GB/T 33120-2016 梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33120—2016

　　梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPearblistercankerviroid

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33120—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国湖北出入境检验检疫局 、中华人民共和国中山出入境检验检疫局 、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局 、中华人民共和国云南出入境检验检疫局 、中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、中华人民共和国检验检疫科学研究院 、华中农业大学植物科技学院 。

　　本标准主要起草人 :王振华、陈定虎、叶芸、徐文兴、徐家文、曾宪东、徐雪、张永江、王翀、李旻、王英超、吴兴海 。

　　梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了梨疱状溃疡类病毒的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于进出境梨树种苗 、组培苗及植株中梨疱状溃疡类病毒的检疫和鉴定 。

　　2 梨疱状溃疡类病毒基本信息

　　学名 :Pearblistercankerviroid。

　　缩写 :PBCVd。

　　异名 :梨泡斑类病毒 。

　　分类地位 :马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae) ,苹果锈皮类病毒属(Apscaviroid) 。

　　传播途径 :通过嫁接 、芽接和刀具机械传播 ,但没有有关介体及种子传毒的报道 。远距离通过种苗调运传播 。

　　梨疱状溃疡类病毒的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　根据梨疱状溃疡类病毒全长 RNA 核酸链中 的 保 守 区 域 设 计 了 一 对 扩 增 该 类 病 毒 全 长 核 酸 的 引物 ,进行 RT-PCR扩增和序列测定 ;根据梨疱状溃疡类病毒全长核酸序列设计与正单链 RNA互补的单链 RNA探针 ,通过杂交信号强弱进行结果判定 。

　　4 仪器设备和主要试剂

　　4. 1 仪器设备

　　超净工作台 、灭菌锅 、制冰机 、高速冷冻离心机 、超低温冰箱 、常规冰箱 、涡旋振荡器 、微量进样器 、垂直电泳槽 、PCR仪 、凝胶成像系统 、杂交炉 、交联仪 、杂交管 、化学发光检测仪等 。

　　4.2 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 。RT-PCR试剂见附录 B;分子杂交试剂见附录 C。

　　5 症状观察

　　取样品量 1% ~ 5%(若样品少可适量增大比例) 的种苗进行检查 。检查梨疱状溃疡类病毒侵染症状 ,树皮上形成疱状物或树皮开裂 、溃疡 、鳞状表皮或表皮深裂 ,树势衰退 。

　　GB/T 33120—2016

　　6 实验室鉴定

　　6. 1 RT-PCR检测

　　RT-PCR检测见附录 B。

　　6.2 分子杂交检测

　　分子杂交检测见附录 C。

　　7 结果判定

　　在每次检测中阴性对照和空白对照均表现为阴性 ,而阳性对照表现为阳性 ,则说明检测体系可靠 ,在此条件下 ,如果样品经 RT-PCR 和分子杂交两种检测方法均为阳性反应 ,并经测序验证 ,则可判定样品中带有梨疱状溃疡类病毒 ;如果 RT-PCR 检测和杂交检测结果均为阴性 ,则可确定样品不带有梨疱状溃疡类病毒 。

　　8 样品保存

　　8. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出梨疱状溃疡类病毒的样品应嫁接在砧木上 ,温室大棚种植隔离保存 , 同时 -70℃超低温保存 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　8.2 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法 、RT-PCR检测结果图片 、核苷酸测定序列 、分子杂交检测结果图片等 ,并要有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　梨疱状溃疡类病毒其他信息

　　A. 1 地理分布

　　法国 、西班牙 、意大利 、日本 、希腊 、突尼斯 、马耳他 、阿根廷 、中国(湖北和新疆) 。

　　A.2 寄主范围

　　目前 报 道 的 寄 主 范 围 限 于 蔷 薇 科 (Rosaceae) 的 梨 属 (Pyrus) 、苹 果 属 (Malus) 和 山 楂 属(Crataegus)植物 。梨属种包括杜梨(P. betulifolia) 、豆梨(P. calleryana) 、西洋梨(P. communis) 、沙梨(P. serotina)雪梨(P. nivalis)等 ;苹果和山楂属的个别种如山丁子(M. baccata) 、八棱海棠(M. robusta)和山楂(C. monogyna)等 。

　　A.3 基因组特征

　　梨疱状溃疡类病毒为一共价闭合环状的单链 RNA分子 ,长约 314个碱基 。

　　序列(NCBI登陆号 :NC_001830)如下 :

　　CUUUCCUGAGGUUCCUGUGGUGCUCCCCUGACCUGCGUUCCAAAAAGCGAAAAAGUGAGAGGCCCU AGGGGCUUCUCGGCUCGUCGUCGACGAAGGGUCUAGAAGCCUGGGCGCUGGCUGGAGCGCGCGGCU GUGAGUAAUCGCUCCUUUGGAGAAGAAAACCAGCGUUGCUUCCUGCCUGAGCCUCGUCUUCUG UCCCGCUAGUCGAGCGGACAACCCGAGCACCGCCGAAGCGCUUUUUUCUUUUAUAGCAGCUUGG CUUCGCGGCGAGGGUGGAAGUUUACCGCGGACCCCCGAGAGGAGGCCCUCGGGUCC

　　A.4 症状

　　梨疱状溃疡类病毒能潜伏侵染很多西洋梨(P. communis) 商业品种 , 叶片及果实不表现任何病理症状 。在一些敏感品种上仅在树皮上表现症状 ,侵染的第二年在树皮上形成疱状物或树皮开裂 ,并逐步转变为溃疡 、鳞状表皮或表皮深裂 ,进而树势衰退 ,导致梨树得病后 5 年 ~ 8 年死亡 。 图 A. 1 为该病毒在不同梨品种枝干上的溃疡症状 。

　　注: 引自 http://www-intranet.angers.inra.fr/dossiers/virus/fichvir3. html。

　　图 A. 1 梨疱状溃疡类病毒在不同梨品种枝干上的溃疡症状

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　RT-PCR检测方法

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 核酸提取和 RT-PCR相关试剂

　　DEPC处理超纯水 :取制备好的去离子水 500 mL,加入 500 μLDEPC摇床振荡过夜 , 高温高压灭菌后室温保存 。

　　1 mol/LTris-HCl(pH 8.0) :称取 12. 11gTris,加 50mL DEPC处理超纯水溶解 ,用浓 HCl调 pH值至 8. 0,定容至 100 mL,高温高压灭菌后室温保存 。

　　0. 5 mol/L EDTA (pH 8. 0) :称取 18. 61 g Na2EDTA · 2H2 O,加 80mL处理超纯水溶解 ,用约 2 g NaOH 调 pH 值至 8. 0,加 DEPC 100 μL,定容至 100 mL,摇床振荡过夜 ,高温高压灭菌后室温保存 。

　　10×TE (pH 8. 0) :取 1 mol/LTris-HCl(pH 8. 0) 10mL和 0. 5 mol/LEDTA (pH 8. 0) 2 mL,加50 mL DEPC处理超纯水溶解 ,定容至 100 mL,高温高压灭菌后室温保存 。

　　10×STE溶液 :取 1 mol/LTris-HCl(pH 8. 0) 10mL、5 mol/L NaCl20mL和 0. 5 mol/LEDTA (pH 8. 0) 2 mL,加 50 mL DEPC处理超纯水溶解 ,调 pH值至 6. 8,定容至 100 mL,高温高压灭菌后室温保存 。

　　10% SDS:称取 10 g SDS,加 80 mL超纯水溶解 ,定容至 100 mL后室温保存 。

　　3 mol/L乙酸钠(pH 5. 2)溶液 :称取 40. 8 gNaAc · 3H2 O,加 40 mL超纯水溶解 ,用冰乙酸调 pH值至 5. 2,定容至 100 mL,加 40 μLDEPC摇床振荡过夜 ,高温高压灭菌后室温保存 。

　　酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) :取饱和酚 25 mL、三氯甲烷 24 mL、异戊醇 1 mL,充分混匀后 ,用 TE(pH 8. 0)覆盖 ,棕色瓶中保存 。

　　三氯甲烷 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1) :取三氯甲烷 48mL、异戊醇 2 mL,充分混匀后 ,TE(pH 8. 0)覆盖 ,棕色瓶中保存 。

　　反转录酶 M-MLV、dNTPs、RNA酶抑制剂(Rnasin) 、TaqDNA聚合酶和 CF-11纤维素 。

　　B. 1.2 PAGE凝胶电泳的相关试剂

　　30%丙烯酰胺 :在 70mL蒸馏水中加入 29g丙烯酰胺(acrylamide, Acr)和 1 gN ,N'-亚甲基双丙烯酰胺(N ,N'-methylene-bis-acrylamide, Bis) ,加热溶解后 ,定容至 100 mL,置棕色瓶中室温保存 。

　　10%过硫酰铵 :称取 0. 5 g过硫酰铵溶于 5 mL 蒸馏水中 ,4 ℃保存 。

　　5×TBE贮备液 :称取 54gTris,27. 5 g硼酸 ,加 20mL 0. 5 mol/LEDTA (pH 8. 0) ,溶解于适量蒸馏水 ,最后用蒸馏水定容至 1 L,室温保存 。

　　50×TAE:称取 242gTris,溶解于适量蒸馏水 ,加入 57. 1 mL 冰乙酸 ,100mL 500 mmol/LEDTA (pH 8. 0) ,最后用蒸馏水定容至 1 L,室温保存 。

　　B.2 引物

　　正向引物 :5'-GTCTGAAGCCTGGGCGCTGG-3'

　　反向引物 :5'-CCTTCGTCGACGACGAGCCGAG-3'

　　目标扩增产物长度为 314bp左右 。

　　B.3 核酸提取

　　称取 0. 10 g 叶片 ,液氮研磨 ,转入离心管 ;立即加入 600 μL 1×STE,80μL10% SDS,400μL水饱和酚 ,400 μL三氯甲烷 ,涡旋 10 min,12 000 r/min离心 8 min;取上清液于新的离心管中 ,加无水乙醇至终浓度为 30% ,加 10 mg纤维素粉 ,涡旋 10 min,5 000 r/min离心 3 min;弃上清液 ,沉淀中加 1 mL含 30%乙醇的 1×STE溶液洗涤 ,涡旋 3 min,5 000 r/min离心 3 min,弃上清液 ,重复操作 3 次 ;沉淀中加 200μL1×STE洗脱 ,涡旋 3 min,12000 r/min离心 5 min;收集上清液 ,重复操作两次 ,合并两次上清液 ; 加 40μL3 mol/LNaAc (pH 5. 2) , 1 mL无水乙醇 , -20℃沉淀 30min及以上;12000 r/min离心 20 min,沉淀中加 1 mL 80%乙醇 ,上下颠倒 10次 ,12 000 r/min离心 5 min,弃上清液 ; 瞬间离心20 s,吸去多余液体 ,室温干燥 5 min~ 10 min,加 15 μLDEPC处理的去离子水溶解 , -80 ℃冰箱保存备用 。市售商品化 Trizol提取试剂盒不适合梨疱状溃疡类病毒 RNA提取 。

　　B.4 cDNA合成

　　于 0. 2 mL PCR管中加入 DEPC处理去离子水 10 μL、类病毒 RNA 3 μL(50 ng~ 200 ng) , 随机引物 1 μL,95 ℃(或沸水)水浴 7 min,迅速置冰上冷却 3 min;然后加 5×反转录缓冲液 4 μL、10 mmol/L dNTPs、40 U/μL RNA酶抑制剂(Rnasin)0. 5 μL、200 U/μL反转录酶(M-MLV)0. 5 μL,混匀后 37 ℃水浴 1 h;反转录结束后瞬时离心 ,95 ℃(或沸水)水浴 5 min,冰浴 3 min,直接进行 PCR。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　B.5 PCR扩增

　　0. 2 mL PCR管中加入 10×PCR 缓冲液(含 Mg2+ )2μL,dNTPs(10 mmol/L) 0. 5 μL, 同源和互补引物(均为 10 μmol/L)各 0. 5 μL,5 U/μLTaq DNA 聚合酶 0. 25μL,模板 3 μL,加 DEPC处理水至总体积 20 μL。设置阳性对照 、阴性对照及空白对照 。

　　反应程序 :94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 7 min。

　　B.6 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

　　琼脂糖凝胶 :制备 1%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR扩增产物 ,用 DNA Marker作为分子量标记 ,进行电泳分析 。 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性 DNA条带 ,并拍摄记录 。

　　聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分辨率和灵敏度显著高于琼脂糖 ,在所检测样品含量较低情况下或扩增目标条带低的情况下进行 PAGE 电泳分析 。

　　PAGE电泳分析 :配制 30mL6%的非变性聚丙烯酰胺溶液 ,其组成如下 :6 mL30%聚丙烯酰胺 ,6 mL 5×TBE,18 mL 蒸馏水 ,200 μL10% APS,20 μLTEMED,然后灌制电泳胶 。 电泳完成后在脱色摇床上进行硝酸银染色 ,硝酸银染色步骤如下 :凝胶先在固定液(10%乙醇 +0. 5%乙酸) 中固定 5 min,然后直接加入 10%的硝酸银至终浓度为 0. 2% ,染色 5 min,倒掉 ,用蒸馏水洗 2 次 ,每次 1 min,然后加入显色液(3%NaOH+0. 5%HCHO)至显出清晰的条带 ,蒸馏水冲洗 2 次 ,记录结果 ,封胶保存 。

　　B.7 结果判定

　　阳性对照在 314bp左右处有扩增片段 ,而阴性对照和水空白对照无此条带 ,将该目标条带回收克隆后经测序验证 ,与参考序列有 90%以上的相似性 ,则判断为阳性 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　分子杂交

　　C. 1 试剂与材料

　　C. 1. 1 核酸杂交的相关试剂

　　20×SSC:称取 175.3 g NaCl,88.2 g二水柠檬酸钠 ,溶解于 800mL去离子水 ,用 HCl调 pH值至 7. 0,最后用定容至 1 L,高温高压灭菌后室温保存 。

　　50×Denhardt’s溶液 :称取 1 gFicoll400,1 gPVP-40,1 gBSA,溶解于 80 mL 去离子水 ,定容至100 mL,过滤除菌及杂质后 -20℃贮存 。

　　预杂交液 : 5×SSC、5×Denhardt溶液 、50%甲酸胺 、1% SDS、100 μg/mL 鲑鱼精 DNA(用前加热变性后加入) 。

　　杂交液 :预杂交液中加入 DIG-RNA探针 ,稀释成适当浓度 。

　　封闭液 :将 0. 73g NaCl,0.24g Na2 HPO4 ,0. 1 g NaH2PO4 ,5 g SDS溶于 80mL水中 ,定容至 100mL,过滤除菌后室温保存 。

　　洗涤液 Ⅰ :为 1/10稀释的封闭液 。

　　洗涤液 Ⅱ :将 0. 24 gTris,1. 16 g NaCl,0. 4 gMgCl2 溶于 160 mL水中 ,用 HCl调 pH 至 9. 5,定容至 200 mL,过滤除菌后室温保存 。

　　MOPS缓冲液(10×) :200 mmol/L MOPS ( pH 7. 0 ) 、50 mmol/LNaAc、10 mmol/L EDTA。

　　顺丁烯二酸缓冲液 :100 mmol顺丁烯二酸 、150 mmolNaCl,pH 7. 5。

　　洗膜缓冲液 :100 mmol顺丁烯二酸 、150 mmolNaCl、0. 3%(体积分数)吐温-20,pH 7. 5。

　　检测缓冲液 :100 mmolTris-HCl(pH 9. 5) 、100 mmolNaCl。

　　抗地高辛的酶标抗体 :Anti-DIG-AP。

　　CSPD:25 mmolCSPD(用前稀释) 。

　　C. 1.2 标记探针

　　采用地高辛标记试剂盒进行核酸探针标记 。将正链 RNA 互补 cDNA 5'端采用融合了 T7启动子的互补引物与同源引物(B. 2)PCR扩增 , 回收目标片段 ,取 1 μg溶于 11. 5 DEPC处理水 , 沸水中变性5 min,短暂离心后加入 4 μL5×转录反应缓冲液 、2 μL地高辛标记 dNTPs和 2 μL T7 RNA 聚合酶 、 0. 5 μL RNA酶抑制剂 ,37 ℃标记反应 2 h。最后加入 2 μLEDTA(0. 5 mol/L,pH 8. 0)终止反应 ,加无水乙醇 -20℃放置 30 min沉淀核酸 ,12 000 r/min转速离心 10 min,小心弃去乙醇溶液 ,然后用 75%乙醇洗涤一次 ,无菌操作台吹干 ,溶于 20 μL纯水中 。 检测标记效率(C. 2. 3) 应高于对照 1 个数量级以上 , -20 ℃保存 ,杂交时放入杂交液中使用 。

　　C.2 实验步骤

　　C.2. 1 样品 RNA 的提取

　　方法同 B. 3。

　　C.2.2 RNA斑点印迹杂交

　　步骤如下 :

　　a) 取 3 μLRNA加 7 μL变性缓冲液 (33%甲醛、50%去离子甲酰胺和 1×MOPS) ,65 ℃水浴 15min,冰浴 5 min,促使核酸变性 ;

　　b) 然后取变性核酸点于带正电荷的尼龙膜上 ,每次 2 μL,点好后将膜晾干 ;

　　c) 将膜正面朝上置于胶联仪内 ,在紫外光强度 1 200× 100 μJ/cm2 条件下胶联固定 3 min;

　　d) 将膜用 6×SSC预湿后 ,放入预杂交液中 ,在杂交炉 68 ℃预杂交 2 h~ 6 h;

　　e) 然后将探针煮沸 5 min,迅速冰上冷却 5 min,加入到杂交缓冲液中 ,65 ℃杂交 6 h~ 12 h;

　　f) 杂交结束后 ,将膜取出 ,用 20 mL~ 40 mL含 2× SSC和 0. 1%SDS溶液在室温洗膜 5 min,重复 1 次 ;

　　g) 用 20 mL~40 mL含 0. 1×SSC和 0. 1% SDS溶液在 68 ℃下洗膜 15 min,重复 1 次 ;

　　h) 将膜放入杂交袋中用于检测 。

　　C.2.3 杂交检测

　　采用地高辛检测试剂盒在室温(20 ℃ ~25 ℃)条件下进行杂交结果的检测 。按 100 cm2 膜面积计算试剂用量 。步骤如下 :

　　a) 洗膜后 ,用洗液冲洗杂交膜 ;将膜放入在 100 mL封闭液量内封闭 30 min;

　　b) 利用封闭液按 1 ∶ 10 000稀释抗体 ,将膜放入 20 mL抗体溶液内孵育 20 min;

　　c) 加 100 mL洗液 ,室温洗膜 15 min,重复 1 次 ;

　　d) 加 20 mL检测液 ,室温孵育 2 min~ 5 min,重复 1 次 ;

　　e) 杂交面朝上 ,加 2 mL CSPD使其均匀铺在膜上 ,室温孵育 5 min,取出膜沥干溶液 ,用保鲜膜包好 ;

　　f) 5 min~ 15 min后置于化学发光检测仪内检测光信号 。

　　C.3 结果判定

　　阴性对照无或弱的杂交信号 ,而阳性对照有强的杂交信号 ,则结果可靠 ; 杂交信号显著比阴性对照强的判定为阳性样品 。

　　参 考 文 献

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