GB/T 33117-2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33117—2016

　　小麦基腐病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofHelgardiaherpotrichoides

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33117—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、青岛检验检疫技术发展中心 、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :吴兴海 、王英超 、余冬冬 、封立平 、厉艳 、纪瑛 、甘琴华 、吴翠萍 、邵秀玲 、王振华 。

　　小麦基腐病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了小麦基腐病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于小麦属 、黑麦属等禾本科寄主中小麦基腐病菌的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　3 小麦基腐病菌基本信息

　　学名 :Helgardia herpotrichoides (Fron) Crous & W. Gams 2003

　　异 名 : 无 性 态 Cercosporella herpotrichoides Fron 1912, Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton 1973. ,Ramulispora herpotrichoides (Fron) Arx 1983;有 性 态 Tapesia yallundae var. yallundae,Oculimacula yallundae (Wallwork & Spooner) Crous & W. Gams 2003。

　　传播途径 :主要以病残体混于种子间进行远距离传播 。

　　小麦基腐病菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　病原菌的为害症状 、分离培养性状 、形态特征和特异性 PCR 检测结果等是该检疫鉴定方法的主要依据 。

　　5 仪器设备和主要试剂

　　5. 1 仪器设备

　　生物显微镜 、电子天平(感量 0. 001 g) 、离心机 、普通冰箱 、超低温冰箱( -80 ℃) 、恒温水浴锅 、涡旋振荡器 、恒温光照培养箱 、高压灭菌器 、生物安全柜 、PCR 仪 、电泳仪 、凝胶分析成像系统 、全自动 DNA提取仪 。

　　5.2 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 GB/T 6682中相关规定 。

　　表面活性剂吐温-20、琼脂 、青霉素 、链霉素 、0. 5 %次氯酸钠 ( NaClO) 。

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　　6 现场检疫

　　按照 SN/T 2589,仔细检查寄主植物的茎 、枝条 、叶片等部位是否出现疑似症状(参见附录 A) 。对可疑植物病残体和土壤应取样送实验室做进一步检验 ,取样方法和步骤按照 SN/T 2122。

　　7 实验室检疫

　　7. 1 症状检查

　　小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯 ,病斑多在地际到 10 cm 之间的叶鞘和茎秆上形成椭圆形或 “眼纹 ”状病斑 。检查种子中有无附着病残体 、土壤等 。

　　7.2 PCR凝胶电泳初筛检测

　　将 7. 1 中的样品 进 行 PCR 初 筛 检 测 , PCR 凝 胶 电 泳 检 测 见 附 录 B。 对 于 阳 性 结 果 进 行 下 一 步检测 。

　　7.3 病原菌的分离培养

　　7.3. 1 培养基的制备

　　马铃薯蔗糖培养基(PSA) 、马铃薯葡萄糖培养基(PDA) 、玉米琼脂培养基(CMA) 及选择性培养基的制备见附录 C。

　　7.3.2 种子中病原菌的分离培养

　　取待检的进境病原菌的寄主种子样品 50 g放入 250 mL洁净的三角瓶中 ,加蒸馏水 100 mL,再加表面活性剂吐温 -20 1 滴 ~ 2 滴 , 用 铝 箔 纸 或 培 养 纸 将 三 角 瓶 封 口 , 将 三 角 瓶 放 在 往 复 式 振 荡 器 上 , 150g振荡洗涤 5 min。立即取下三角瓶 ,将洗涤悬浮液用干净纱布过滤后注入 10 mL~ 20 mL刻度离心管内 ,1 000g 离心 3 min,取出离心管 ,倾去上清液 ,再加剩余洗涤悬浮液 ,混合离心 ,直至所有洗涤悬浮液离心完毕 , 留沉淀物 。将沉淀物从离心管中全部移入 2 mL离心管中 , 12 000 g 离心 10 min, 以移液管移取上清去除水分 ,在常温下将沉淀风干 。对样品洗涤液中收集到的沉淀物在培养基上进行分离培养 。

　　7.3.3 病残体中病原菌的分离培养

　　将变色的可疑材料 ,剪成约 3 mm~ 5 mm 小段 ,用 0. 5%次氯酸钠表面消毒 10 min,再用灭菌水冲洗 30min,置于玉米琼脂培养基(CMA)平板上(配方见附录 C) ,13 ℃ ~ 15 ℃ ,近紫外光照射培养 ,培养7 d~ 14 d开始观察菌落形态和菌丝形态特征 。

　　7.3.4 土壤中病原菌的分离培养

　　取 2 g 土壤放入 200 mL 灭 菌 水 中 , 用 磁 力 棒 搅 拌 30 min, 使 其 充 分 混 匀 , 悬 浮 液 稀 释 10倍 , 取1 mL土壤稀释液涂抹于选择性 PDA平板上(配方见附录 C) ,每处理 5~ 10个重复 , 15 ℃ ,全光照下培养 ,培养 7 d~ 14 d开始观察菌落形态和菌丝形态特征 。

　　7.3.5 分生孢子的诱导

　　7. 3. 2、7. 3. 3 和 7. 3. 4 获得的菌丝 ,可通过以下方法获得分生孢子 。水琼脂培养基(WA)上 2 周龄菌

　　丝 ,9 ℃ ,7 d~ 10 d产生初生孢子 , 由菌丝或孢子的水悬浮液置于 PDA 表面 , 18 ℃ ~ 21 ℃ ,4 d则产生大量分生孢子 。

　　8 鉴定特征

　　8. 1 PCR凝胶电泳初筛检测

　　判定结果见附录 B。

　　8.2 培养性状

　　病原在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养 , 培养菌丝呈鹅绒状或细棉状 。 培养初期的整体呈凸状 。菌落圆形 、光滑 ,边缘平坦 , 中央有明显的气生菌丝 ,菌落表面灰绿色 , 背面暗色 , 22 ℃生长速率平均为1. 2 mm。在玉米琼脂培养基上 ,菌落呈墨绿色或粉红色或淡褐色 。在选择性培养基上 ,菌落呈茶褐色 。

　　8.3 形态特征

　　小麦基腐病菌有 2种类型的菌丝体 :一种为营养菌丝 ,黄褐色 ,线性 ,有分枝 ;一种暗色 ,厚壁 , 由膨大的多角形细胞构成 ,常在植株体表形成类似子座的菌丝团 。分生孢子梗无色 ,单生或罕有分枝 ,倒棒状 ,产孢细胞全壁芽生合轴式产孢 ,孢痕不肥厚 , 不发亮 ,呈截断状 。 分生孢子无色 , 针状 , 直或略为弯曲 。分生孢子多数有 3个 ~ 7个隔膜 ,偶见超过 10个 ,大小(30 μm~ 120 μm) × (1 μm~ 3. 5 μm)(见附录 D) 。

　　子囊盘直径 0. 2 mm~ 1. 5 mm ,无柄 , 密集聚生 ,着生于簇生的灰褐 色 钩 状 菌 丝 之 上 ,呈 圆 形 或 叶状 。子囊托灰褐色 ,杯状 ,后变为小盘状 ,边缘反卷 ,在子囊盘未成熟时常被白色透明或浅褐色的绒毛 ,成熟时少见 。子囊(35 μm~ 50 μm) × ( 4 μm~ 7. 4 μm) , 内含 8个子囊孢子 , 圆桶状纺锤形或棍棒状纺锤形 ,近顶点处渐缩呈短的杆状 。子囊孢子(7μm~ 11 μm) × (1. 5 μm~ 2. 3 μm) ,透明 ,细的圆桶状-棒状 ,棍棒状纺锤形或纺锤形 ,末端浑圆 ,直或轻微的不规则 ,罕见弯曲 。油滴不明显 ,无隔膜或罕见 1 个隔膜 ,子囊孢子在子囊内呈不规则的双行排列 。侧丝丝状 ,长度跟子囊相近 ,直径 2. 0 μm~ 2. 5 μm ,顶端钝圆 ,透明 ,有隔膜 。

　　9 结果判定

　　以 PCR初筛结果 、病原菌培养性状 、形态特征等作为鉴定依据 ,进行综合判定 。若 PCR 初筛为阳性 ,且与 8. 2、8. 3鉴定特征吻合 ,鉴定为小麦基腐病菌 。

　　10 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出小麦基腐病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　11 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为小麦基腐病菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌株接种于 PSA培养基斜面上(配方见附录 C) ,存活后置于 4 ℃ ~ 8 ℃黑暗条件下保存 ,定期(3个月)转接 , 以防止病菌死亡 , 至少保存 6个月 ,必要时用病菌分生孢子作冻干菌种保存 。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理 。

　　12 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并要有实验人员和审核人员签字 。PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　小麦基腐病菌其他信息

　　A. 1 名称

　　中文名 :小麦基腐病菌

　　英文名 :Eyespotof cereals

　　学 名 : Helgardia herpotrichoides ( Fron) Crous & W. Gams 2003。 曾 用 学 名 , Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton1973. ,该学名分类地位 :无性态属于半知菌亚门(Deuteromycotina) ,丝孢菌纲(Hyphomycetes) ,丝孢目(Hyphomycetales) ,淡色孢科(Moniliaceae) ,假小尾孢属(Pseudocercosporella) ;有性态 Tapesiayallundae Wallwork & Spooner1988,属于子囊菌亚门(Ascomycota) ,煤炱目(Capnodiales) ,球腔菌科(Mycosphaerellaceae) ,Tapesia属 。

　　A.2 寄主范围

　　小麦属 (Triticum) 、大 麦 (Hordeum vulgare) 、栽 培 二 棱 大 麦 (Hordeum distichon L. ) 、黑 麦(Secale cereale) 、燕 麦 (Avena sativa) 以 及 山 羊 草 属 (Aegilops) 、冰 草 属 (Agropyron) 、剪 股 颖 属(Agrostis) 、看麦娘属(Alopecurus) 、雀麦属(Bromus) 、鸭茅属(Dactylis) 、翠雀属(Delphinium) 、偃麦草(Elytrigiarepens) 、羊 茅 属 (Festuca) 、溚 草 (Koeleria cristata) 、黑 麦 草 属 (Lolium) 、路 边 紫 草(Lithospermum ruderale) 、早熟禾属(Poa) 、黑麦属(Secale) 、瓶刷草(Sitanionhystrix) 。

　　A.3 症状描述

　　小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯 。可危害基部叶鞘和茎秆(地际以上 10 cm 的叶鞘和茎秆) ,减低千粒重和减少穗粒数 ,也引起茎秆开裂 、倒伏 、白穗和分蘖死亡 。开始近地面叶鞘上形成小的褐色病斑 ,而后逐渐扩大 , 圆形至长椭圆形或不规则 , 大的病斑长 4 cm , 轮廓不明显 ,边缘褐色至暗褐色 , 内部灰白色至淡绿色 ,病斑表面常有黑色子座 。病斑在叶鞘扩展的同时向内部扩散 , 当小麦开始拔节时 ,茎秆的近地面部位可发现同样病斑 ,最终环绕茎秆 ,产生真菌性暗色中心 。抽穗后期 ,小麦由病斑部位折断倒伏 ,严重时出现大面积倒伏 ,通常在病斑部的秆内侧中空处可见到集结成灰白或灰绿色棉絮状的菌丝体 。椭圆形或 “眼纹 ”状病斑及抽穗后小麦在近地际处折断倒伏是本病最主要特征 ,具有诊断意义 。

　　A.4 分布

　　欧洲 :奥地利 、白俄罗斯 、俄罗斯 、比利时 、波兰 、丹麦 、德国 、法国 、芬兰 、荷兰 、捷克 、挪威 、瑞典 、瑞士 、土耳其 、西班牙 、匈牙利 、意大利 、英国 、爱尔兰 、保加利亚 、拉脱维亚 、立陶宛 、罗马尼亚 、乌克兰 、希腊 、塞尔维亚和黑山 。

　　美洲 :美国 、加拿大 。

　　非洲 :摩洛哥 、南非 、突尼斯 。

　　亚洲 : 日本 、马来西亚 。

　　大洋洲 :澳大利亚 、新西兰 。

　　A.5 生物学特性和传播方式

　　本菌喜低温 ,0 ℃即可产孢 ,5 ℃ ~ 15 ℃为产孢适温 ,低于 0 ℃或高于 20 ℃都不产孢 。冬小麦秋苗期至春季都可发生侵染 。病原菌由胚芽鞘或植株近地面叶鞘直接穿透侵入或由气孔侵入 。饱和湿度下 ,6 ℃ ~ 15 ℃时 ,在 15 min内即可侵入 ,4周后发病 。菌丝体也可直接侵染寄主 。

　　病残体上产生的分生孢子和菌丝是主要的初侵染源 ,并可在其上存活数年 。病残体上的分生孢子主要靠风雨传播扩散到新枝 ,或通过嫩枝上菌丝生长向植株扩散 。此病可通过种子间混杂的病残体及土壤带菌传播 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　普通 PCR检测方法

　　B. 1 寄主植物 DNA 的提取

　　将有疑似症状的样品或随机抽取的样品采用植物 DNA提取试剂盒对样品进行 DNA提取 。

　　B.2 引物序列

　　正向引物 Ty16F:5,-GCGCTGGAAAAAGAGGACTG -3,;

　　反向引物 Ty16R:5,-TGGAAGGGTCTTGCAGGG -3,;

　　扩增片段大小为 1. 05 kb。

　　B.3 PCR反应体系及参数

　　B.3. 1 PCR反应体系

　　PCR反应体系见表 B. 1。

　　表 B. 1 PCR反应体系

　　B.3.2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　B.3.2. 1 阴性对照 : 以待测健康的植株组织洗涤液中提取的 DNA 为模板 。

　　B.3.2.2 阳性对照 :采用小麦基腐病菌或含有待测基因序列的质粒 。

　　B.3.2.3 空白对照 :设两个 :一是提取 DNA 时设置的提取空白对照(以 H2 O 代替样品) ;二是 PCR 反应的空白对照(以水代替 DNA模板) 。

　　B.3.3 PCR反应参数

　　94 ℃/2min;94℃/60 s,60 ℃/30 s,72 ℃/3 min,35个循环;72 ℃/4 min。

　　B.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测

　　制备 1%的琼脂糖凝胶 ,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物 ,用 DNA Marker作为分子量标记 ,进行电泳分析 , 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性 DNA条带 ,并拍摄记录 。

　　B.4 结果判断

　　阴性对照和空白对照在 1. 05 kb处未出现扩增条带 ,待测样品与阳性对照在 1. 05 kb处出现扩增条带 ,判定结果为阳性 。

　　阴性对照和空白对照在 1. 05 kb处未出现扩增条带 , 阳性对照在 1. 05 kb处出现扩增条带 ,且样品无特异性扩增 ,判定结果为阴性 。

　　附 录 C (规范性附录)培养基的制备

　　C. 1 马铃薯蔗糖培养基(PSA)

　　马铃薯去皮后洗净 ,切成小块 ,称取 200 g,蒸馏水中煮 30 min,用 4 层纱布过滤 ,加入 10 g~ 20 g蔗糖 、17g~ 20g琼脂 ,加热使之完全溶解 ,蒸馏水定容至 1000mL,121℃高压灭菌 15min。为抑制细菌生长 ,可在培养基中适当添加青霉素和链霉素 。

　　C.2 马铃薯葡萄糖培养基(PDA)及选择性培养基

　　马铃薯去皮后洗净 ,切成小块 ,称取 200 g,蒸馏水中煮 30 min,用 4 层纱布过滤 ,加入 10 g~ 20 g葡萄糖 、17 g~ 20 g琼脂 ,加热使之完全溶解 ,蒸馏水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　在以上培养基中加入硫酸链霉素 300mg/L,硫酸铜 800mg/L~ 1000mg/L,可作为选择性培养基用以分离土壤中的小麦基腐病菌 。

　　C.3 玉米琼脂培养基(CMA)

　　量取 500 mL蒸馏水 ,加热至 70 ℃ ,加入 200 g玉米 ,保持温度在 60 ℃左右约 1 h,用纱布过滤后 ,加入适量的蒸馏水补足 500 mL。另取 500 mL蒸馏水 ,加入 15. 0 g~ 20. 0 g 琼脂粉 ,加热使之慢慢融化 ,过滤后补足水至 500 mL。两液混合后分装 ,121 ℃灭菌 20 min。

　　或将 60g玉米粉加入蒸馏水中 ,搅匀 ,文火煮沸 1 h,纱布过滤 ,加入 15. 0 g~ 20. 0 g琼脂粉 ,加热使之慢慢融化 ,补足水量至 1 000 mL,分装 ,121 ℃灭菌 20 min。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　小麦基腐病菌症状及形态特征图

　　小麦基腐病菌症状及形态特征图见图 D. 1~ 图 D. 4。

　　a) 小麦 b) 大麦

　　注 : 引 自 PeterScott。

　　图 D. 1 小麦基腐病菌发病症状

　　注 : 引 自 PeterScott。

　　图 D.2 小麦基腐病菌分生孢子

　　注 : 引 自 Wallwork. H. 。

　　图 D.3 小麦基腐病菌子囊和侧丝

　　注 : 引 自 Wallwork. H. 。

　　图 D.4 小麦基腐病菌子囊孢子

　　参 考 文 献

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