计算土壤中有机碳含量：

　　C

　　式中：

　　C —有机碳含量，%

　　V — 总体积，单位为毫升(mL) ;

　　E1 —Cr2 O3 的换算系数(25.332) ;

　　E2 —C 的换算系数(3 . 002 8) ;

　　Er — 590 nm 及 1 cm光程条件下的消光值;

　　F — 由 Cr2 O3 计算 K2 Cr2 O7 的系数;

　　CCr —Cr 的浓度(19.356 g/L) ;

　　e —样品质量，单位为毫克(mg) ;

　　1 —Cr3+ 的消光系数，α1 是校准曲线上独立测得的 5 个值的平均值，每个值由 Er 除 Cr2 O3 的

　　α2 —Cr6+ 的消光系数，α2 是两个独立估算值的平均值，每个值是由 Er 分别除相应的 K2 Cr2 O7的量(g)获得。

　　7 . 4 . 3 . 3 测定土壤粒径的方法

　　将 10 g 风干土壤与 100 mL H 2 O2(15% W/V)混合 15 h,然后加热至 CO 2 完全挥发。 悬浊液加入

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　　25 mL 的 0.1 mol/L Na4 P2 O7 溶液，静置过夜，然后加水定容至 250 mL, 溶液经过 0.2 mm 孔的筛网。

　　粒径 >0 . 2 mm 的部分将进一步筛分。 在淘析柱里用水定容至 1 000 mL,在水介质中通过均质的分隔，较小粒径部分(粉粒部分)被分开。

　　在不同沉淀时间，用移液器取容器中不同高度的溶液 10 mL;测定悬浮物质干重，粒径构成如表 1所示：

　　表 1 不同时间不同浸渍深度的粒径构成

　　7 . 4 . 3 . 4 土壤阳离子交换量测定法

　　制作长 15 cm、内径 30 mm 的玻璃柱，在一端缩小呈漏斗状，此端用过滤棉塞住。 在过滤棉上依次均匀铺上 1 cm厚石英砂，10 . 0 g 风干的试验土，再铺约 1 cm厚石英砂，在这些层之上注入 40 mL混合溶液[向 50 g/L 的三乙醇胺水溶液(用盐酸调 pH 值至 8 . 1)中加入 42 . 6 g/L 的 BaCl2 水溶液(将 100 g BaCl2 ·2H2 O 溶于 2 L水)，混合而成]。 1 h后将溶液收集在 250 mL锥形瓶中。 重复此操作。 另外，将 21.3 g/L 的 BaCl2 水溶液(将 25 g BaCl2 ·2H2 O 溶于 1 L水)40 mL 注入柱内。

　　静置过夜后，这部分溶液也收集起来，并用 100 mL水冲洗柱子。 用盐酸滴定混合洗出液(以溴甲酚绿加甲基红作指示剂)。测定 H + 、Ca2+ 、K+ 、Na+ 。再用 9 . 36 g/L 的 MgCl2 水溶液(每升水含 20 g MgCl2 ·6H2 O)200 mL, 以同样方式淋溶柱子以测定 Ba2+ 。用火焰吸收分光光度法测定该阳离子。 阳离子交换量以 100 g 土壤吸附的全部阳离子电荷总量表示。

　　8 试验操作

　　8 . 1 试验条件

　　整个试验期间，各生物计量瓶置于 22 ℃ ±2 ℃的黑暗处培养。

　　8 . 2 基本试验

　　每个生物计量瓶的锥形瓶部分(见图 1)置入 50 g 土样(以干重计)。分别将 100 μL有放射性的受试物溶液分 50 滴均匀滴于每个瓶的整个受试土壤表面。 然后，用切掉下部的巴斯德吸管(Pasteur pi- pette)仔细混合土样并将其留在瓶中。

　　另外，将等体积的受试物溶液放入 100 mL容量瓶中，直接测定加入的放射活性。

　　用表面涂聚四氟乙烯的硅胶塞封闭生物计量瓶，塞上插入一个烧碱石棉剂滤器。 该滤器有塞子和旋塞阀。 侧管用聚四氟乙烯塞密封，塞上插着 15 cm 长的 15 号注射针，针上端盖有硅胶塞，而且其尖端部套有长度较短的硅胶管，硅胶管与侧管的基底部接触。

　　按以下方式向侧管注射 10 mL碱溶液：用含 0 . 1 mol/ L KOH 溶液的经过校正的 Luer栓式注射器代替小塞;然后移去烧碱石棉剂滤器上的小塞，并且打开旋塞阀;通过注射针将碱溶液注入侧管;然后关上旋塞阀，移去注射器;15 号注射针和烧碱石棉剂滤器上的小塞回到它们的初始位置，所产生的14 CO 2

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　　被碱液吸附。

　　在试验开始后以递增的时间间隔，按给每个平行装置加样的程序相反的操作顺序，回收含14 CO 2 的碱液以便进行液闪计数分析。 此后，用 5 mL 碱液淋洗侧管。 再次向侧管加入新鲜碱液前，用空的25 mL 注射器分 3 次、每次吸 25 mL、共 75 mL空气吹过该系统，以便维持土壤的好氧条件。 取 1 mL碱液供液闪计数。

　　试验持续期间，可选择第 1 d 、2 d 、4 d 、8 d 、16 d 、32 d测定，必要时第 64 d也应测定。 该试验要求平行测定。 回收的14 CO 2 放射性相对于时间作图。 根据图中曲线可得出何时可终止试验。 若 CO 2 测定值相当于初始加入14 C量的 50%,则培养终止。 如果 64 d未达到此值，应停止培养。

　　8 . 3 供选试验

　　8 . 3 . 1 挥发量测算

　　如果受试物的蒸气压在 20 ℃时高于 0 . 013 3 Pa,则宜在生物计量瓶的臂中加一个直径 3 cm 的聚氨基甲酸乙酯泡沫塞。 此塞能吸收挥发性的受试物及挥发性的有机降解产物，但不吸收14 CO 2 。 吸收后的塞子用正己烷/甲醇(1/4)混合物索氏提取，取提取液进行液闪计数。

　　8 . 3 . 2 土壤中可提取与不可提取的残留物测定

　　如果受试物比较稳定(50%矿化时间超过 10 d),则宜进一步取得有关土壤可提取部分(包括受试物和降解产物)的放射性以及土壤结合残留物的资料。

　　为此目的，应在四个生物计量瓶以外，再准备两个生物计量瓶。 在到达基本试验的 50%(或 x%)矿化点时，分别用 100 mL丙酮(5 min超声处理)对这两个生物计量瓶中的土壤进行提取，然后用甲醇按同样方式进行提取。 取所有或几等分的混合提取液进行液闪计数。 如果需要，还可用其他的提取部分进行进一步的鉴别研究。

　　取几个等分的风干土样经燃烧形成14 CO 2 ,进行液闪计数以测定土壤的结合残留物。

　　9 质量保证与质量控制

　　9 . 1 复现性

　　如果在标准条件下操作，特别是对土壤进行预处理之后，本方法有较好的复现性。

　　9 . 2 灵敏度

　　每次用适量的14 C 标记的受试物(37 kBq~ 185 kBq;约 1 μCi~ 5 μCi) 进行试验，不需要灵敏度评估。

　　9 . 3 专-性

　　本方法仅适用于14 C标记的受试物，有较好的专一性。

　　10 数据与报告

　　10 . 1 结果处理

　　10 . 1 . 1 基本试验

　　在第 1 天、第 2 天、第 4 天、第 8 天、第 16 天、第 32 天和第 64 天后，由碱溶液测得的14 CO 2 的放射性

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　　水平值(四个平行试验的平均值)表示为占最初添加的受试物(放射性)的百分比，并用此值对时间绘制曲线图。 50%的放射性以14 CO2 的形式被回收的时刻，就是“50%矿化”水平。 如果到第 64 天还不能达到 50%矿化水平，那就取此时的数据并表示为“x%矿化”。

　　10 . 1 . 2 挥发试验

　　在 50%(或 x%)矿化点时，挥发并被捕集的受试物和降解产物的放射性被提取出来进行测定，并且被解释为是在 50%(或 x%)矿化点时挥发放射性的百分率。

　　10 . 1 . 3 残留物试验

　　“在 50%(或 x%)矿化点，通过提取土壤得到受试物可提取的与不可提取残留物部分加上降解产物的放射性水平。”

　　10 . 2 试验报告

　　试验报告应包括以下内容：

　　a) 受试物通用名、化学名、CAS号、分子式、结构式;

　　b ) 受试物的使用数量;

　　c) 受试土壤的特性数据;

　　d) 试验日期等。

　　10 . 3 评价和结果说明

　　尽管此试验是利用经过扰动的土壤，在实验室的人工条件下进行的，但由于所用的是标准化的土壤，测试数据可互相比较，并使实验者可以根据此性质，在一定程度内，对受试物进行相对的分类。