GB/T 35519-2017 化学品 稳定转染人雌激素受体转录活性试验 雌激素激动活性法

　　ICS 13 . 300 ; 1 1 . 100 A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35519—2017

　　化学品 稳定转染人雌激素受体

　　转录活性试验 雌激素激动活性法

　　Chemicals—Stablytransfectedhumanestrogenreceptortranscriptional

　　activationassay—Detectionofestrogenicagonistsactivation

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35519—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准 与 经 济 合 作 与 发 展 组 织 ( OECD) 化 学 品 测 试 方 法 No. 455《Performance-Based Test Guideline for Stably Transfected Transactivation In Vitro Assays to Detect Estrogen Receptor Ago- nists》(2012)技术性内容一致。

　　本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC 251)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、复旦大学。

　　本标准主要起草人：陈相、缪文彬、陈青、陈会明、张静、朱洪坤、赵颐晴、蒋伟、姚丽芳、清江、邬春华。

　　GB/T 35519—20 17

　　引 言

　　本标准描述利用稳定转染的细胞系检测雌激素受体激动剂的体外转录激活试验方法，包括原理和功能相似的雌激素受体(Estrogen receptor,ERs)激动剂，旨在促进类似的或者经改进的检测方法符合经济合作与发展组织关于危害评估新方法的验证和认可的指导规范。

　　本标准附录 A 和附录 B 已经经过验证。 附录 A 为利用稳定转染人 ERα 的 hERα-HeLa-9903 细胞系检测化学品雌激素活性的转录激活试验，附录 B为利用能够表达人 ERα 的 BG1Luc-4E2 细胞进行的雌激素受体转录激活试验。 本标准的雌激素受体转录激活试验方法可以在各国间使用，有利于数据互认。

　　1998 年经济合作与发展组织发起优先项 目活动，旨在对现行指导原则进行修订，同时为筛选和测定潜在的内分泌干扰物制定新的指导原则。 经济合作与发展组织的测定、评估潜在内分泌干扰物质的概念框架于 2012 年修订。 概念框架由 5 个阶段组成，不同阶段对应生物复杂性的不同阶段。 本标准是第二阶段的“体外试验，提供内分泌作用机制/通路信息”。本标准是鉴定雌激素受体激动剂的体外转录激活试验方法。

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　　化学品 稳定转染人雌激素受体

　　转录活性试验 雌激素激动活性法

　　1 范围

　　本标准规定了利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验的术语和定义、试验原理、试验方法与步骤、数据和报告。

　　本标准适用于利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验评估化学品类雌激素的生物活性。

　　2 术语、定义和缩略语

　　2 . 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　2 . 1 . 1

　　激动剂 agonist

　　与特定受体结合时能产生某种反应(如转录)的物质。

　　2.1.2

　　拮抗剂 antagonist

　　与受体结合后自身不能引起生物反应，但能阻断或抑制激动剂介导的反应的一类受体的配体或化学品。

　　2.1.3

　　抗雌激素活性 anti-estrogenicactivity

　　一种化学品抑制 17β-雌二醇介导的雌激素受体作用的能力。

　　2.1.4

　　活性炭/葡聚糖处理 charcoal/dextrantreatment

　　细胞培养中的血浆处理方法，可以去除内源性激素和激素结合蛋白。

　　2.1.5

　　细胞毒性 cytotoxicity

　　与平行的溶剂对照组相比，对细胞结构或功能产生毒害并最终导致细胞死亡的毒性效应，表现为毒物暴露后细胞数量减少或细胞功能减弱。

　　2.1.6

　　雌激素活性 estrogenicactivity

　　化学品模拟 17β-雌二醇结合和激活雌激素受体的能力。

　　2.1.7

　　性能标准 performancestandard

　　评估一种试验方法在机制和功能方面是否与验证方法一致的标准。 包括：

　　— 基本的试验方法;

　　— 在验证方法中用来证明试验方法可行的最少的对照化学品清单;

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　　— 以验证试验为标准，测试试验通过对照品验证其准确性和可靠性的水平。

　　2.1.8

　　稳定转染 stabletransfection

　　当 DNA被转染到培养的细胞后，整合到细胞基因中，稳定的表达所转染的基因，形成的细胞克隆用稳定标志物进行筛选(如 G418 抗性)。

　　2.1.9

　　转录激活 transactivation;TA

　　响应特定化学信号(如雌激素与雌激素受体结合信号)的信使核糖核酸合成。

　　2 . 1 . 10

　　弱阳性对照 weakpositivecontrol

　　对照品中阳性反应较弱的化学品，用于确保试验的准确性。

　　2 . 1 . 1 1

　　溶剂对照 vehiclecontrol;Vc

　　溶剂单独作为对照。

　　2 . 1 . 12

　　验收标准 accceptabilitycriteria

　　符合试验控制和参考标准的最低标准。

　　2 . 1 . 13

　　准确性 accuracy

　　试验结果与公认参考值的接近程度，衡量试验方法的效能和相关性。

　　2 . 1 . 14

　　熟练度 proficiency

　　检测未知化学品前能正确使用试验方法的能力。

　　2 . 1 . 15

　　参考标准 referencestandard

　　用于证明试验方法合适的对照品。

　　2 . 2 缩略语

　　本标准所用缩略语见表 1 。

　　表 1 缩略语

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　　表 1(续)

　　3 试验原理

　　3 . 1 基于效能的试验指导原则中试验方法原理

　　3 . 1 . 1 雌激素与受体的相互作用调控基因转录，诱导和阻滞细胞的复制，影响细胞增殖、胎儿发育和生殖功能。 干扰正常的雌激素系统会对机体的生殖发育产生不良影响。

　　3 . 1 . 2 化学品与特异受体直接或间接作用调节报告基因的转录。 转录激活试验广泛用于评估受特定核受体(如雌激素受体)调控的特定基因表达，用于受雌激素受体调控的雌激素转录激活的检测。 雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)至少存在两种亚型，即 α 和 β 亚型，由完全不同的基因编码，具有不同的组织分布、配体相对结合力和生物学功能。 受体 ERα 只是对经典的雌激素反应进行调节，目前正在研发的模型主要是测定与 ERα 有关的 ER 活性。 试验原理是化学品与配体结合后激活 ER,然后受体-配体复合物结合到脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)反应元件，转录激活报告基因，使细胞中标志蛋白表达增加。 有两种不同的报告反应：在荧光素酶系统里荧光素酶使荧光素底物转变成生物荧光产物，用光度计定量检测;利用荧光蛋白和 LacZ基因，LacZ基因能编码 β-半乳糖，将无色底物 X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)转化成蓝色产物，用光度计检测。

　　3 . 2 试验的使用范围和局限性

　　3 . 2 . 1 本方法是体外检测化学品结合 ERs 引发的转录激活活性，因此试验结果不能直接推演到体内有

　　复杂信号和调控机制的正常内分泌系统。

　　3 . 2 . 2 雌激素受体介导的转录激活是内分泌紊乱的主要机制之一，还有一些其他的内分泌干扰机制，包括：

　　— 与内分泌系统中其他受体和酶作用;

　　— 激素合成;

　　— 激素的代谢激活和/或失活;

　　— 靶组织激素的分布;

　　— 机体中激素的清除。

　　3 . 2 . 3 本方法描述了化学品激活(如激动剂)而不是抑制(如拮抗剂)ER 依赖的转录能力。 因此，试验结果为阴性的化学品应在进行了 ER 结合试验或在检测 ER 拮抗剂的试验之后，才能得出化学品不能结合 ER 的结论。

　　4 试验方法与步骤

　　4 . 1 方法

　　本方法是一种适用于由一个或多个雌激素反应元件调控的使用稳定转染/内源性 ERα 受体和稳定

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　　转染报告基因的方法，但是也适用于其他的雌激素受体如 ERβ。

　　4 . 2 对照

　　应确定参照雌激素和对照物。 合适的对照(阴性、溶剂和阳性对照)，确认试验是否在同等的试验条件下进行。

　　4 . 3 质量控制规程

　　标准质量控制规程应能确保细胞系稳定传代，无支原体污染及对雌激素反应良好。 细胞系应保证其良好的特性和不受污染(如真菌、酵母菌核病毒)。

　　4 . 4 实验室操作熟练程度验证

　　按照本方法检测未知化学品前，每个实验室应能熟练地检测已知的标准品，以确保试验系统良好。

　　4 . 5 验收标准的测试运行

　　所有的验收标准应确保试验的有效性。 测试的接受与否取决于每个试验的参照雌激素和对照品的检测结果。 参照雌激素的 PC50 或 EC50 应符合选择的试验的验收标准(稳定转染激活试验见附录 A, BG1Luc 雌激素受体转录激活试验见附录 B),以及所有的阳性和阴性对照在试验中应有正确的分类。多个实验室参照雌激素曲线拟合参数平均值的标准差或变异系数可以用于验证实验室间的重复性。 还应符合以下验收标准：

　　— 应有足够的数据以定量评估 ER激活作用(效果和效力);

　　— 参照雌激素的参考浓度的平均反应活度不能小于测试方法中溶剂对照的最小特异倍数(对于稳定转染激活试验和 BG1Luc 雌激素受体转录激活试验，最小特异倍数为 4),以保证试验的敏感性;

　　— 化学品浓度应在可溶性范围且不能产生细胞毒性。

　　注 1 : PCx 即所引起的响应水平等于同板的阳性对照物(1 nmol/ L 17β-雌二醇)诱导的响应水平 x%的受试物浓度。

　　注 2 : EC50 即激动剂引起基线(底部)和最大响应(顶部)之间一半时的浓度。

　　5 数据和报告

　　5 . 1 数据分析

　　试验数据可用于阳性和阴性反应分类。 试验系统的使用应符合验收标准，但是即便符合验收标准也不能确保试验得到正确的数据。 重复试验才是保证数据可靠性的最好方法，如果试验数据一致(如两次试验都判断化学品为阳性)，不用重复第三次。 如两次试验结果不一致(如一次判断为阳性，一次为阴性)，或者需更大的把握，则应重复第三次。

　　5 . 2 数据分析标准

　　本试验方法的结果还没有统一的分析方法，但是 ER 激活能力的定性(如阳性/阴性)或定量(如EC50 和 PC50)分析应在科学的数据分析方法下进行，在条件允许的情况下，阳性结果应同时依据反应强度(与溶剂对照和参照雌激素比)和反应浓度(如 EC50、PC50、受试物诱导的最大反应水平等)判断。

　　5 . 3 试验报告

　　试验报告应包括下列信息：

　　a) 受试物 ：

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　　— 鉴定资料和 CAS号(如已知);

　　— 物理性质和纯度;

　　— 与试验实施有关的理化性质;

　　— 受试物的稳定性。

　　b) 溶剂，赋形剂：

　　— 信息描述(特征、供应商及批号);

　　— 选择依据;

　　— 受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性(如已知)。

　　c) 细胞 ：

　　— 细胞种类和来源(是否表达 ER或转染哪种受体);

　　— 分子，包括来源;

　　— 选择能保证稳定转染的方法(适用);

　　— 转染方法与稳定的细胞系是否相关;

　　— 细胞代数(从复苏开始);

　　— 细胞复苏时的传代数;

　　— 细胞维持方法。

　　d) 试验条件：

　　— 溶解性;

　　— 评估活性的方法;

　　— 培养基成分和二氧化碳浓度;

　　— 受试物浓度;

　　— 添加的溶媒及受试物体积;

　　— 培养温度和湿度;

　　— 细胞染毒持续时间;

　　— 细胞开始时和处理期间的密度;

　　— 阳性和阴性对照物;

　　— 报告试剂(产品名称、供应商和批号);

　　— 判断试验结果是阴性、阳性或双向的标准。

　　e) 验收检查：

　　— 每个测试板的诱导效果和根据历史对照判断是否达到试验方法的最低要求;

　　— 阳性对照和参考化学品的 lgEC50、lgPC50 和 Hill斜率值。

　　f) 结果 ：

　　— 原始数据和标准化处理后的数据;

　　— 最大诱导水平;

　　— 细胞毒性数据;

　　— 最低有效浓度(如有);

　　— 受试物诱导的最大反应水平，诱导最大反应水平的受试物浓度，PC50 和/或 PC10 值(如适用);

　　— 剂量-反应关系(如有);

　　— 统计分析，包括误差和可信度(如标准差、变异系数或 95%置信区间)及如何获取这些数值的描述(如有)。

　　g) 结果讨论。

　　h) 结论。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　用稳定转染人 ERα 的 hERα-HeLa-9903 细胞系检测化学品雌激素活性的转录激活试验

　　A.1 范围

　　本附录规定了用 hERα-HeLa-9903 细胞株对由人雌激素受体α 介导的雌激素活性物质进行检测的试验方法。

　　本附录适用于评估一种化学品是否具有作为 ERα 配体并激活雌激素介导反应的能力。

　　A.2 试验原理

　　A.2 . 1 本试验用于检测雌激素受体和配体结合后对转录活性的影响，与配体结合后，受体配体复合物发生转移到细胞核与雌激素反应元件特异性结合，并转录激活荧光素酶报告基因，引起细胞内荧光素酶表达增加。 荧光素是一种酶作用底物，经与荧光素酶作用，可发出荧光，利用光度计能够对这种产物进行定量测定。

　　A.2 . 2 本附录试验体系是 hERα-HeLa-9903 细胞株，它来 自于人子宫颈肿瘤细胞，具有两个稳定的插入序列：hER表达序列(编码全长人雌激素受体)和荧光素酶报告基因序列，该序列带有鼠乳房肿瘤病毒启动子引导的雌激素反应元件。 已证明鼠乳房肿瘤病毒启动子起始基因表达效果最好，因此该试验体系 hERα-HeLa-9903 可以测定受试物对 ER转录活性的影响。

　　A.2 . 3 解释本试验数据的依据是：受试物所诱发的效应是否等同或超过最大浓度(1 nmol/L) 阳性对照物 17β-雌二醇(E2)诱导效应的 10% 。

　　A.3 试验方法与程序

　　A.3 . 1 准备

　　A.3 . 1 . 1 细胞

　　试验应使用外源转染稳定表达 ER 的 hERα-HeLa-9903 细胞株。 细胞株均不得携带支原体。

　　为了监测细胞株的稳定性，试验应使用 17β-雌二醇，17α-雌二醇，17α-甲基睾激素和肾上腺酮作为对照品，并在试验中至少测定一次该物质的剂量-反应曲线，见表 A. 1,测定结果应与表 A. 1 中提供的结果一致。

　　表 A.1 稳定转染激活试验 4 种对照品可接受范围值(均数 ±2×标准差)

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　　表 A.1(续)

　　A.3 . 1 . 2 培养液和培养条件

　　培养基：无酚红的 Eagle’s 基本培养基 (Eagle’s Minimum Essential Medium, EMEM) +60mg/L的抗菌素 卡 那 霉 素+右 旋 糖 苷 包 裹 的 木 炭 处 理 的 胎 牛 血 清 ( dextran-coated-charcoal-treated fetal bovine serum, DCC-FBS);培养条件：5%二氧化碳(CO2) , 37 ℃ ± 1 ℃条件培养。

　　A.3 . 1 . 3 细胞培养

　　A.3 . 1 . 3 . 1 当细胞汇合度达到 75%~90%时，进行细胞传代，一般在 100 mm 细胞培养皿中加 10 mL细胞液，密度为 0.4 × 105 ~1 × 105 细胞/mL。用含 10%FBS-EMEM(或加有 DCC-FBS 的 EMEM)悬浮细胞，然后移入 96 孔细胞培养板中，每孔细胞密度为 1 × 10 4 细胞/100 μL。 孵育 3 h 后细胞染毒。 其中试验所用塑料器皿不能有雌激素活性物质污染;细胞应至少传代 1 次，但不超过 40 次，hERα-HeLa- 9903 细胞株使用不应超过 3 个月。

　　A.3. 1 .3.2 DCC-FBS按本方法配置或直接购买，用右旋糖苷包裹木炭(dextran-coated-charcoal, DCC)处理血清是清除血清(含细胞培养液)中雌激素化合物的常用方法，其目的是为了排除与血清残留雌激素有关的响应偏差。 500 mL 的胎牛血清可以用这种方法进行处理。 材料包括活性炭、右旋糖苷、氯化镁六水合物、蔗糖、1 mol/ L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(pH 7 . 4)、超纯水。 设备和材料包括经高压灭菌的玻璃容器、离心机(温度可设定在 4 ℃ ) 。具体方法为第 1 天配制右旋糖苷包裹的木炭悬浮液，将含有 15 mmol/L MgCl2 、0.25 mol/L蔗糖、2.5 g木炭、0.25 g右旋糖苷和 5 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的 1L超纯水在 4 ℃搅拌、过夜。 第 2 天将配制好的悬浮液分置于多个 50mL 离心管中，以10 000 r/ min 4 ℃离心 10 min。 弃去上清液，将一半的木炭沉积物于 4 ℃储存以便第 3 天使用。 将另一半木炭用胎牛血清悬浮(为避免沉淀，使用胎牛血清前应对其进行缓慢溶解)，在 56 ℃进行加热去活处理，时间 30 min,然后将其转入经高压灭菌的玻璃容器中。 在 4 ℃下轻轻搅拌该悬浮液，过夜。 第 3天将胎牛血清悬浮的悬浮液分置于多个离心管中，以 10 000 r/ min 在 4 ℃离心 10 min,收集胎牛血清并将其转入到第 2 天制备储存的新木炭的沉积物中。 在 4 ℃下用经高压灭菌的玻璃容器悬浮木炭沉积物并轻轻搅动悬浮液，过夜。 第 4 天以 10 000 r/min在 4 ℃将悬浮液离心 10 min,用 0 . 2 μm灭菌滤膜过滤上清液。 这种 DCC处理的胎牛血清应保存在 -20 ℃,在此储存条件下可使用一年。

　　A.3 . 1 . 4 受试物准备

　　受试物应溶于 DMSO 或其他合适的溶剂中，并用同种溶剂按 1 : 10 进行梯度稀释。

　　A.3 . 2 试验条件

　　A.3 . 2 . 1 溶剂

　　用 DMSO(用量不应超过 0 . 1%)或适当溶剂(水 、纯度 95%~100%的乙醇)作平行溶剂对照，其使

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　　用浓度在阳性、阴性对照和受试物中应一致。

　　A.3 . 2 . 2 对照

　　A.3 . 2 . 2 . 1 阳性和阴性对照品：试验前应对试验体系的反应性进行验证，用适当浓度的强雌激素(E2) 、弱雌激素(17α-雌二醇)、非常弱的雌激素(17α-甲基睾丸激素)和阴性化学品( 肾上腺酮)进行验证。 表A. 1 中已列出验证试验的可接受范围值。 每项试验中都应同时包括这 4 种对照品，且这 4 种物质的试验结果应在可接受范围值之内(见表 A. 1) 。

　　A.3 . 2 . 2 . 2 阳性和溶剂对照：在每个培养板中应至少检测 3 组阳性对照(1 nmol/ L 的 E2) 和溶剂对照(VC) 。若阳性对照所用溶剂不同于受试物所用溶剂时，则需另设对照。

　　A.3 . 2 . 2 . 3 诱导率：每个培养板中阳性对照组(1 nmol/ L E2)荧光素酶反应均值应为溶剂对照组的 4 倍以上，PC10 测量值达到同时测定的溶剂对照值的(1+2×标准差)倍以上，这是试验的质量控制标准要求。

　　A.3 . 2 . 3 染毒浓度

　　A.3 . 2 . 3 . 1 在开展正式试验前应进行预试验，摸清试验剂量范围，弄清楚受试物是否存在溶解性和细胞毒性问题。 受试物从低浓度到最大浓度(可用 μL/mL、mg/mL 和 mmol/ L 表示)进行预试验。 根据受试物对细胞产生的毒性作用程度和受试物溶解度，从最大允许浓度开始，逐级稀释(如 1 mmol/ L 、 100 μmol/L、10 μmol/L等)对受试物进行首轮确证性测定，并对产生的现象如浑浊、沉淀或细胞毒性等进行记录。 基于试验结果再进行第二轮甚至第三轮的测定，并调整试验浓度避免出现沉聚物或产生过大的细胞毒性，已获得良好的剂量-反应曲线。

　　A.3 . 2 . 3 . 2 对于 ER激动剂来讲，细胞毒性会改变特有的 S形反应曲线，可以利用细胞毒性测定试验来提供细胞存活力的信息，若某浓度的细胞毒性大于或等于 20%,可认为具有细胞毒性，在试验中应避免使用该浓度及以上浓度进行试验。

　　A.3 . 3 试验操作方法

　　A.3 . 3 . 1 受试物处理

　　A.3 . 3 . 1 . 1 可以按照以下步骤对化学品进行稀释和染毒：根据预试验结果，将不同浓度的受试物加入培养板 的 每 孔 中(例 如 1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L、 1 nmol/L、100 pmol/L 和 10 pmol/L) , 每 个 浓 度 3 次 平 行 试 验。用 溶 剂 将 1. 5 μL 受 试 物 稀 释 至

　　500 μL,从中取出 50μL稀释液加入到每孔含有 10 4 细胞/100 μL 的培养板。 每孔最终体积为 150 μL。添加受试物后，孵育 20h~24 h,诱导荧光素酶表达。

　　A.3 . 3 . 1 . 2 在不同工作日用相同化学品进行重复性验证试验以确保独立性。

　　A.3 . 3 . 1 . 3 对于强挥发性化学品，推荐使用细胞培养板密封盖，避免临近的对照孔产生假阳性结果;同时为避免边缘效应可适当调整培养板的试验布局(如不用边缘孔)。

　　A.3 . 3 . 1 . 4 每次操作应设对照组(E2、17α-雌二醇、17α-甲基睾丸激素和肾上腺酮)进行检测(表 A. 2) 。受试物及对照品的排列情况见表 A. 3 。

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　　表 A.2 试验培养板中对照品浓度安排

　　表 A.3 试验培养板中受试物测试浓度及试验对照安排示例

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　　A.3 . 3 . 2 荧光素酶试验

　　可根据所用光度计的灵敏度选择相应的荧光素酶试剂。 如果使用标准化荧光素酶检测体系，则在添加试验底物前需使用细胞裂解液裂解细胞。

　　A.4 资料和报告

　　A.4 . 1 数据处理

　　为获得阳性对照(1 nmol/ L E2) 的相对转录活性，按以下步骤分析来自同一块板的荧光信号(用其他效果等同的数学方法也可以)：计算溶剂对照的均值。 用每孔测定数值减去溶剂对照均值，将数据标准化。 计算标准化处理过的阳性对照均值。 将每孔测得的标准化处理数值除以标准化处理阳性对照的均值( 阳性对照 =100%) 。每孔得到的最后数值是与阳性对照响应值比较的相对转录活性。 计算受试物每个浓度组的相对转录活性均值。 目前存在两种形式的结果表示：平均转录活性(响应值)和产生响应值的浓度。

　　A.4 . 2 结果的评价和解释

　　A.4 . 2 . 1 EC50、PC50 和 PC1 0

　　A.4 . 2 . 1 . 1 在计算 EC50 时应有完整的剂量-反应曲线，但由于试验浓度的局限性(如由于细胞毒性或溶解性问题)，该曲线并不总能得到。 但是，EC50 和最大诱导水平(相当于 Hill 方程的最大值)可以提供很多试验信息，因此应尽可能将这些试验参数在报告中体现出来。 在计算 EC50 和最大诱导水平时，应使用合适的统计软件(如 Graphpad Prism 统计软件)。 如果用 Hill’s 逻辑方程处理浓度反应数据时， Hill’s逻辑方程的底部定为零，使用式(A. 1)计算 EC50 :

　　Y=L ……………………( A.1 )

　　式中：

　　Y — 反应值，以“S”形曲线由底部开始延伸至顶部;

　　L — 最小反应值;

　　T — 最大反应值;

　　lgEC50—最大和最小反应中间值的对数;

　　X — 浓度的对数值;

　　Hill — 曲线的斜率。

　　A.4 . 2 . 1 . 2 每个受试物应计算以下信息：RPCmax是受试物诱导产生的最大反应值，以 1 nmol/ L E2 诱导产生的反应百分率表示;应获得阳性对照诱导产生 PC10 的浓度以及 PC50 的浓度(如有)。

　　A.4 . 2 . 1 . 3 通过 X-Y 坐标上的两点数值可以推算出 PCx 值;这两点分别紧靠 PCx值，分别高于和低于PCx 值，坐标值分别为(a，b)和(c，d)，PCx 值用式(A. 2)进行计算 ：

　　log[PCx]=log[c]+(x-d)/(d-b) ……………………( A.2 )

　　重复试验，试验结果应满足以下要求：

　　— 操作标准要求;

　　— 阳性对照(1 nmol/ L E2)荧光素酶反应活性均值应大于或等于 4 倍同板溶剂对照均值;

　　—PC10 测量值达到同时测定的溶剂对照值的(1+2×标准差)倍以上。

　　—4 个对照品的试验结果应在可接受范围内(表 A. 1) 。

　　— 有可重现性。

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　　A.4 . 2 . 2 数据阐释标准

　　A.4 . 2 . 2 . 1 阳性结果的判断由效应强度和效应浓度来决定。 以是否达到 50% (PC50)或 10% (PC10) 的浓度作为判断标准。 如果在两次检测中两次或三次检测中两次所获得的受试物诱导产生的最大反应值大于或等于阳性对照相应值 10%,可判定结果为阳性。 如果在两次检测中两次或三次检测中两次所获得的受试物诱导产生的最大反应值小于阳性对照相应值 10%,可判定结果为阴性。

　　A.4 . 2 . 2 . 2 计算 PC10、PC50 和 PCmax 。试验应至少获得两个 PC10 或 PC50 值 。用于计算 PC10 的 3 份平行原始数据的变异系数值(如荧光强度数据)不应超过 20%。

　　A.4 . 2 . 2 . 3 如果想通过本试验原则获得更多的有关阳性测试化学品除了筛选和优选以外的信息，特别是化学品的 PC10 -PC49 以及那些导致荧光素酶过度激发的可疑化学品时，应清楚试验所观察到的荧光素酶活性只是使用 ERα 拮抗剂所产生的 ERα-特有的反应。

　　A.4 . 2 . 2 . 4 可以用评估非受体介导的发光信号来评价假阳性。 非 ER介导的荧光素酶基因表达或非特异荧光的产生都可产生假阳性。 在剂量-反应曲线不完整或不正常的时候会产生这种情况。 如果怀疑有这种情况产生时，应检测 ER 拮抗剂(如 4-羟基三苯氧胺无毒的浓度)的作用效果。 纯拮抗剂 ICI 128780 可能不太适用于这方面的检测，因为在一定浓度下它会减少溶剂对照值，从而影响试验数据的分析。 为确保该方法的有效性，在同一块板中应进行以下测试：未知化合物在 10 μmol/L 的 4-羟基三苯氧胺存在及不存在情况下的 ER 转录活性检测;溶剂对照(3 个平行);4-羟基三苯氧胺(3 个平行); 1 nmol/L的 E2(3 个平行)作为阳性对照;1 nmol/ L 的 E2+ 4-羟基三苯氧胺(3 个平行)。板中所有孔都应保证相同的溶剂浓度。 如果未知化学品产生的诱导活性不受 ER 拮抗剂的影响，则试验结果归为“阴性”;如果未知化学品产生的激活活性被完全抑制时，用判定标准进行认定;若低剂量产生的激活活性等同于或超过 PC10 响应时，未知化学品被抑制的程度等于或超过 PC10 反应，未经 ER 拮抗剂处理和经 ER拮抗剂处理的孔之间响应的差异可以被计算出来，且这种差异可被认为是真实响应，应用于对具体参数的计算以便对化合物归类做出判定。 最后进行数据分析，检查相同条件相同处理孔间的变异值。计算溶剂对照均值;没有添加 4-羟基三苯氧胺的每孔值减去溶剂对照均值;计算 4-羟基三苯氧胺均值;添加 4-羟基三苯氧胺的每孔值减去溶剂对照均值;计算阳性对照均值;计算与阳性对照相关的所有孔的相对转录活性。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　鉴定雌激素受体激动剂的 BG1LuC雌激素受体转录激活试验方法

　　B.1 范围

　　本附录规定了以 BG1Luc4E2 细胞系为试验体系的雌激素受体转录激活的试验方法。

　　本附录适用于多种化学品是否具有雌激素受体转录激活能力的筛选。

　　B.2 试验原理

　　B.2. 1 本标准用化学发光法检测 hERα 和 hERβ介导的转录激活。 化学发光具有高信倍比的优点，在生物试验中应用广泛，然而，化学品可能会导致试验中荧光素酶出现蛋白稳定化，造成发光抑制或增强;此外，在一些基于荧光素酶的 ER报告基因试验中，当植物雌激素浓度大于 1 μmol/L,荧光素酶报告基因会过度激活而产生非受体介导的基因表达。 由于剂量-反应曲线提示该报告基因系统只在低浓度时激活，在稳定转染的 ER试验中植物雌激素或相似化学品浓度较高时，应特别注意其是否会产生荧光素酶报告基因的过度激活。

　　B.2 . 2 雌激素受体和配体的结合后，受体配体复合物转移到细胞核与雌激素反应元件特异性结合，并激活报告基因(luc),生成荧光素酶，在加入底物后产生荧光可用光度计检测。 BG1Luc 雌激素受体转录激活试验用 BG1Luc4E2 细胞系来检测化学品体外雌激素激活能力。 BG1Luc4E2 细胞系来源于 BG-1永生的人源性腺癌细胞，可以表达雌激素受体 α 和 β,而且稳定转染了质粒 pGudLuc7 . ERE。 这种质粒包含三个主要元件，包括小鼠乳房肿瘤病毒启动子、上游雌激素反应元件和荧光素酶基因。 BG-1 稳定转染了 luc报告基因，由小鼠乳房肿瘤病毒启动子上游的 4 个雌激素反应元件调控，小鼠乳房肿瘤病毒启动子与其他激素只有较小的交叉反应性。

　　B.2 . 3 在结果的判断中，阳性反应是指剂量-反应曲线至少包含了 3 个不重叠的误差棒(平均值 ±标准差)，或者是波幅(标准化的 RLU)改变至少是对照化学品(17β-雌二醇)最大值的 20%。

　　B.3 试验方法与程序

　　B.3 . 1 准备

　　B.3 . 1 . 1 细胞

　　细胞株是稳定转染的 BG1Luc4E2 细胞系，为保证细胞系的稳定性和完整性，细胞复苏后至少在细胞维持液中培养一代，细胞传代不能超过 30 次，BG1Luc4E2 细胞系生长 30 代大约需要 3 个月。

　　B.3 . 1 . 2 培养液和培养条件

　　培养基：RPMI 1640 培养基 + 0.9%青霉素-链霉素 + 80%胎牛血清;培养条件：37 ℃ ± 1 ℃ ,湿度 90% ±5% , 5.0% ±1% CO2 条件下培养。

　　B.3 . 1 . 3 细胞培养

　　细胞汇合度达到 80%时传代，在无雌激素环境中孵育 48 h后植入 96 孔板，以检测化学品的雌激素

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　　诱导作用。无酚红的 DMEM(Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium)培养基(不含有雌激素)，添

　　加 4 . 5%活性炭/葡聚糖处理过的胎牛血清、1 . 9% L-谷氨酰胺和 0 . 9% 青霉素-链霉素，所有的塑料器具需无雌激素活性物质污染。

　　B.3 . 1 . 4 受试物准备

　　受试物用 100%DMSO(或其他合适溶剂)溶解，然后在无雌激素培养基中逐级稀释到合适的浓度。试验前，受试物溶解和稀释前室温平衡，受试物溶液现配现用且无沉淀和浑浊。 参考标准化学品和对照可一次多配一些，但对照的稀释和受试物溶液应在试验前现配现用且在 24 h 内用完。

　　B.3 . 2 试验条件

　　B.3 . 2 . 1 溶剂

　　水、乙醇(纯度 95%~100%)和 DMSO是比较合适的溶剂。 若使用 DMSO,其用量不应超过 0 . 1% (体积分数)。参考标准化学品和对照应 100%溶解于溶剂，然后在无雌激素培养基中稀释到合适的浓度。

　　B.3 . 2 . 2 染毒浓度

　　剂量范围试验包括 7 个按 1 ∶ 10 梯度稀释的浓度，每个浓度检测两次。 受试物先取最大浓度 1 mg/mL(约 1 mmol/L)进行检测，剂量范围试验可决定以下指标：综合试验中受试物起始检测浓度以及受试物的稀释比例(1 ∶ 2 或 1 ∶ 5) 。在试验方案、剂量范围试验和综合试验中对细胞活性/毒性评估。细胞毒性测试是一种分级定性目测观察试验，可以用来评估 BG1Luc 雌激素受体转录激活试验中的受试物对细胞生存率的影响，也可以用定量测试方法。 受试物浓度不能使细胞存活率降低高于 20%。

　　B.3 . 2 . 3 对照

　　B.3 . 2 . 3 . 1 溶剂对照：试验应设溶剂对照，BG1 Luc 雌激素受体转录激活验证试验的溶剂是 1%(体积分数)DMSO,如果用其他溶剂，所有的参考标准化学品、对照和受试物应使用相同的溶剂。

　　B.3 . 2 . 3 . 2 参考方法如下：

　　— 剂量范围试验：参考标准化学品是 E2,剂量范围试验的参考标准化学品包括连续稀释的 4 个浓度的 E2(1.84×10- 10 mol/L、4.59 × 10- 11 mol/L、1.15 × 10- 11 mol/L和 2.87 × 10- 12 mol/L), 每个剂量测量 2 次 。

　　— 综合试验：参考标准化学品是 E2,浓度包括 1 ∶ 2 倍稀释的 11 个浓度(3 . 67 × 10 - 10 mol/ L~ 3.59 × 10- 13 mol/L), 每个剂量测量 2 次。

　　B.3 . 2 . 3 . 3 弱阳性对照：弱阳性对照是 9 . 06 × 10 - 6 mol/L用无雌激素培养基培养的 p, p′-甲氧氯。

　　B.3 . 2 . 3 . 4 诱导率：通过以 DMSORLU 平均值为参照的最高 E2 的 RLU 平均值来评估，结果应大于4 倍平均 DMSO 的 RLU值。

　　B.3 . 2 . 3 . 5 验收标准如下

　　— 剂量范围试验：诱导反应值应通过以 DMSORLU平均值为参考的最高 E2 的 RLU平均值，一般能达到 5 倍平均 DMSO 的 RLU值，但是大于或等于 4 倍就可以接受;DMSO 对照结果：溶剂对照 RLU值应在历史溶剂对照平均 RLU值的 2 . 5 倍标准差范围内;如果标准不能都符合则应重做。

　　— 综合试验：应同时满足剂量范围试验验收标准和以下标准，E2 的剂量-反应曲线应是 S 形，至少有 3 个值在线性剂量-反应曲线以内;甲氧氯对照 RLU值应大于 DMSO平均值加 3 倍标准差;如果标准不能都符合则需重做。

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　　B.3 . 3 试验操作方法

　　B.3 . 3 . 1 受试物处理

　　B.3 . 3 . 1 . 1 细胞计数并铺于 96 孔板(2 × 105 细胞)中，孵育 24 h, 细胞贴壁后，移除培养基加入添加受试物和对照化学品的无雌激素培养基，孵育 19 h~24 h。

　　B.3 . 3 . 1 . 2 高挥发性的化学品应特别注意，因为它可能会污染对照组出现假阳性反应，因此，试验中推荐使用密封板以有效地隔离每一个板孔。

　　B.3 . 3 . 1 . 3 同一个化学品综合试验的重复应在不同天进行，至少重复两次。 如两次试验结果相悖(如 一次试验结果阳性，另次阴性)或其中一次试验不理想，则应补做第三次试验。

　　B.3 . 3 . 1 . 4 剂量范围试验：用 96 孔板可检测 6 种受试物，每种 7 个浓度，按 1 ∶ 10 梯度稀释，每个浓度 2个孔(见表 B. 1) 。用 4 个浓度的 E2 作为参考标准化学品，每个浓度 2 个孔，另加 4 个孔的 DMSO 溶剂对照。 推荐每孔体积 200 μL,每孔细胞存活率不能小于 80%。

　　表 B.1 剂量范围试验 96 孔板布局

　　注：E2-1~E2-4 为 E2 的浓度(从高到低);TS1-1~TS1-7 为受试物 1 的浓度(从高到低);TS2-1~TS2-7 为受试物2 的浓度(从高到低);TS3-1~TS3-7 为受试物 3 的浓度(从高到低);TS4-1~TS4-7 为受试物 4 的浓度(从高到低);TS5-1~TS5-7 为受试物 5 的浓度(从高到低);TS6-1 ~TS6-7 为受试物 6 的浓度(从高到低);VC 为溶剂

　　对照

　　B.3 . 3 . 1 . 5 综合试验的起始浓度的选择应需遵循以下标准：

　　— 如果受试物剂量-反应曲线在 DMSO 对照值平均值加 3 倍标准差以下，综合试验可以从最大溶解浓度开始 1 ∶ 2 逐级稀释到 11 个不同浓度;

　　— 如果受试物剂量-反应曲线中有大干 DMSO 对照值平均值加 3 倍标准差的点，综合试验的起始浓度应比剂量范围中最高校正 RLU 值高 1 个对数值。 11 个浓度可根据以下标准选择按1 ∶ 2或 1 ∶ 5 稀释：如果按 1 ∶ 2 稀释浓度范围可以覆盖剂量范围试验中剂量-反应曲线中的所有浓度则选择 1 ∶ 2 稀释，否则用 1 ∶ 5 稀释;

　　— 如果化学品在剂量范围试验中呈现双相性的剂量-反应曲线，综合试验中两个时相都应考虑。

　　B.3 . 3 . 1 . 6 综合试验包含 11 个稀释浓度，每个浓度 3 个孔，用 11 个浓度的 E2(表 B. 2) ,每个浓度 2个孔为参考标准化学品 ，另外加 4 个孔的 DMSO 对照和 4 个孔的 p, p′-甲氧氯( 9 . 06 × 10 - 6 mol/ L)对照。

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　　表 B.2 综合试验 96 孔板布局

　　注：E2-1~E2-11 为 E2 的浓度(从高到低);TS1-1~TS1-11 为受试物 1 的浓度(从高到低);TS2-1~TS2-11 为受试物 2 的浓度(从高到低);VC为溶剂对照;Meth 为 p, p′-甲氧氯对照。

　　B.3 . 3 . 2 荧光素酶试验

　　光度计检测的发光范围是 300 nm~650 nm,用软件控制加样体积和测试间隔，每孔的光发射强度用 RLU表示。

　　B.4 数据和报告

　　B.4 . 1 数据处理

　　B.4 . 1 . 1 EC50值(受试物最大有效浓度的-半)

　　可从剂量-反应曲线算出，如果受试物有 1 个或多个浓度阳性，化学品的 EC50 可以用 Hill 函数或其他合适方法计算。 Hill 函数是 4 个参数的逻辑数学模型，反应化学品的剂量-反应关系(典型的 S 型曲线)，用式(A. 1)计算。 此模型可以计算出最大、最小反应值、Hill 斜率和 EC50 的最佳拟合值，在计算EC50 时，应使用合适的统计软件(如 Graphpad PrismR 统计软件)。

　　B.4 . 1 . 2 异常值的处理

　　好的统计分析应易于从 Q检验或其他的检验方法的数据分析中发现和排除不可用的点;参考标准化学品的重复检测(2 次)中，任一浓度的校正 RLU值如果超出历史数据的 20%,则为异常。

　　B.4 . 1 . 3 剂量范围试验中光度值的采集和校正

　　光度值的原始数据应确定是否有异常数据要排除。 应计算以下数据：计算 DMSO 溶剂对照的平均值;用每孔测定数值减去 DMSO溶剂对照均值进行数据标准化;计算参考标准化学品 E2 的平均值;计算受试物平均 EC50 值 。

　　B.4 . 1 . 4 综合试验中光度值的采集和校正

　　光度值的原始数据应确定是否有异常数据要排除。 应计算以下数据：计算 DMSO 溶剂对照的平均值;用每孔测定数值减去 DMSO溶剂对照均值进行数据标准化;计算参考标准化学品(E2) 平均值;计算受试物和 E2 的平均 EC50 值：计算甲氧氯平均校正相当光单位值。

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　　B.4 . 2 结果的评价和解释

　　BG1Luc 雌激素受体转录激活试验是筛选内分泌干扰化学品体内试验证据权证法的一部分，试验的其中一个内容就是判断化学品对雌激素受体是激活还是抑制。 表 B. 3 中显示了 BG1Luc 雌激素受体转录激活验证试验的阳性和阴性判断标准。 EC50 可以用含有 4 个参数的逻辑数学模型 Hill 函数计算。符合验证标准可提示系统运行正常，但不能保证每一步操作都能产生正确的结果。 只有重复试验才是产生正确结果的保证。

　　表 B.3 阳性和阴性标准