GB/T 31810-2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31810—2015

　　玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofMaizechloroticmottlevirus

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31810—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中华人民共和国云南出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :张卫 东 、张 永 江 、张 慧 丽 、王 岚 、杨 翠 云 、廖 力 、李 旻 、迟 远 丽 、徐 淼 锋 、权 永 兵 、闻伟刚 、陈其文 。

　　玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定的方法 。

　　本标准适用于可能携带玉米褪绿斑驳病毒的种子 、种苗等植物繁殖材料中玉米褪绿斑驳病毒的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　SN/T 2964—2011 植物病毒检测规范

　　3 仪器设备、设施和主要试剂

　　3. 1 仪器设备

　　酶标仪 、洗板机 、普通 PCR仪 、荧光 PCR仪 、微量分光光度仪 、生物安全柜 、高压灭菌锅 、培养箱 、微量天平(感量 :0. 001 g) 、冰 箱 、离 心 机 、酸 度 计 、水 浴 锅 、电 泳 仪 、凝 胶 成 像 系 统 、移 液 器 (1 000 μL、 200 μL、100 μL、10 μL、2. 5 μL) 。

　　3.2 设施

　　隔离温室(10 ℃ ~ 30 ℃) 。

　　3.3 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 。 主要试剂和缓冲液见附录 B 中 B. 1 和附录 C 中 C. 1。

　　4 抽样和检测样品的制备

　　4. 1 抽样

　　抽样按照 SN/T 2122的规定执行 。

　　4.2 检测样品的制备

　　4.2. 1 种子类

　　挑取至少 500粒 种 子 (重 点 挑 取 畸 形 、不 成 熟 的 种 子) 样 品 , 经 3%次 氯 酸 钠 (NaClO) 表 面 消 毒10min后 ,将种子置于灭过菌的土壤中 ,在适宜的发芽温度(25 ℃ ~ 28 ℃)条件下催芽 ,直至长出 3 片 ~ 4 片真叶进行检测 。选取具有褪绿 、畸形等症状的植株幼嫩叶片全部进行编号检测 , 同时随机抽取至少20株无症状植株样品进行混样检测 。

　　GB/T 31810—2015

　　4.2.2 种苗类

　　对于有症状的种苗类样品单独检测 ,重点选取表现症状种苗类样品的幼嫩叶片 ;对于无症状的种苗类样品至少选取 20株的幼嫩叶片进行混样检测 。

　　5 检疫鉴定方法

　　5. 1 DAS-ELISA检测

　　DAS-ELISA检测方案设计参照 SN/T 2964—2011。在一次血清学检测试验中 ,设置 2 个阳性对照孔 、2个阴性对照孔 、2个空白对照孔作为质量控制 ,并根据送检样品数量设置待检测样品孔数 ,要求每个待测样品设两次重复 。所有点样孔都安排在酶联板内部 , 防止边际效应的发生 ,影响检验结果的准确性 。

　　具体操作见附录 B。

　　5.2 RT-PCR检测

　　RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照 , 用感染 MCMV 的植物 组 织 作 阳 性 对 照 , 用 ddH2 O作空白对照 ,每个反应体系设置两个平行样 。

　　具体操作见附录 C。

　　5.3 实时荧光 RT-PCR检测方法

　　实时荧光 RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照 ,用感染 MCMV 的植物组织作阳性对照 ,用ddH2 O作空白对照 ,每个反应体系设置两个平行样 。

　　具体操作见附录 D。

　　6 结果判定

　　样品经 DAS-ELISA、普通 RT-PCR或实时荧光 RT-PCR检测结果为阴性时 ,判定样品未检出玉米褪绿斑驳病毒 。

　　样品经 DAS-ELISA检测 结 果 为 阳 性 , 进 一 步 用 RT-PCR 或 实 时 荧 光 RT-PCR 方 法 进 行 检 测 。 PCR结果为阴性 ,判定未检出玉米褪绿斑驳病毒;PCR结果为阳性 ,可以判定为样品检出玉米褪绿斑驳病毒 。

　　7 样品保存和复核

　　7. 1 样品的保存

　　经检验确定携带 MCMV 的样品应在合适的条件下保存 ,种子保存在 4 ℃ ,其他繁殖材料采病叶经液氮干燥后在 -80℃条件下保存 。

　　7.2 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并要有实验人员和审核人员签字 。酶联免疫方法应有酶联反应的原始数据 ,PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片 ,荧光 PCR检测应附扩增图谱 。

　　7.3 结果复核

　　检验结果的复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责 ,主要考察实验记录 、照片等资料的完整性和真实性 ,必要时进行复核实验 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　玉米褪绿斑驳病毒相关资料

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 玉米褪绿斑驳病毒基本信息

　　学名 :Maizechloroticmottlevirus

　　异名 :Maizechloroticmottle machlomovirus;Maizemottlevirus;Peru cornvirus

　　缩写 :MCMV

　　分类地位 :番茄丛矮病毒科(Tombusviridae) ,玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　玉米褪绿斑驳病毒的分子生物学特性 、血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据 。

　　A.2 寄主范围

　　MCMV 的自然寄主只有玉米 ,实验条件下可侵染小麦(Triticumaestivuml) 、大麦(Hordeum vul- gare) 、燕麦(Avena ludoviciana) 、高粱(Sorghum bicolor)等 19种禾本科植物 。

　　A.3 分布

　　MCMV 主要分布于阿根廷 、墨西哥 、秘鲁 、美国 、泰国等 。

　　A.4 传播方式

　　MCMV可通过昆虫介体进行自然传播 ,主要介体包括黑角负泥虫(Oulema melanopus) 、玉米跳甲(Chaetocnemapulicaria) 、十一星 黄 瓜 跳 甲 (Diabrotica undecimpunctata) 、长 角 黄 瓜 甲 虫(D. longi- cornis) 、玉米根萤叶甲(D. virgifera) 和威廉期花蓟马(Frankliniella williamsi) 等 , 机械接种和嫁接也能传播 ,还可以随寄主植物以及通过种子进行远距离传播 。

　　A.5 症状

　　MCMV 自然条件下只能侵染玉米 ,可引起多种症状 ,产量损失 10% ~ 15% 。感染 MCMV 的玉米节间距变短矮化 , 叶片开始出现与叶脉平行褪绿条纹后来接合呈长条形褪绿斑 ,最后叶片坏死和偏上弯曲 ,雄性花序坚硬 ,短花轴 、少数穗并且呈畸形 ,感染严重的植株可能导致死亡 。感染 MCMV 的植株越幼嫩 , 出现的矮化症状越严重 。另外 ,该病毒能与玉米矮花叶病毒(Maizedwarf mosaicvirus) 、小麦条纹花叶病毒(Wheatstreakmosaicvirus)和甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus)复合侵染 ,作物产量损失最高可达 91% 。

　　A.6 病毒粒体形态

　　病毒粒子为等轴对称二十 面 体(T= 3) , 用 磷 钨 酸 负 染 色 直 径 约 30 nm , 用 醋 酸 铀 负 染 直 径 约 为

　　A.7 核酸

　　为单分子线形正义 ssRNA,长 4437 nt,核酸占病毒粒子质量的 18% 。有的病毒粒子还偶尔含有一个 1 100 nt的亚基因组 RNA。

　　A. 8 基因组

　　单分体基因组 ,RNA 的 3'端无 Poly(A) ,5'端有一个序列为 m7G5'PPPA 的甲基化核苷酸帽子结构 。病毒基因组含有 4个 ORF,ORF1 编码一个 32ku蛋白 ,ORF2 编码 50ku蛋白 ,对 ORF2琥珀终止密码子的超读使翻译持续到 ORF 2RT,产生一个 111 ku蛋白 ,该蛋白也可以在病毒 RNA 的体外翻译中得到 。 ORF 3 编码一个 9 ku蛋白 ,推测对 ORF 3 的 UGA终止密码子超读产生一个 33 ku 蛋白 。 ORF4编码 25. 1 ku 的外壳蛋白 ,在体内由共 3'端亚基因组 RNA表达产生 。 ORF 1 与 ORF 3 编码蛋白以及 ORF 3超读产物的功能目前还不清楚 ,ORF 2 编码蛋白及其超读产物可能是病毒的聚合酶 。

　　A.9 抗原特性

　　病毒外壳蛋白由一种多肽组成 ,分子质量为 25. 1 ku。病毒具有中等到强的免疫原性 ,在凝胶扩散中形成单条沉淀线 ,与其他一些禾谷类植物病毒无血清学关系 。

　　注 : 引 自 LommelSA。

　　图 A. 1 玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)在玉米上引起的症状

　　注 : 引 自 LommelSA。

　　图 A.2 玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)粒体形态

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 包被抗体

　　特异性的玉米褪绿斑驳病毒抗体 。

　　B. 1.2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的玉米褪绿斑驳病毒抗体 。

　　B. 1.3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP) 。

　　B. 1.4 10×PBST缓冲液(pH 7. 4)

　　氯化钠(NaCl) 80. 0 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 11. 5 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 2. 0 g

　　氯化钾(KCl) 2. 0 g

　　吐温-20 (Tween-20) 5 mL

　　加入 900 mL水溶解 ,调节 pH 到 7. 4,然后补水至 1 L。

　　B. 1.5 样品抽提缓冲液(pH 7. 4)

　　加入 800 mL水溶解 ,调节 pH 到 7. 4,然后补水至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1.6 包被缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　加入 900 mL水溶解 ,调节 pH 到 9. 6,然后补水至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1.7 酶标抗体缓冲液(pH 7. 4)

　　溶于 800 mL蒸馏水后 ,调节 pH 至 7. 4,定容至 1 L。

　　B. 1. 8 底物(pNPP)缓冲液(pH 9. 8)

　　氯化镁(MgCl2 ) 0. 1 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　二乙醇胺 97 mL

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,调节 pH 至 9. 8,蒸馏水定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B. 1.9 反应终止液

　　氢氧化钠(NaOH)120g溶于 1 000 mL 的无菌蒸馏水中 ,浓度为 3 mol/L。

　　B.2 试验步骤

　　B.2. 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将包被抗体按说明比例稀释 ,加入酶联板的孔中 , 100 μL/孔 ,加盖 ,37 ℃孵育 4 h 或4 ℃冰箱孵育过夜 ,清空酶联板孔中溶液 ,PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B.2.2 样品制备

　　取待测样品幼嫩叶片 1 g,按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积)加入样品抽提缓冲液 ,用研钵研磨成浆 ,充分振荡混匀后室温保持 10 min,8000g 离心 10 min,上清液即为制备好的检测样品 。用健康的植物组织作阴性对照 ,用感染 MCMV 的植物组织作阳性对照 ,用样品抽提缓冲液作空白对照 , 阴性对照 、阳性对照作相同的处理 。

　　B.2.3 加样

　　加入制备好的待测样品 、阴性对照和阳性对照 ,100μL/孔 。 阳性对照 、阴性对照和待测样品均应重复 1 次 。加盖后 37 ℃孵育 2 h或 4 ℃冰箱孵育过夜 ,清空酶联板孔中溶液 ,PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B.2.4 加酶标抗体

　　用 1×酶标抗体稀释缓冲液按说明 将 酶 标 抗 体 稀 释 至 工 作 浓 度 , 加 入 到 酶 联 板 中 , 100 μL/孔 , 加盖 ,室温孵育 2 h,清空酶联板孔中溶液 ,PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B.2.5 加底物

　　将底物 pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,按 100μL/孔 ,加入到酶联板中 ,室温避光孵育约 0. 5 h~ 2 h,至阳性对照孔明显显色 。必要时每孔加入 50 μL的 3 mol/L氢氧化钠浓液终止反应 。

　　B.2.6 读数

　　用酶标仪在 405 nm 处读取吸光值 。

　　B.3 结果判断

　　B.3. 1 对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :

　　空白对照孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15;

　　阳性对照 OD405值/阴性对照 OD405值 >2;

　　同一样品的重复性基本一致 。

　　B.3.2 在满足了 B. 3. 1 质量要求后 ,结果可判断如下 :

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值 >2,判为阳性 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值<2,判为阴性 ;

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值在 2 附近 ,判为可疑样品,应重新进行试验 。

　　B.3.3 若满足不了 B. 3. 1 质量要求 ,则不能进行结果判断 ,应重新进行检测 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　玉米褪绿斑驳病毒 RT-PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 RNA提取试剂

　　TRizoL裂解液 、三氯甲烷 、异丙醇 、75%乙醇 。

　　C. 1.2 反转录试剂

　　M-MLV RT (200U/μL) 、5×RT缓冲液 、dNTP(10 mmol/L) 、RNasin(40U/μL) 。

　　C. 1.3 PCR试剂

　　10×PCR缓冲液 、氯化镁(25 mmol/L) 、dNTP(10 mmol/L) 、Taq酶(5U/μL) 。

　　C. 1.4 电泳试剂

　　C. 1.4. 1 50× TAE

　　Tris

　　冰醋酸

　　乙二胺四乙酸二钠

　　242 g

　　52. 1 mL 37. 2 g

　　加水定容至 1 L,用时加水稀释至 1×TAE。

　　C. 1.4.2 6×加样缓冲液

　　0. 25%溴酚蓝

　　40%(质量分数)蔗糖水溶液

　　C.2 实验步骤

　　C.2. 1 引物合成

　　依据玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因保守序列 ,设计一对特异性扩增引物 ,见表 C. 1。

　　表 C. 1 引物序列

　　C.2.2 总 RNA提取

　　使用 Trizol法提取总 RNA。称取 1 g 植物叶片组织加液氮研磨成粉末 状 , 迅 速 将 其 移 入 灭 菌 的

　　1. 5 mL离心管中 ,加入 1 mL Trizol试剂 ,剧烈振荡摇匀 3 min;4 ℃ ,12 000g 离心 10 min;取上清液 ,加入 0. 2 mL三氯甲烷 ,上下颠倒混匀 ,室温静置 3 min;4℃ ,12000g 离心 10min;取上层水相 ,加等体积的异丙醇 ,颠倒混匀;4℃ ,12000g 离心 10min,弃上清液 ;加 75%的乙醇洗涤沉淀;4℃ ,7500g 离心 2 min,弃乙醇 ;沉淀于室温下充分干燥后 ,溶于 30 μLDEPC处理的超纯水中 ,用微量分光光度仪测核酸的浓度和纯度 , -20 ℃保存备用 。

　　C.2.3 cDNA合成

　　反转录总体系为 12. 5 μL。在 PCR管中依次加入 1 μL总 RNA,1 μL引物 MCMV2(20μmol/L) , 65 ℃温浴 5 min后迅速冰浴 5 min,瞬间离心后向 PCR管中加入下列试剂 :

　　M-MLV RT(200U/μL) 0. 5 μL

　　5×RT缓冲液 2. 5 μL

　　dNTP(10 mmol/L) 0. 5 μL

　　RNasin(40U/μL) 0. 5 μL

　　ddH2 O 6. 5 μL

　　逆转录条件 :37 ℃保温 60 min,70 ℃ 15 min灭活反转录酶 。cDNA 于 -20℃冰箱保存备用 。

　　C.2.4 PCR扩增

　　PCR反应体系 见 表 C. 2, 反 应 参 数 : 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 1 min, 60℃ 50 s, 72 ℃ 60 s, 35个 循 环 ; 72 ℃ 10 min。也可采用商业化一步法 RT-PCR试剂盒进行扩增 。

　　表 C.2 PCR反应体系

　　C.2.5 琼脂糖电泳

　　RT-PCR产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析 ,每个样品取 5 μL扩增产物与 1 μL的 6×加样缓冲液混合均匀点样 ,用 DNA Marker作分子标记 ,在 1×TAE 中以 5 V/cm 的电压电泳 50 min,溴化乙锭溶液(0. 5 μg/mL)染色 10 min,在凝胶成像系统上观察并记录结果 。

　　C.3 结果判断

　　阳性对照在 429bp左右处有扩增片段 , 阴性对照和空白对照无特异性扩增 ,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带 ,判定为阳性 。

　　阳性对照 、阴性对照和空白对照正确 ,样品未出现与阳性对照一致的扩增条带 ,判定结果为阴性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　玉米褪绿斑驳病毒实时荧光 RT-PCR检测

　　D. 1 引物和探针

　　引物和探针见表 D. 1。

　　表 D. 1 引物和探针

　　D.2 总 RNA提取

　　操作方法见 C. 2. 2。

　　D.3 cDNA合成

　　反转录总体系为 12. 5 μL。在 PCR管中依次加入 1 μL总 RNA,1 μL引物 MCMV TR(20μmol/L) , 65 ℃温浴 5 min后迅速冰浴 5 min,瞬间离心后向 PCR管中加入下列试剂 :

　　M-MLV RT(200U/μL) 0. 5 μL

　　5×RT缓冲液 2. 5 μL

　　dNTP(10 mmol/L) 0. 5 μL

　　RNasin(40U/μL) 0. 5 μL

　　ddH2 O 6. 5 μL

　　逆转录条件 :37 ℃保温 60 min,70 ℃ 15 min灭活反转录酶 。cDNA 于 -20℃冰箱保存备用 。

　　D.4 实时荧光 RT-PCR

　　以 cDNA 为模板 ,进行实时荧光 RT-PCR反应 ,反应体系见表 D. 2。

　　实时荧光 RT-PCR扩增参数为 :95 ℃ 2 min,然后进行 40个循环 ,每个循环 95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s。

　　反应体系中各试剂的量根据具体情况或不同仪器可进行适当调整 ,也可采用商业化一步法或两步法实时荧光 RT-PCR试剂盒 。

　　表 D.2 实时荧光 RT-PCR反应体系

　　D.5 结果判定

　　实时荧光 PCR反应结束后 ,应设置阈值 。一般选择 3个 ~ 15个循环的阴性对照的 10倍标准差作为阈值 , 以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点 ,且 Ct值等于 40为准 ,且阳性对照和空白对照结果正常 。

　　待测样品 Ct值等于 40,则可判定未检出玉米褪绿斑驳病毒 。

　　待测样品 Ct值小于或等于 35,则可判定检出玉米褪绿斑驳病毒 。

　　待测样品 Ct值在 36~40之间 ,应重做实时荧光 PCR扩增 。再次扩增后的结果 Ct值为 40,则判定未检出玉米褪绿斑驳病毒 。再次扩增后的结果 Ct值小于 40而 大 于 35, 则 可 判 定 检 出 玉 米 褪 绿 斑 驳病毒 。

　　参 考 文 献

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