GB/T 31809-2015 油棕猝倒病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31809—2015

　　油棕猝倒病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPythium splendens Braun

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31809—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :张慧丽 、张建成 、顾建锋 、郑炜 、徐瑛 、陈先锋 、段维军 、陈吴健 、吴志毅 、杜洪忠 、吴品珊 。

　　油棕猝倒病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了油棕猝倒病菌的形态学和分子生物学检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于油棕猝倒病菌寄主植物的植株 、插枝等植物材料及介质的检疫鉴定 。

　　2 仪器设备

　　生物显微镜(具油镜镜头) 、具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于 50×) 、高压灭菌锅 、天平(感量 1/100 g,1/10 000 g) 、研钵 、制冰机 、纯水仪 、涡旋振荡器 、台式离心机 、分光光度计 、高速冷冻离心机 、真空抽干仪 、低温冰箱 、冷藏冷冻冰箱 、超净工作台 、普通 PCR 仪 、光学 PCR反应管、pH 计 、电泳仪 、水 平 电 泳 槽 、实 时 荧 光 PCR 仪 、微 量 移 液 器 (0. 5 μL、2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、 1 000 μL) 、PCR反应管(0. 2 mL、0. 5 mL) 、锥形瓶 、试管 、培养皿 、载玻片 、盖玻片 。

　　3 主要试剂和培养基

　　除另有规定外 ,所有试剂均采用分析纯 。无菌双蒸水 、液氮 、蛋白酶 K、氢氧化钠 、醋酸铵 、氯化钾 、无水乙醇 、溴 化 乙 锭 、三 氯 甲 烷 、异 丙 醇 、异 戊 醇 、氨 苄 青 霉 素 、利 福 平 、制 霉 菌 素 、苯 菌 灵 、氯 化 钠 、 CTAB、Taq DNA 聚合 酶 、dNTP 混 合 物 、10× PCR 缓 冲 液 、琼 脂 糖 、DNA 分 子 量 标 准 、Tris/EDTA/ SDS提取缓冲液(TES) 、Tris/EDTA缓冲液(TE) 、Tris硼酸盐 EDTA 缓冲液(TBE) 等 。 培养基及缓冲液配制方法见附录 B。

　　4 检疫鉴定

　　4. 1 症状检查

　　仔细检查根部 , 根 部 症 状 是 软 化 变 褐 , 腐 烂 ; 茎 部 症 状 是 出 现 灰 色 或 棕 黑 色 水 渍 状 斑 点 (参 见附录 A) 。对可疑植物和繁殖材料的介质土应取样做进一步检验 。

　　4.2 组织分离

　　选萎蔫及根部变褐但没有完全腐烂的植物材料 ,用流动的自来水冲洗干净 ,在根茎病健交界处切取0. 5 cm×0. 5 cm 的小块组织 ,用 1%次氯酸钠进行表面消毒 3 min,无菌水冲洗 3 次 ,灭菌滤纸吸干表面水分后 ,置于选择性培养基上 ,25 ℃ ~ 30 ℃黑暗培养 ,每天观察 ,待长出菌丝后 ,挑取菌丝尖端转移到基础培养基上纯化 ,保存备用 。

　　4.3 土壤诱集

　　对禾本科植物叶片(如 :马唐 、狗尾草 、稗草等)进行高温高压灭菌处理 ,剪成直径 1 cm 大小的小片作为诱饵 。取 5 g~ 20g土壤样品研磨破碎放入 50mL灭菌洁净烧杯中 ,厚度不超过 2 cm ,缓慢加入无菌水没过土表 1 cm~ 2 cm ,用吸水纸轻轻去掉形成的表面膜和漂浮的有机物残渣 ,每烧杯水面放置诱饵 10片左右 。静置过夜 ,体式显微镜下观察 ,将有菌丝体长出的诱饵取出 ,用无菌水洗净表面 ,无菌吸

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　　水纸吸干 ,放入选择性培养基平板上培养 。待长出菌落后镜检 ,菌丝体呈棉絮状 ,分枝 ,无隔多核 ,挑取菌丝尖端转移到基础培养基上纯化 ,保存备用 。

　　4.4 培养物观察

　　得到病菌纯培养物后 ,挑出菌丝制片 。 用解剖针将菌丝尽量展开 , 观察病菌特征 。需测量不少于30个菌丝膨大体大小 ,计算平均值 。

　　4.5 PCR鉴定方法

　　PCR鉴定方法见附录 C。

　　5 鉴定特征

　　5. 1 培养性状

　　在基础培养基上菌落边缘整齐 ,气生菌丝发达 ,蛛丝状 。

　　5.2 形态特征

　　5.2. 1 菌丝和菌丝体

　　菌丝不规则分枝 ,菌丝宽 3. 5 μm~ 9. 2 μm ,平均 6. 4 μm。培养基上菌丝膨大体丰富 , 叶片诱集可产生大量菌丝膨大体 。菌丝膨大体(参见附录 A)球形至近球形 ,光滑 ,通常顶生 ,很少间生 ,直径 25 μm~ 49μm ,在异宗配合腐霉中油棕猝倒病菌的菌丝膨大体直径最大 ,平均 38 μm ,其余种菌丝膨大体平均直径小于 30 μm ,菌丝膨大体内充满颗粒状原生质 ,菌丝膨大体需在有水的情况下经数小时萌发 ,萌发时每个膨大体产生 1个 ~ 6个芽管 ,不产生游动孢子囊和游动孢子 。

　　5.2.2 有性生殖阶段特征

　　有性繁殖为异宗配合 ,但有些分离物单培养也可以形成藏卵器 ,藏卵器也可以出现在老化的培养物或培养数年的菌株上 。藏卵器顶生或间生 ,球形 ,器壁光滑 、薄 ,直径 24 μm~ 38 μm。雄器异丝生 ,顶生 ,偶尔间生 ,每个藏卵器 1 个 ~ 8 个雄器 ,柄有时分支或分叉 , 多个雄器同时围绕一个藏卵器 ,雄器细胞大 ,通常 20μm×15μm ,直或颈状弯曲 。卵孢子游离在藏卵器内 ,不满器 ,与藏卵器的比例为1 ∶ 1. 2,直径 20 μm~ 33 μm ,壁光滑 ,薄 ,壁厚 1 μm~ 2 μm(参见附录 A) 。

　　6 结果判定

　　以油棕猝倒病菌在寄主上的症状 、分离物的培养特征 、无性及有性世代阶段特征等作为鉴定依据 ,进行综合判定 。若以上特征与第 5 章鉴定特征吻合 ,则鉴定为油棕猝倒病菌 。若菌丝膨大体平均值小于 38μm ,应进行分子鉴定 ,分子鉴定结果为阳性 ,可判定为油棕猝倒病菌 。

　　7 样品保存与结果记录

　　7. 1 样品保存

　　经检验确定携带油棕猝倒病菌的样品,经登记和标记后视样品的状态采用相应的保存方式 ,妥善保存 6个月 , 以备复核 。保存期满后 ,应经灭菌处理 。

　　7.2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为油棕猝倒病菌的菌株 ,应妥善保存 。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理 。

　　7.3 结果记录与资料保存

　　需要保存的记录包括 :样品的种类 、自然状态 、来源 、被为害状及为害程度(无症状也要说明) ,诊断时使用的方法 ,PCR检测应有电泳结果照片 ,鉴定实验室的名称 ,负责人和鉴定人的签字等 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　油棕猝倒病菌相关信息

　　A. 1 油棕猝倒病菌基本信息

　　学名 :Pythium splendens Braun

　　异名 :Globisporangium splendens

　　中文名 :油棕猝倒病菌 、油棕苗疫病菌 、天竺葵黑胫病菌 、华丽腐霉

　　分类地位 :藻菌界(Chromista) ,卵菌门(Oomycota) ,卵菌纲(Oomycetes) ,腐霉目(Pythiales) ,腐霉科(Pythiaceae) ,腐霉属(Pythium) 。

　　近似种 :腐霉属中异宗配合且产生球状菌丝膨大体的种有 4 种 ,其中间型腐霉(P.intermedium) 菌丝膨大体为链生 ,与其他 3种差异明显 ,本标准列出了油棕猝倒病菌与其他 3种近似种的主要区别 。

　　传播途径 :通过带菌的土壤和繁殖材料进行传播 。

　　A.2 方法原理

　　根据油棕猝倒病菌在寄主植物上的症状 ,通过组织分离 、土壤诱集对病原菌进行分离培养 ,采用形态学(参见 A. 4)和分子生物学方法对病原菌进行鉴定(见附录 B 和附录 C) 。

　　A.3 病害症状

　　在大多数寄主植物上引起种腐 , 出苗前疫病或苗期猝倒 ,在红薯上产生坏死斑 ,在天竺葵属(Pelar- gonium spp.)植物上引起黑胫病 ,在胡椒(Pipernigrum) 上引起萎蔫症状 ,在大黄(Rheum oficinale)上引起冠腐 ,在芦荟属(Aloe spp.) 植物上引起根腐 。 图 A. 1 所 示 为 油 棕 猝 倒 病 菌 在 卡 瓦 胡 椒(Piper methysticum)上的为害症状 。

　　说明 :

　　a— 根腐 ;

　　b— 根和茎基部腐烂 ;

　　c— 萎蔫 ;

　　d— 根腐 ,植株衰退 。

　　注 : 引 自 ScotNelson,2005。

　　图 A. 1 油棕猝倒病菌在卡瓦胡椒(Pipermethysticum)上的为害症状

　　A.4 形态特征(见图 A.2 和图 A.3)

　　说明 :

　　a~ c— 菌丝膨大体 ,a、b 为顶生 ,c为间生 ;

　　d — 菌丝膨大体萌发产生芽管 ;

　　e — 藏卵器 、雄器 ;

　　f~ l — 藏卵器 、雄器 、卵孢子 。

　　注 : 引 自 Hon H. Ho2011,标尺均为 20 μm。

　　图 A.2 油棕猝倒病菌的形态特征

　　说明 :

　　1~ 2 — 菌丝膨大体 ;

　　3~ 11— 藏卵器 、雄器 、卵孢子 。

　　注 : 仿自 Van derPlaats-Niterink,1969。

　　图 A.3 油棕猝倒病菌的形态特征墨线图

　　A.5 寄主

　　油棕猝倒病菌能够侵染 250余种植物 ,主要为害的经济作物有 :芦荟属(Aloe spp.) 、菠萝蜜(Arto- carpusheterophyllus) 、秋海棠 属(Begonia spp.) 、木 豆(Cajanus cajan) 、洋 刀 豆(Canavalia ensifor- mis) 、辣 椒 属 (Capsicum spp.) 、番 木 瓜(Carica papaya) 、菊 属 (Chrysanthemum spp.) 、酸 橙 (Citrus aurantium) 、锦紫 苏 (Coleusblumei) 、黄 瓜 (Cucumis sativus) 、兰 属 (Cymbidium spp.) 、花 叶 万 年 青(Dieffenbachiapicta) 、油棕(Elaeisguineensis) 、老鹳草属(Geranium spp.) 、向 日葵(Helianthusann- uus) 、大麦(Hordeum vulgare) 、番薯(Ipomoeabatatas) 、莴苣(Lactuca sativa) 、麝香百合(Lilium lon- giflorum) 、亚麻(Linum usitatissimum) 、木薯(Manihotesculenta) 、紫苜蓿(Medicago sativa) 、草木樨属(Melilotus spp.) 、烟草(Nautilocalyx lynchei) 、天竺葵属(Pelargonium spp.) 、绿豆(Phaseolusau- reus) 、菜 豆 (Phaseolus vulgaris) 、湿 地 松 (Pinus elliottii) 、卡 瓦 胡 椒 (Piper methysticum) 、胡 椒(Pipernigrum) 、豌 豆 (Pisum sativum) 、洋 梨 (Pyrus communis) 、萝 卜 (Raphanus sativus) 、大 黄(Rheum oficinale) 、甘 蔗(Saccharum oficinarum) 、菠 菜(Spinacia oleracea) 、车 轴 草 属(Trifolium

　　spp.) 、小麦(Triticumaestivum) 、蚕豆(Viciafaba) 、豇豆(Vigna sinensis) 、玉米(Zea mays)等 。

　　A.6 地理分布

　　非洲 :科特迪瓦 、马达加斯加 、尼 日利亚 、南非 、坦桑尼亚 。

　　亚洲 :马来西亚 、日本 、新加坡 、伊朗 、印度 、越南 、阿曼 、中国台湾 。

　　大洋洲 :澳大利亚 、斐济 、新喀里多尼亚 、新西兰 、巴布亚新几内亚 、所罗门群岛 。

　　欧洲 :爱尔兰 、比利时 、德国 、法国 、荷兰 、葡萄牙 、意大利 、英国 。

　　美洲 : 巴西 、波多黎各 、哥伦比亚 、美国(佛罗里达州 、加利福尼亚州 、特拉华州 、爱荷华州 、印第安纳州 、密西西比州 、马里兰州 、北卡罗莱纳州 、新泽西州 、宾夕法尼亚州 、弗吉尼亚州 、华盛顿州 、北达科他州 、密苏里州 、夏威夷州) 、特立尼达和多巴哥 、牙买加 。

　　A.7 近似种

　　油棕猝倒病菌与近似种的区别见表 A. 1。

　　表 A. 1 油棕猝倒病菌与近似种的区别

　　附 录 B

　　(规范性附录)培养基及缓冲液

　　B. 1 基础培养基

　　B. 1. 1 10% V8培养基

　　100 mL V8蔬 菜 汁 , 碳 酸 钙 0. 2 g,琼 脂 粉 20 g,蒸 馏 水 补 足 到 1 000 mL。 121 ℃高 压 蒸 汽 灭 菌20 min。

　　B. 1.2 番茄汁培养基

　　可作为 V8培养基的替代 。新鲜番茄洗净 ,切片 ,食品搅拌器打碎 , 汁液通过 1. 5 mm 孔径的筛子 ,除去种子和大块组织 ,滤汁备用 。 100mL番茄汁加水到 1000mL,加热到 100 ℃ ,再加入碳酸钙0. 2 g,琼脂粉 20 g。 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。

　　B.2 选择性培养基

　　用于油棕猝倒病菌病原菌的分离和纯化 。

　　1000mL基础培养基 121 ℃高压蒸汽灭菌 20min,冷却到 55 ℃左右时加入下列抗菌素(均为有效成分) :氨苄青霉素 200 mg,利福平 100 mg,制霉菌素 50 mg,苯菌灵 100 mg,摇匀 ,制成平板 。其中研究用纯苯菌灵粉剂和纯利福平粉剂应事先配制成乙醇溶液(母液) ,并使培养基中的最终乙醇浓度不大于 0. 5% 。苯菌灵可用相同药量的五氯硝基苯替代 。

　　B.3 TES提取缓冲液

　　100 mmol/LTris-HCl(pH 8. 0) 、10 mmol/L EDTA、20 g/L SDS。

　　B.4 CTAB/NaCl溶液

　　100 g/L CTAB、0. 7 mol/L NaCl。

　　B.5 Tris硼酸盐 EDTA 缓冲液(TBE)

　　5×贮存液 :Tris54 g,硼酸 27. 5 g,0. 5 mol/LEDTA(pH 8. 0)20mL,蒸馏水补足 1000mL。使用时稀释到 0. 5倍 。

　　B.6 Tris/EDTA缓冲液(TE)

　　10 mmol/LTris-HC1,1 mmol/L EDTA,pH 8. 0。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　油棕猝倒病菌的 PCR方法

　　C. 1 引物序列

　　P. splendens 的特异性引物 Pspl和 ITS-2的序列见表 C. 1。

　　表 C. 1 特异性引物序列

　　C.2 DNA提取

　　C.2. 1 收集经干燥过的菌丝约 0. 5 g放入 1. 5 mL浸在液氮里的离心管中 ,用塑料杵碾碎待用 。

　　C. 2.2 离心管中加入 1 mL TES提取缓冲液 ,另加入 100mg~ 200mg蛋白酶 K,55 ℃保温 30min,期间轻轻混匀 。

　　C.2.3 加入 5 mol/L NaCl28μL、CTAB/NaCl溶液 138μL,65 ℃保温 10 min。

　　C.2.4 4 ℃ 13 000g 离心 10 min,保留上清液 。

　　C.2.5 加入等体积的三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 24 ∶ 1) ,轻轻混匀 ,冰浴 30 min。

　　C.2.6 4 ℃ 13 000g 离心 10 min,保留上清液 。

　　C.2.7 加入 450 μL 5 mol/LNH4Ac,冰浴至少 30 min。

　　C.2. 8 4 ℃ 16000g 离心 10 min,保留上清液 。

　　C.2.9 加入约 2/3体积的异丙醇沉淀 DNA,13 000g 离心 15 min。

　　C.2. 10 DNA沉淀用 1 mL 70%乙醇洗 2 次 ;室温干燥 ,用 100 μLTE缓冲液溶解 DNA备用 。

　　注 : DNA提取也可使用商业化试剂盒 。

　　C.3 PCR扩增

　　反应体系见表 C. 2,每个样品设 2个平行处理 。 以油棕猝倒病菌 DNA或含有油棕猝倒病菌目标片断的质粒作为阳性对照 , 以其他真菌菌株 DNA作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　表 C.2 PCR反应体系

　　PCR反应条件为 :94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 10 min。

　　C.4 产物检测

　　在 0. 5×TBE 电泳缓冲液中 ,1. 5%琼脂糖凝胶电泳 ,5 V/cm ,0. 5% EB染色 20 min,凝胶成像仪分析结果 。

　　C.5 结果判定

　　在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带 、阳性对照产生约 150 bp的预期大小条带情况下 :如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阳性 ;

　　如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阴性 。

　　参 考 文 献

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