GB/T 36194-2018 金鱼造血器官坏死病毒检测方法

　　ICS 65 . 020 . 30 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36194—2018

　　金鱼造血器官坏死病毒检测方法

　　Detectionmethodofgoldfishhaematopoieticnecrosisvirus

　　2018-05-14 发布 2018-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36194—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC 156)归口 。

　　本标准起草单位：全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李清、王娜、谷强、张昱、景宏丽、吴绍强、张利峰、江育林、陈浩楠。

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　　金鱼造血器官坏死病毒检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了金鱼造血器官坏死病毒(鲤疱疹病毒 2 型)的 PCR 检测、荧光 PCR 检测和综合判定方法。

　　本标准适用于金鱼造血器官坏死病毒的鉴定，用于金鱼造血器官坏死病毒引起的相关疾病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 18088 出入境动物检疫采样

　　SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CyHV：鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus)

　　CyHV-2：鲤疱疹病毒 2 型 (cyprinid herpesvirus 2)

　　GFHNV：金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus)

　　dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)

　　bp：碱基对(base pair)

　　Ct：循环阈值(cycle threshold)

　　CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)

　　EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)

　　Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris (hydroxymethyl) aminomethane]

　　4 试剂和材料

　　除非另有说明，仅使用分析纯试剂。

　　4 . 1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。

　　4.2 Taq DNA 聚合酶：5 U/μL。 -20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

　　4.3 dNTP：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各 10 mmoL/L, -20 ℃保存。

　　4.4 引物：浓度为 10 μmoL/L, -20 ℃保存。

　　a) CyHV 引物

　　1) CyHVpol-F: 5′-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3′

　　2) CyHVpol-R: 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3

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　　3) 扩增 CyHV(1 型、2 型和 3 型)DNA 聚合酶基因中 362 bp 的片段。

　　b) CyHV-2 引物

　　1) CyHV-2Hel-F: 5′-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3′

　　2) CyHV-2Hel-R: 5′-CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3′

　　3) 扩增 CyHV-2 解旋酶基因中 366 bp 的片段。

　　c) 荧光 PCR用引物和探针

　　1) 正向引物：5′-TCGGTTGGACTCGGTTTGTG-3′

　　2) 反向引物：5′-CTCGGTCTTGATGCGTTTCTTG-3′

　　3) 探针：5′-FAM-CCGCTTCCAGTCTGGGCCACTACC-BHQ1-3′

　　4 . 5 无水乙醇：使用前预冷到-20 ℃ 。

　　4 . 6 琼脂糖：电泳纯。

　　4.7 10 × PCR 缓冲液(含 Mg2+ , 25 mmoL/L)：随 Taq DNA 聚合酶提供，-20 ℃保存。

　　4.8 荧光 PCR 2×预混合液(2×supermix) : -20 ℃保存。

　　5 器材和设备

　　5 . 1 生物安全柜。

　　5 . 2 超低温冰箱及普通冰箱。

　　5 . 3 离心机及离心管。

　　5 . 4 高压灭菌锅。

　　5 . 5 组织研磨器。

　　5 . 6 PCR仪 。

　　5 . 7 电泳仪。

　　5 . 8 荧光 PCR仪。

　　5 . 9 凝胶成像仪。

　　6 临床症状

　　参见附录 A。

　　7 采样

　　7 . 1 采样部位

　　采集待测鱼的鳃、脾、肾等。

　　7 . 2 采样数量

　　采样数量应符合 SC/T 7103 的要求。

　　7 . 3 样品采集

　　按 GB/T 18088 的规定执行，且体长≤4 cm 的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊;4 cm<体长<6 cm 的鱼苗取所有内脏;体长 ≥6 cm 的鱼则取鳃、脾、肾。 成熟雌鱼还需取卵巢液;鱼卵则取卵膜。

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　　8 病毒的检测

　　8 . 1 设立对照

　　从提取样品 DNA起，均需设立阳性样品对照、阴性样品对照和空白对照。 取已知阳性样品的组织作为阳性对照，取 GFHNV检测阴性的组织作为阴性对照，取等体积的无菌去离子水作为空白对照。

　　8 . 2 DNA抽提

　　取 25 mg~100 mg样品，加入 150 μL CTAB溶液(见 B.1),将样品匀浆，转入 1.5 mL 的离心管中，再加 CTAB溶液至 900 μL。25 ℃作用 2 h~2.5 h。

　　在含有样品的离心管中加入 600 μL抽提液 Ⅰ(见 B. 2),充分混合不少于 30 s。 12 000 r/ min, 4 ℃ ,离心 5 min,取上层水相(约 800 μL),再加入 700 μL抽提液Ⅱ(见 B.3),充分混合至少 30 s。12 000 r/min, 4 ℃ ,离心 5 min,取上层水相(约 600 μL),再加入 -20 ℃预冷的 1 . 5 倍体积的无水乙醇(约 900 μL) ,颠倒数次混匀后，-20 ℃ 8 h 以上沉淀核酸。 12 000 r/ min, 4 ℃ ,离心 30 min,小心弃去上清。 干燥后加20 μL水溶解，用作 PCR模板。

　　也可使用同等抽提效果的商品化试剂盒或其他方法抽提病毒 DNA。

　　8.3 PCR检测

　　8 . 3 . 1 反应体系

　　在 PCR管中依次加入：10 × PCR 缓冲液(含 Mg2+ ) 5 μL、dNTP 1 μL、正向和反向引物各 1 μL、 Taq DNA 聚合酶 0 . 5 μL,模板 2 . 5 μL,加水至总体积为 50 μL。 瞬时离心，将反应管置于 PCR仪。

　　8 . 3 . 2 反应条件

　　94 ℃预变性 5 min; 94 ℃ 1 min、55 ℃(CyHV 引物)或 60 ℃(CyHV-2 引物)1 min、72 ℃ 1 min, 扩增 35 个循环;72 ℃延伸 10 min,最后 4 ℃保温。

　　8 . 3 . 3 琼脂糖电泳

　　用 1×电泳缓冲液(见 B. 5)配制 2%的琼脂糖凝胶(含 0 . 5 μg/mL EB,见 B. 6,或其他等效商品化试剂)。将 5 μL样品和 1 μL 6×上样缓冲液(见 B. 7)混匀后加入样品孔，在电泳时设立 DNA标准分子量作对照。 5 V/ cm 电泳约 0 . 5 h, 当溴酚蓝到达底部时停止，将凝胶置于凝胶成像仪上观察。

　　8 . 3 . 4 测序

　　取 PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与 DNA序列数据库(GenBank) 中参考序列(参见附录C)进行同源性比对。

　　8 . 3 . 5 结果判定

　　利用 CyHV 引物进行 PCR扩增后，阳性对照会出现 362 bp 的特异性条带，阴性对照和空白对照均没有该条带。 待测样品扩增出 362 bp 的条带，且基因序列测定结果与参考序列相似性在 99%以上者，可判定待测样品 PCR检测结果为阳性;未扩增出条带或条带大小不是 362 bp 均判定为 PCR 检测结果阴性。

　　利用 CyHV-2 引物进行 PCR扩增后，阳性对照会出现 366 bp 的特异性条带，阴性对照和空白对照均没有该条带。 待测样品扩增出 366 bp 的条带，且基因序列测定结果与参考序列相似性在 99%以上

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　　者，可判定待测样品 PCR检测结果为阳性;未扩增出条带或条带大小不是 366 bp 均判定为 PCR 检测结果阴性。

　　8 . 4 荧光 PCR检测

　　8 . 4 . 1 反应体系

　　在 PCR管中依次加入：2 × 预混合液(2 × supermix) 6. 25 μL、正向和反向引物各 0. 5 μL、探针0 . 5 μL、模板 2 . 5 μL、加水至 12 . 5 μL。 瞬时离心，将反应管置于荧光 PCR仪。

　　8 . 4 . 2 反应条件

　　95 ℃ 2 min; 95 ℃ 30 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s, 共 40 个循环;72 ℃延伸 2 min。

　　8 . 4 . 3 结果判定

　　阴性对照和空白对照应无 Ct值，阳性对照 Ct值<35,且出现 S 型典型扩增曲线，否则此次检测视为无效，应重新检测。

　　待测样品 Ct值≤35 且出现典型扩增曲线，可判定为荧光 PCR 阳性;若待测样品无扩增曲线，或Ct值 ≥40,可判定为荧光 PCR 阴性。

　　对于 35

　　9 综合判定

　　同时满足以下两条即可判定为 GFHNV 阳性：

　　— 利用 CyHV 引物 PCR检测结果为阳性，且测序结果正确。

　　— 利用 CyHV-2 引物 PCR检测结果为阳性，且测序结果正确。

　　— 荧光 PCR结果为阳性。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　金鱼造血器官坏死病

　　A.1 疾病描述

　　由金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV) 引起金鱼、鲫等鱼类死

　　亡的一种病毒性传染病，在全球多个国家和地区均有流行。 1992 年秋季和 1993 年春季，在 日本西部养殖的金鱼发生金鱼造血器官坏死病大流行，死亡率达 100%。 此后，其他国家或地区相继出现有关该病的报道，包括美国、英国、澳大利亚和捷克共和国等。 在中国江苏等地也发生了该病，造成严重死亡。

　　A.2 宿主

　　金鱼、异育银鲫及鲫的其他变种。 对鱼卵、鱼苗、鱼种和亲鱼均可感染，危害严重。

　　A.3 水温

　　该病发生的最适水温为 20 ℃左右。

　　A.4 临床症状

　　患病鱼主要表现为食欲不佳或厌食，活动减弱，昏睡，停留在池塘或水族箱底部。 病鱼体表、下颌充血，尤其是鳃部严重充血，在下颌等体表处分布大量点状出血点。 将病鱼解剖后可见其肝脏、脾脏和肾脏肿大，有出血点，严重时鱼鲽分布大量出血点，部分病例可见病鱼体表有白色斑点。

　　A.5 病原

　　金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV), 因该病毒是第二个分离

　　自鲤科鱼类的疱疹病毒，国际病毒系统分类与命名委员会第九次报告将其命名为鲤疱疹病毒 2 型

　　(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)。该病毒是一种大小为 290 304 bp、二十面体、病毒粒子直径为120 nm、有囊膜的 双 链 DNA 病 毒，其 分 类 地 位 隶 属 于 疱 疹 病 毒 目 ( Herpesvirales)、异 疱 疹 病 毒 科(Alloherpesviridae)、鲤疱疹病毒属(cyprini℃irus)。

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　　附 录 B (规范性附录)试剂及其配制

　　B.1 CTAB溶液

　　先将 8.19 g氯化钠、EDTA 0.744 g、Tris 1.21 g、水 60 mL 充分混匀后，用浓 HCl(约 0.25 mL~ 0 . 3 mL)调节 pH 值至 7 . 5~8 . 0,加入 2 g CTAB,完全溶解后定容至 100 mL。 使用前加巯基乙醇至终浓度为 0 . 25% 。

　　B.2 抽提液 Ⅰ

　　1 moL/ L Tris 饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇= 25 ∶ 24 ∶ 1 混合，密闭避光保存。

　　B.3 抽提液 Ⅱ

　　将三氯甲烷与异戊醇按 24 ∶ 1 的比例混合，密闭避光保存。

　　B.4 50 × 电泳缓冲液

　　先分别加入 Tris242 g, Na2 EDTA ·2H2 O 37.2 g,再加入 800 mL水，充分搅拌溶解，接着加入冰乙酸 57 . 1 mL,加水定容至 1 000 mL,室温贮存。

　　B.5 1 × 电泳缓冲液

　　加入 50×电泳缓冲液 20 mL并加水定容至 1 000 mL室温贮存。

　　B.6 溴化乙锭(EB)

　　用水配制成 10 mg/mL 的浓缩液。 用时每 10 mL 电泳液或琼脂中加 1 μL。

　　B.7 6×上样缓冲液

　　取蔗糖 40 g,加水溶解，定容至 100 mL,再加入溴酚蓝 0 . 25 g溶解后，4 ℃保存。

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　　附 录 C

　　(资料性附录) PCR扩增的序列

　　C.1 CYHV 引物 PCR扩增的序列

　　CyHV 引物 PCR扩增的 DNA 聚合酶基因的一段序列(片段大小 362 bp,参照 GenBank Accession AFJ20509)如下，下划线处为引物。

　　1 CCCAGCAACA TGTGCGACGG AGGCATCAGC CCAGAGTCCA TAGTGTCTAG GAGCGACCCG

　　61 TTCTGTCTCG AGTATGTCAG AAACTGCGTG CTGCTCGATT GGAAAAAGATACCGGCCGCC

　　121 AGTAACATGG AAGAGATCAA GGAATACCCG CACAGCGAAGACCTGTACAC GATCCTGTGC

　　181 TACAAGAACC GAGAGGTCGG TTGGACTCGGTTTGTGACCT ACACCGCTTC CAGTCTGGGC

　　241 CACTACCTCT CTATGAGATC TCAGTACAAG AAACGCATCA AGACCGAGAA AGACGCGAGT

　　301 CTCAAGGCGT ACTATGATCA GATGCAGGGT GAGATGAAAG TATGCGCCAA CTCTCACTAC

　　361 GG

　　C.2 CYHV-2 引物 PCR扩增的序列

　　CyHV-2 引物 PCR 扩增的解旋酶基因的一段序列(片段大小 366 bp, 参照 GenBank Accession AFJ20501)如下，下划线处为引物。

　　1 GGACTTGCGA AGAGTTTGAT TTCTACACGC CTCGCATCAT GCATCAGGAC AACGCGGTCA

　　61 GACAACTCAA CGAGTCTTGTATGAAAAAGA CTGTGGGCGC CGAACGGATC TTCAAGCCCA

　　121 AGATCAATCA CAATAACGTG CAGAACCCGG ACGAGCGTAG AAAGTTTGCA GCCGTGGTCC

　　181 GTCAACGGTT CAAGCACATT GACTTCTTTC AAGGCGTCCG AATCAAGGTC GGATCTCTGG

　　241 TGTGCGTACT AAAATATCAA ACTCAAGTGT TTGAAGGCTG TCTGGGAATA GTGGAATCAG

　　301 TACAACCCGT CATGGTACGC CTTTTTTTGT TTGTTTGTTT GTTTGATGAG ACGATGGTGA

　　361 CTATGG