GB/T 33122-2016 花园葱蜗牛检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33122—2016

　　花园葱蜗牛检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofCepaeahortensis (Müller, 1774)

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33122—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、中国湿地博物馆 、浙江自然博物馆 。本标准主要起草人 :周卫川 、王沛 、李敏 、杨海芳 、沈建国 、于文涛 、钱周兴 、虞赟 、林阳武 。

　　花园葱蜗牛检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了花园葱蜗牛 Cepaea hortensis (Müller, 1774) 的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于花园葱蜗牛的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 3067 软体动物常规检疫规范

　　3 术语和定义

　　SN/T 3067界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　生殖器 genitalia

　　蜗牛的交配和繁殖器官 。

　　注 : 雄性生殖器主要包括输精管 、阴茎 、阴茎本体 、阴 茎 牵 引 肌 、鞭 状 体 等 部 分 , 雌 性 生 殖 器 主 要 包 括 矢 囊 、副 矢 囊 、恋矢 、黏液腺 、受精囊 、受精囊柄 、盲管等部分 。

　　3.2

　　鞭状体 flagellum

　　蜗牛雄性生殖系统中的附器 , 由阴茎本体末端分支形成 。

　　3.3

　　盲管 diverticulum

　　由受精囊柄分支形成的管状结构 。

　　注 : 盲管为大蜗牛科 Helicidae的基本特征 。

　　3.4

　　矢囊 dartsack

　　蜗牛雌性生殖系统中一个藏有 1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构 。

　　3.5

　　恋矢 Lovedart

　　矢囊中钙质或壳质的骨针 ,为蜗牛交配时刺激器官 。

　　注 : 恋矢的质地和形状常用于分类 。

　　3.6

　　壳 口 aperture

　　贝壳开口部位 ,为蜗牛头和腹足的出 口 。

　　注 : 壳口的边缘为口唇 ,按其在壳 口 中的位置不同可分为内唇 、外唇 、轴唇 、基唇 、上唇和下唇 。

　　GB/T 33122—2016

　　4 基本信息

　　学名 :Cepaea hortensis (Müller, 1774) 。

　　异名 :Helix hortensisMüller, 1774。

　　英文名 :White-lipped banded snail,White-lipped grove snail,White-lipped garden snail。

　　分 类 地 位 : 软 体 动 物 门 Mollusca, 腹 足 纲 Gastropoda, 柄 眼 目 Stylommatophora, 大 蜗 牛 科Helicidae,葱蜗牛属 Cepaea Held, 1837。花园葱蜗牛的近似种有森林葱蜗牛 C. nemoralis(Linnaeus, 1758) 、维也纳葱蜗牛 C. vindobonensis (Pfeiffer, 1828) 。

　　5 方法原理

　　花园葱蜗牛昼伏夜出 ,常隐藏在人们难以发现的地方 , 易于传播 。其传播特点是不需要特定的寄主 ,凡接触过地面的物品都可能传播 。传播方式和传播途径是确定现场检疫方式的依据 。 贝壳形态 、软体解剖和分子特征是实验室鉴定的主要依据 。

　　6 器具与试剂

　　6. 1 器具

　　体视显微镜 、放大镜 、手电筒 、塑料自封袋 、广口标本瓶 、4 mm 孔径土壤筛 、小铁铲 、游标卡尺 、搪瓷盘 、培养皿 、解剖针(直径 0. 15 mm) 、镊子 、剪刀 、小剪刀 、显微镊子 、显微剪刀 、解剖腊盘 、标签 、移液枪 、微型离心机 、PCR仪 、1. 5 mL离心管 、0. 2 mL PCR反应管 、恒温金属浴 。

　　6.2 试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 。

　　75%乙醇 、无水乙醇 、硫酸镁 、动物基因组 DNA提取试剂盒 、PCR反应液 、ddH2 O。

　　7 现场检测

　　对来自疫区(参见附录 A)的运输工具和货物实施重点查验 。仔细检查运输工具 、木质包装物 、未经加工的植物性材料 、苗木 、花卉 、盆景 、废塑料等是否有蜗牛附着其上 ,花园葱蜗牛昼伏夜出 ,尤其要注意阴暗蔽光处的检查 ,用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹 。蜗牛爬行过后 ,会留下银灰色的丝带状黏液痕迹 ,这是判定是否有蜗牛污染的重要依据 。发现蜗牛 , 随时装入塑料自封袋或标本瓶 ,带回实验室做进一步的检验鉴定 。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时 ,需过筛检查是否有卵或幼螺 。

　　8 实验室鉴定

　　8. 1 测量观察和软体解剖

　　用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽 、卵粒长和宽 。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和螺的形态特征 。

　　将闷杀(见 10. 1)处理后的标本 ,参照 SN/T 3067解剖软体 ,分离出生殖系统 。

　　8.2 葱蜗牛属Cepaea Held, 1837鉴定特征

　　贝壳无脐孔 , 圆球形或稍压扁 ,一般具有 5 条黑褐色的色带 ,但也有完全无色带的个体 。有 5 个螺层 ,最后一个螺层向下倾斜 。壳口倾斜 , 口缘宽大且内增厚 ,下缘直 。 颚片粗壮 ,具有 4 条 ~ 6 条粗肋 ,齿舌的中央齿和侧齿无齿尖 。恋矢有时具有 4条裂脊 ,黏液腺具有一显著长的分支 。受精囊柄很长 ,分支形成盲管 , 阴茎具有长的鞭状体 。

　　8.3 花园葱蜗牛 Cepaeahortensis (Müller,1774)鉴定特征

　　8.3. 1 卵

　　卵圆形 , 白色 ,短径 2 mm ,长径 2. 5 mm。

　　8.3.2 贝壳

　　8.3.2. 1 成螺

　　贝壳扁球形 ,缓慢膨胀 ,有 5个 ~ 5 个螺层 ,脐孔完全被唇缘覆盖 。壳口“U”形 , 口唇白色粗短 ,偶而有褐色 ,外唇向外延伸反折 , 内唇贴覆于体螺层上 ,形成一薄的白色胼胝部 。 贝壳色彩明亮 ,有光泽 ,其上有微弱而不规则的生长嵴和螺旋状的色带 0 条 ~ 5 条 ,故也称白唇彩带蜗牛 。 贝壳在颜色和色带数量方 面 变 异 很 大 。 极 少 数 口 唇 是 褐 色 的 个 体 , 在 形 态 上 很 像 森 林 葱 蜗 牛 Cepaea nemoralis (Linnaeus, 1758) ,但本种贝壳更细薄一些 ,螺层更圆滑一些 ,尺度更小一些 。壳高 10 mm~ 15 mm ,壳宽 14 mm~ 20 mm。参见附录 B 中图 B. 1:A、B、C。

　　8.3.2.2 幼螺

　　幼螺贝壳在外部形态上与成螺无多大差异 ,只是个体小 ,壳质薄 , 口缘外唇不向外延伸扩展 。

　　8.3.3 螺体

　　腹足肌肉发达 ,通常呈灰绿色 ,头部棕色 ,从触角基部中央到颈部之间有一条浅色的线条 。蜗牛爬行时其软体伸展长度可达 3. 5 cm~4. 2 cm。参见图 B. 1:D。

　　8.3.4 生殖系统

　　阴茎长 , 阴茎本体与阴茎差不多等长 , 阴茎本体略带紫色 。鞭状体细长 。 阴茎牵引肌薄而宽 , 中等长度 。受精囊柄长 ,略粗 。矢囊大 ,椭圆形 ,无副矢囊 。黏液腺两枝 ,分别长在阴道两侧 ,每枝二分叉 ,分叉后每枝又分 2枝 ~ 3枝 , 即一枝黏液腺有 4个 ~ 6个分支 ,而森林葱蜗牛最多只有 3个分支 ;黏液腺管状 ,粗实且长 ,光滑 。 阴道呈明显的紫色 。参见图 B. 2。

　　8.3.5 COI基因序列鉴定

　　按附录 C方法提取 DNA、PCR扩增和双向测序 ,将所测序列与已知花园葱蜗牛的 COI基因序列(Genbank登录号为 KF596879. 2)进行比对 ,相似度一般应 ≥96% 。参见附录 C。

　　9 结果评定

　　以贝壳形态为基本鉴定依据 ,螺体和外生殖器解剖形态为辅助鉴定特征 ,并注意与近似种鉴别(参见附录 D) ,对于口唇为白色的个体 ,符合 8. 3. 2 或同时符合 8. 3. 2、8. 3. 3、8. 3. 4形态特征的蜗牛鉴定为花

　　园葱蜗牛 Cepaea hortensis (Müller, 1774) ;对于口唇为褐色的个体 ,应同时符合 8. 3. 2、8. 3. 3、8. 3. 4 形态特征的蜗牛才鉴定为花园葱蜗牛 C. hortensis (Müller, 1774) 。单独查获的卵粒符合 8. 3. 1 形态特征 ,应通过孵化和饲养实验(参见 SN/T 3067) ,做进一步的鉴定 。符合 8. 3. 5 作为前期初筛或最终鉴定结果的分子佐证 。

　　10 标本处理和保存

　　10. 1 标本处理

　　将蜗牛置于盛满水的瓶中 ,盖上瓶盖 ,进行闷杀 ,蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中 ,逐渐伸展身体 ; 或逐渐加入少量硫酸镁 ,进行麻醉闷杀 。

　　将闷杀后伸展的蜗牛标本置于无水乙醇中浸泡 1 d~ 2 d,然后在 75%乙醇溶液中固定 ,每隔 1 d~ 2 d 换 1 次乙醇溶液 ,共换 3 次 ~4次 ,便可长期保存于 75%乙醇溶液中 。解剖后的生殖系统可直接保存于 75%乙醇溶液中 。

　　10.2 标本保存

　　经处理后的标本 ,至少妥善保存 6个月 ,并注明时间 、产地 、寄主 、采集人等信息 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　花园葱蜗牛寄主、地理分布及其他信息

　　A. 1 寄主植物

　　杂食性 。幼螺以腐殖质 、植物的幼苗和嫩芽为食 ;成螺取食各种绿色植物的茎和叶 。

　　A.2 地理分布

　　欧洲 : 中欧 、西欧 、北欧 、冰岛地区 。具体分布的国家包括英国 、德国 、法国 、荷兰 、卢森堡 、比利时 、波兰 、瑞典 、挪威 、芬兰 、冰岛 、拉脱维亚 、爱沙尼亚 、乌克兰(西部) 、俄罗斯(加里宁格勒) 、白俄罗斯(维帖布斯克) 。

　　北美洲 :美国(东部) 、加拿大 。

　　A.3 生物学习性与危害性

　　花园葱蜗牛 Cepaea hortensis (Müller, 1774) 是我国颁布的进境植物检疫性有害生物 。该螺昼伏夜出 ,常藏匿于阴暗处 ,可以休眠方式随货物和木质包装材料远距离传播 。花园葱蜗牛为农业生产上的重要有害生物 ,不但可直接危害各种蔬菜 、瓜果 、花卉和农作物 ,而且也是许多人畜共患寄生虫的中间宿主 ,影响人畜健康 。如在西欧的黑醋栗收获期间 ,这种蜗牛平时歇息在灌木丛中 ,这时会爬到果盆 、果箱中歇息 ,不但给田间生产造成直接危害 ,而且经常在运输过程中严重污染果品,导致工厂拒绝收货 ,造成重大经济损失 。近年来 ,我国江苏 、张家港 、浙江 、宁波 、福建 、天津 、山东 、广东 、上海等口岸多次从进境植物检疫中截获该蜗牛 ,表明该螺的传入风险较高 。

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　花园葱蜗牛形态及生殖系统特征

　　花园葱蜗牛形态及生殖系统特征见图 B. 1 和图 B. 2。

　　说明 :

　　A、B、C — 贝壳形态 ;

　　A — 侧面观 ;

　　B — 背面观 ;

　　C — 腹面观 ;

　　D — 蜗牛爬行时外部形态 。

　　图 B. 1 花园葱蜗牛形态特征

　　说明 :

　　P — 阴茎 ;

　　E — 阴茎本体 ;

　　F — 鞭状体 ;

　　PR — 阴茎牵引肌 ;

　　VD — 输精管 ;

　　S — 矢囊 ;

　　MG — 黏液腺 ;

　　PBC— 受精囊柄 ;

　　BC — 受精囊 ;

　　D — 盲管 。

　　注 : 标本产地 :芬兰 。

　　图 B.2 花园葱蜗牛生殖系统特征

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　花园葱蜗牛 COI基因辅助鉴定方法

　　C. 1 DNA提取

　　取适量腹足肌肉 ,用 SDS方法或动物基因组 DNA试剂盒方法提取 DNA。

　　C.2 COI基因引物

　　LCO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3'

　　HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'

　　C.3 反应体系

　　反应体系为 20 μL:其中 DNA 模板 2 μL, LCO1490(10 μmol/L) 0. 5 μL, HCO2198(10 μmol/L)

　　0. 5 μL,2×Master Mix 10 μL,ddH2 O 7 μL。

　　C.4 PCR扩增条件

　　94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,45 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,30个 ~ 35个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃ 。

　　C.5 测序

　　将 PCR扩增样品送有资质的生物技术公司测序 。

　　C.6 比对鉴定

　　将双向测序获得的 600bp~ 700bp长度 DNA序列片段 ,经软件拼接和人工校对后 ,与已知花园葱蜗牛的 COI基因序列(Genbank 登录号为 KF596879. 2) 进行比对 ,相似度 ≥96%的待鉴样品确定为花园葱蜗牛的疑似样品 。

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　花园葱蜗牛与近似种的鉴别特征比较

　　表 D. 1 花园葱蜗牛与近似种鉴别特征比较