GB/T 33119-2016 葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33119—2016

　　葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofEutypalata (Pers.) Tul.etC. Tul

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33119—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、青岛检验检疫技术发展中心 、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局 、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局 、中国科学院微生物研究所 。

　　本标准主要起草人 :王英 超 、段 维 军 、厉 艳 、吴 兴 海 、封 立 平 、魏 晓 棠 、甘 琴 华 、纪 瑛 、邵 秀 玲 、姚 剑 、王振华 、郭立新 、蔡磊 。

　　葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了葡萄藤猝倒病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于葡萄等寄主植物中葡萄藤猝倒病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　3 葡萄藤猝倒病菌基本信息

　　学名 :Eutypa lata(Pers. ) Tul.etC. Tul.

　　异名 :Eutypa armeniacae Hansf. & M. V. Carter;Eutypa fraxini(Nitschke) Sacc;Eutypa mil- liaria(Fr.) Sacc.;Eutypa lata var. aceris Rappaz, Mycol. Helv;Cytosporina lata Hohn; Libertella blepharisA. L. Sm.

　　分类地位 :采用《真菌词典》第 10版分类系统 ,葡萄藤猝倒病菌(Eutypa lata)属真菌界(Fungi) ,子囊菌 门 ( Ascomycota) , 盘 菌 亚 门 ( Pezizomycotina) , 粪 壳 菌 纲 (Sordariomycetes) , 炭 角 菌 目(Xylariales) ,蕉孢壳科(Diatrypaceae) ,弯孢壳属(Eutypa Tul. & C. Tul.1863) 。

　　传播途径 :植物体在贸易和运输中能够传播该病害 。植物体主要指树皮(孢子和菌丝) ,地上部分的茎 、嫩枝 、主干 、枝条(菌丝) ,木材(孢子和菌丝)等 。

　　葡萄藤猝倒病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　葡萄藤猝倒病菌的为害症状 、分离培养性状 、形态特征和特异性 PCR 检测结果等是该检疫鉴定方法的主要依据 。

　　5 仪器设备和主要试剂

　　5. 1 仪器设备

　　生物显微镜 、电子天平(感量 0. 001 g) 、离心机(12000g) 、普通冰箱 、超低温冰箱( -80 ℃) 、涡旋振荡器 、恒温光照培养箱 、高压灭 菌 器 、生 物 安 全 柜 、PCR 仪 、电 泳 仪 、凝 胶 分 析 成 像 系 统 、可 调 微 量 加 样器 、全自动 DNA提取仪 。

　　GB/T 33119—2016

　　5.2 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 GB/T 6682中相关规定 。

　　0. 5%次氯酸钠(NaClO) 、葡萄糖 、琼脂 、硫酸链霉素 、盐酸金霉素 、氯硝胺 。

　　6 现场检疫

　　按照 SN/T 2589,仔细检查寄主植物的茎 、枝条 、叶片等部位是否出现疑似症状(参见附录 A) 。茎部主要看有无溃疡症状 ;枝条是否长势短小 ,发育受阻 ,着生的叶子是否萎黄 ,卷缩变形或破碎 ;顶部是否出现枯 萎 症 状 。 对 可 疑 植 物 、繁 殖 材 料 应 取 样 送 实 验 室 做 进 一 步 检 验 , 取 样 方 法 和 步 骤 参 照SN/T 2122。

　　7 实验室检疫

　　7. 1 PCR凝胶电泳初筛检测

　　将第 6章中的可疑植物 、繁殖材料等样品进行 PCR初筛检测 ,PCR凝胶电泳检测见附录 B。对于阳性结果进行下一步检测 。

　　7.2 病原菌的分离和培养

　　7.2. 1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基和选择性培养基的制备

　　马铃薯(去皮)200 g;葡萄糖 20 g;琼脂 15 g;蒸馏水补至 1 000 mL, 121 ℃湿热灭菌 20 min备用 。分离培养时加硫 酸 链 霉 素 (100 μg/mL) 、盐 酸 金 霉 素 (50 μg/mL) 、氯 硝 胺(5 μg/mL) 作 为 选 择 性 培养基 。

　　7.2.2 病原菌检查

　　检查寄主的树皮 、枝条等组织有无子座 、子囊壳 ,在显微镜下观察病菌的子囊壳 ,记录其形态特征 ,测量子囊和子囊孢子的大小 。所获得分离物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行单孢分离纯化 。

　　7.2.3 组织中病原菌的分离和培养

　　如果发现可疑症状 ,但不能按 7. 2. 2进行有性型形态检查 ,应采取下列分离培养的方法做进一步的鉴定 。剥去树皮 ,纵向 劈 开 树 干 露 出内 部 溃 疡 的 边 缘 。 在 无 菌 条 件 下 , 从 溃 疡 部 分 的 外 部 边 缘 切 取1 cm2 的薄木片 ,放在 0. 5%次氯酸钠溶液中浸泡 2 min~ 5 min,用无菌水重复洗 3 次 ,然后用无菌滤纸吸干 ,放在选择性培养基上进行培养 。24 ℃培养 4 d~ 7 d后 ,将疑似菌落转到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行分离纯化 。

　　8 鉴定特征

　　8. 1 PCR凝胶电泳初筛检测

　　判定结果见附录 B。

　　8.2 培养性状

　　葡萄藤猝倒病菌在 PDA培养基首先形成白色棉絮状菌丝 , 培养基背面奶油色 。 2 周后 , 培养基上

　　出现灰色色素 ,培养基背面变成黑色 。 3 周 ~ 4 周后 , 在连续的光照培养下 ,形成小的黑色的分生孢子器 。分生孢子丝状 ,直或弯曲 ,数量多 ,大小(20 μm~45 μm) × (0. 8 μm~ 1. 5 μm) 。见附录 C。

　　8.3 子囊壳的特征

　　子囊壳直径大约 0. 5 mm ,在枝干或茎上不规则分布 。子囊壳的孔口裂出 ,具有不明显的沟槽 。子囊从子囊壳顶点释放 ,子囊顶尖内陷 ,子囊大小(30μm~ 60μm) × (5μm~ 7. 5 μm) ,子囊柄长 60μm~ 130μm,数量很多 ,纺锤状 , 内含有 8个子囊孢子 。子囊孢子香肠状 ,金棕色 ,亚透明 , (6. 5 μm~ 11 μm) × (1.8 μm~2 μm) 。在培养基上不能生成子囊壳(见附录 C) 。

　　9 结果判定

　　以 PCR初筛结果 、分离物的培养性状 、子囊壳的特征等作为鉴定依据 ,进行综合判定 。若 PCR 初筛结果为阳性 ,并发现子囊壳 ,且与 8. 3 鉴定特征吻合 ,鉴定为葡萄藤猝倒病菌 ;若 PCR初筛结果为阳性 ,未发现子囊壳 ,但与 8. 2鉴定特征吻合 ,鉴定为葡萄藤猝倒病菌 。

　　10 样品保存

　　10. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出葡萄藤猝倒病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　10.2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为葡萄藤猝倒病菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上 ,24 ℃培养 72h,然后 4 ℃冰箱保存 。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理 。

　　10.3 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并要有实验人员和审核人员签字 。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　葡萄藤猝倒病菌其他信息

　　A. 1 名称

　　中文名 :葡萄藤猝倒病菌 。

　　英文名 :Eutypa dieback disease。

　　A.2 寄主范围

　　全世界范围来说 ,葡萄藤猝倒病菌能从至少 52个属 88种木本双子叶植物中分离到 。危害的主要经济作物包括葡萄属 、杏属 、李属 。在美国加利福尼亚州该病害严重影响葡萄 、杏和甜樱桃的产量 ,是该地区葡萄上的三大病害之一 。在法国和意大利 ,损失最严重的是葡萄 。在澳大利亚和土耳其 ,损失最严重的是杏树 。 自然寄主包括银荆(Acacia dealbata) 、栓皮槭(Acer campestre) 、埃 及 榕(Acer pseudo- platanus) 、草莓树(Arbutusmenziesii) 、熊 果 属(Arctostaphylos) 、欧 洲 鹅 耳(Carpinusbetulus) 、美 洲茶属(Ceanothus) 、日本木瓜(Chaenomelesjaponica) 、柑桔属(Citrus) 、欧榛(Corylusavellana) 、毡 毛栒子(Cotoneasterpannosa) 、柳 叶 栒 子(Cotoneaster salicifolius) 、山 楂 属(Crataegus) 、榅 桲(Cydonia oblonga) 、柿(Diospyros kaki) 、枇 杷 (Eriobotrya japonica) 、欧 洲 水 青 冈 (Fagus sylvatica) 、无 花 果 (Ficuscarica) 、欧洲白蜡树(Fraxinusexcelsior) 、染料木属(Genista) 、洋常春藤(Hedera helix) 、胡桃 (Juglansregia) 、毒 豆 (Laburnum anagyroides) 、马 缨 丹 (Lantana camara) 、欧 洲 女 贞 (Ligustrum vulgare) 、欧洲忍冬(Lonicera xylosteum) 、苹果(Malus pumila) 、欧 洲 夹 竹 桃(Nerium oleander) 、木樨榄 (Olea europaea subsp. europaea) 、阿 月浑 子 乳 香 树 (Pistacia lentiscus) 、阿 月浑 子 (Pistacia vera) 、维多利亚海桐(Pittosporum undulatum) 、悬铃木(Platanusacerifolia) 、黑杨(Populusnigra) 、欧洲山 杨 (Populus tremula) 、杏 (Prunus armeniaca) 、欧 洲 甜 樱 桃 (Prunus avium) 、欧 洲 酸 樱 桃 (Prunuscerasus) 、欧洲李(Prunusdomestica) 、扁桃(Prunusdulcis) 、桃(Prunuspersica) 、李(Prunus salicina) 、黑刺李 (Prunus spinosa) 、西 洋 梨(Pyrus communis) 、加 州 白 栎 (Quercus lobata) 、大 果 栎 (Quercus macrocarpa) 、软 木 槠 (Quercus suber) 、药 鼠 李 (Rhamnus cathartica) 、欧 鼠 李 (Rhamnus frangula) 、酷栗属(Ribes) 、蔷薇属(Rosa) 、黄花柳(Salix caprea) 、西洋接骨木(Sambucusnigra) 、加州胡椒树(Schinusmolle) 、肖乳香(Schinusterebinthifolius) 、白面子树(Sorbusaria) 、欧洲花楸(Sorbus aucuparia) 、欧洲丁香(Syringavulgaris) 、柽柳属(Tamarix) 、心叶椴(Tilia cordata) 、大叶椴(Tilia platyphyllos) 、榆属(Ulmus) 、绵毛荚迷(Viburnum lantana) 、欧洲绣球(Viburnum opulus) 、美国葡萄 (Vitislabrusca) 、沙葡萄(Vitisrupestris) 、葡萄(Vitisvinifera) 。

　　A.3 症状描述

　　该病害在侵染寄主植物 2 年 ~ 3 年后才开始表现症状 ,一般危害植物的多年生部位 。在葡萄上 ,病害首先在嫩枝上表现症状 ,感病的新梢嫩枝发育受阻 , 长势弱 , 节间短 ,其长度小于健康植株嫩枝的 一半 ,并且长出的叶片明显变小 ,萎黄色 , 凹陷 , 叶片卷缩变形或破碎 。嫩枝停止生长 , 常常在生长季节死亡 。感病较轻的枝条 ,花序直立 ,在授粉之前通常落花 、干死 ,不能正常结果 。侵染一两年的葡萄树逐渐变得衰落 。葡萄在病菌侵染超过 6年后才表现顶枯症状 ,并且葡萄木质部和韧皮部中的溃疡总是和顶

　　枯症状相伴随 。 主干部位剥皮后可发现黑色的小粒点子囊壳 ,在木质部的横截面常出现“V”形的溃疡 ,呈灰褐色或紫褐色坏死 、变硬 ,与健康组织界限分明 。 在溃疡边缘的健康部分通常有变色的条斑或斑点 。 随着病害的发展 ,溃疡逐渐扩 大 而 健 康 部 分 逐 渐 变 成 细 条 状 。 在 杏 树 及 其 他 李 属(Prunus) 植 物上 ,病菌侵染以后 ,症状发展的比葡萄快速 ,但通常也需要 18个月才表现症状 。症状首先表现为枝条分支的快速萎缩 , 叶片突然枯萎并且死亡 ,常呈杯状 ,但叶片剩余部分仍然留在枝条上 ,在葡萄上表现皱缩的叶片在杏树上不会出现 。检查死亡的枝条的基部 ,可以看到围绕着受伤部位有溃疡出现 ,大多数溃疡分泌出大量的树胶 。

　　A.4 分布

　　分布于美国 、加拿大 、墨西哥 、巴西 、南非 、巴基斯坦 、印度 、澳大利亚 、新西兰 、法国 、葡萄牙 、希腊 、意大利 、波兰 、瑞士 、瑞典 、西班牙 、乌克兰 、捷克 、立陶宛 、德国 、保加利亚 、土耳其 、利比亚 、以色列 。

　　A.5 传播方式

　　葡萄藤猝倒病菌是腐生和兼性寄生病原菌 ,很容易侵染寄生 ,特别是在温暖且雨水比较多的地区 。病原菌以子囊壳越冬 ,子囊壳萌发产生子囊孢子 ,子囊孢子通过空气和雨水进行远距离传播 。植物体在贸易和运输中能够传播该病害 ,植物体主要指树皮(孢子和菌丝) ; 地上部分的茎 、嫩枝 、主干 、枝条(菌丝) ;木材(孢子和菌丝)等 。而果实 、随植物所带的介质 、花 、花序 、(松树 、冷杉树等的)球果 、花萼 、叶片 、幼苗 、组培植物 、根 、种子等目前不确定能否传播该病害 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　PCR凝胶电泳检测

　　B. 1 寄主植物 DNA 的提取

　　将有疑似症状的样品或随机抽取的样品采用植物 DNA提取试剂盒对样品进行 DNA提取 。

　　B.2 引物序列

　　正向引物 ED1:5’-TGGTGGACGGGTAGGGTTAG-3’;

　　反向引物 ED2:5’-GGCCTTACCGAAATAGACCAA-3’;

　　扩增片段大小为 643 bp。

　　B.3 PCR反应体系及参数

　　B.3. 1 PCR反应体系

　　PCR反应体系见表 B. 1。

　　表 B. 1 PCR反应体系

　　B.3.2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　B.3.2. 1 阴性对照 : 以待测健康的植株组织洗涤液中提取的 DNA 为模板 。

　　B.3.2.2 阳性对照 :采用葡萄藤猝倒病菌或含有待测基因序列的质粒 。

　　B.3.2.3 空白对照 :设两个 ,一是提取 DNA 时设置的提取空白对照(以 H2 O 代替样品) ,二是 PCR 反应的空白对照(以水代替 DNA模板) 。

　　B.3.3 PCR反应参数

　　94 ℃/2min;93 ℃/30 s,65 ℃/30 s,72 ℃/1 min,37个循环;72 ℃/10 min。

　　B.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测

　　制备 1. 2%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物 ,用 DNA Marker作为分子量标记 ,进行电泳 分 析 , 电 泳 结 束 后 在 凝 胶 成 像 仪 的 紫 外 透 射 光 下 观 察 是 否 扩 增 出 预 期 的 特 异 性DNA条带 ,并拍摄记录 。

　　B.4 结果判断

　　阴性对照和空白对照在 643 bp处未出现扩增条带 ,待测样品与阳性对照在 643 bp处出现扩增条带 ,判定结果为阳性 。

　　阴性对照和空白对照在 643 bp处未出现扩增条带 , 阳性对照在 643 bp处出现扩增条带 ,且样品无特异性扩增 ,判定结果为阴性 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　葡萄藤猝倒病菌症状及形态特征图

　　葡萄藤猝倒病菌症状及形态特征图见图 C. 1~ 图 C. 6。

　　注 1: 图左为健康 , 图右为发病 。

　　注 2: 引 自 GaryP. Munkvold。

　　图 C. 1 葡萄藤猝倒病菌发病症状

　　注 : 引 自 GaryP. Munkvold。

　　图 C.2 葡萄藤猝倒病菌在木质部横截面症状图

　　注 : 引 自 GaryP. Munkvold。

　　图 C.3 葡萄藤猝倒病菌在葡萄上的子囊壳

　　注 : 引 自 GaryP. Munkvold。

　　图 C.4 感病杏树上分泌的树胶

　　说明 :

　　a— 子囊 ;

　　b— 子囊孢子 。

　　注 : 引 自 GaryP. Munkvold。

　　图 C.5 葡萄藤猝倒病菌的子囊和子囊孢子

　　注 : 引 自 GaryP. Munkvold。

　　图 C.6 葡萄藤猝倒病菌的子囊孢子

　　参 考 文 献

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