GB/T 31807-2015 棉花根腐病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31807—2015

　　棉花根腐病菌检疫鉴定方法

　　Detection andidentification ofPhymatotrichopsisomnivora (Duggar) Hennebert

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31807—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :张慧丽 、张卫东 、段维军 、徐瑛 、陈先锋 、崔俊霞 、杜洪忠 、吴品珊 。

　　棉花根腐病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了棉花根腐病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于棉花根腐病寄主植物的植株 、种子及介质的检疫鉴定 。

　　2 仪器设备和主要试剂

　　2. 1 仪器设备

　　显微镜 、解剖镜 、天平(感量 1/100 g,1/10 000 g)、pH 计 、制 冰 机 、纯 水 仪 、涡 旋 振 荡 器 、台 式 离 心机 、高速冷冻离心机 、低温冰箱 、冷藏冷冻冰箱 、超净工作台 、PCR 仪 、电泳仪 、水平电泳槽 、凝胶成像仪 、微量移液器(2μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL) 。

　　2.2 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均采用分析纯 。包括无菌双蒸水 、次氯酸钠 、液氮 、蛋白酶 K、氯化镁 、氢氧化钠 、醋酸铵 、氯化钾 、无水乙醇 、溴化乙锭 、三氯甲烷 、异丙醇 、异戊醇 、Taq DNA 聚合酶 、dNTP混合物 、10× PCR 缓 冲 液 、琼 脂 糖 、DNA 相 对 分 子 质 量 标 准 物 、CTAB、Tris/EDTA/SDS 提 取 缓 冲 液(TES) 、Tris硼酸盐 EDTA缓冲液(TBE) 、Tris/EDTA 缓冲液(TE) 等 。 分离培养基 、产孢培养基 、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)配制方法及步骤见附录 C。

　　3 病菌的鉴定

　　3. 1 症状检查

　　将可疑植株的根部在解剖镜下镜检 ,将带有菌丝索或菌核的病根挑出 。种子类样品,从中挑选夹带的植株残体 ,尤其是根部病残体 。介质土借助湿筛挑出其中的菌核(参见附录 B) 。

　　3.2 病原菌的分离培养

　　3.2. 1 病根上菌丝索的分离培养

　　在解剖镜下 ,将病根 上 覆 盖 的 菌 丝 索 挑 下 , 用 无 菌 水 洗 涤 菌 丝 片 段 , 洗 净 后 置 于 分 离 培 养 基 上 , 28 ℃ 黑暗培养 ,每天观察 ,待长出菌丝后 ,挑取菌丝尖端转移到 PDA平板上纯化 。

　　3.2.2 病残体上病原菌的分离培养

　　在自来水下将病残体洗净 ,切取病健交界处组织 ,用 1%次氯酸钠进行表面消毒 3 min,无菌水冲洗3 次 ,灭菌滤纸吸干表面水分后 ,置于分离培养基上 , 28 ℃黑暗培养 , 每天观察 , 待长出菌丝后 , 挑取菌丝尖端转移到 PDA平板上纯化 。

　　3.2.3 菌核上病原菌的分离培养

　　菌核上病原菌的分离培养方法同 3. 2. 2。

　　GB/T 31807—2015

　　3.3 分生孢子的诱导

　　将纯化好的菌株接种到产孢培养基上 ,28 ℃ ,每天光照 16 h。 每天观察 ,待产孢后 ,显微镜下观察分生孢子的形态特征 。

　　3.4 PCR鉴定方法

　　PCR鉴定方法见附录 D。

　　4 鉴定特征

　　4. 1 症状特点

　　寄主植物受侵染后 ,根的表面覆盖有棕褐色至金黄色菌丝索(参见 B. 1) ,根部变软 、腐烂 、皮层易剥落 , 中柱变色或出现红褐色病斑(参见 B. 1) ,有时根表面还可以看到棕色至黑色的菌核 。

　　4.2 病菌的形态特征

　　病菌在 PDA 平 板 上 菌 落 初 为 白 色 , 后 变 为 污 黄 色(参 见 B. 2) 。 分 生 孢 子 梗 球 形 或 椭 圆 形 , 大 小(12μm~ 20 μm) × (20 μm~ 30 μm) ,少数情况下分生孢子梗呈棍棒状或串珠状 ,其顶部产生分生孢子 ,外观上类似 “担子 ”(参见 B. 2) 。分生孢子单胞 ,透明 ,球形或卵圆形 ,着生于多分枝的菌丝上 ,直径

　　4. 8 μm~ 5. 5 μm 或(6μm~ 8 μm) × (5μm~ 6 μm)(参见 B. 2) 。菌丝索褐色 ,直径约 200μm ,成直角伸出侧枝 ,侧生菌丝呈十字形分枝(参见 B. 2) 。菌核棕色或黑色 , 圆形或不规则形 ,直径 1 mm~ 5 mm ,单生或串生 ,萌发后长白色菌丝 ,后变污黄色(参见 B. 3) 。

　　4.3 PCR特异性扩增

　　P. omnivora 的特异性扩增片段为 627bp。

　　5 结果判定

　　根据棉花根腐病菌的为害症状及病原菌形态特征对病菌分离物进行综合判定 ,分离物的为害症状及形态特征与第 4章各项鉴定指标吻合 ,判定为棉花根腐病菌 ,分离物的为害症状及形态特征不明显的情况下 ,分离物需要进行 PCR鉴定 ,PCR特异性扩增阳性 ,可判为棉花根腐病菌 。

　　6 样品保存与结果记录

　　6. 1 样品保存与处理

　　经检验确定携带棉花根腐病菌的样品,视样品的状态采用相应的保存方式 ,妥善保存 6 个月 , 以备复核 。保存期满后 ,应经灭菌处理 。

　　6.2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为棉花根腐病菌的菌株 ,应妥善保存 。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理 。

　　6.3 结果记录与资料保存

　　需要保存的记录包括 :样品的种类 、自然状态 、来源 、被为害症状及为害程度(无症状也要说明) ,诊断时使用的方法(包括质控物质 , 以及每种方法获得的结果) ,PCR检测应有电泳结果照片 ,鉴定实验室的名称 ,负责人和鉴定人的签字等 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　棉花根腐病菌相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 棉花根腐病菌基本信息

　　学名 :Phymatotrichopsisomnivora(Duggar) Hennebert

　　异名 : Phymatotrichum omnivorum Duggar, Ozonium omnivorum Shear, Ozonium auricomum Link

　　英文名 :Phymatotrichum rootrot,Texas rootrot

　　分类地位 : 半 知 菌 门 (Deuteromycota) , 丝 孢 纲 ( Hyphomycetes) , 丝 孢 目 (Moniliales) , 淡 色 孢 科(Moniliaceae) ,拟瘤梗孢属(Phymatotrichopsis) 。

　　传播途径 :病原菌可通过病根 、混有病残体和菌核的土壤等进行远距离传播 。

　　近似种 :波状根盘菌(Rhizinaundulata)引起的松苗根腐病 ,在地下产生菌丝索 ,覆盖在受侵染的根表面 ,与棉花根腐病引起的症状相似 ,但是波状根盘菌在子囊盘上形成子囊孢子 ,孢子纺锤形或棱形 ,无分隔 ,两端突尖 ,含两个小油滴 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据棉花根腐病菌在寄主植物上的症状 ,对病原菌进行分离培养 ,采用形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定(参见附录 B、附录 C) 。

　　A.2 地理分布

　　非洲 :利比亚 。

　　北美洲 :墨西哥(北部)和美国(西南部的 9个州 ,包括亚利桑那州 、阿肯色州 、加利福尼亚州 、路易斯安那州 、内华达州 、新墨西哥州 、俄克拉荷马州 、得克萨斯州 、犹他州) 。

　　中美洲 :多米尼加共和国 。

　　南美洲 :委内瑞拉 。

　　A.3 寄主

　　主要寄主是棉花 ,还可以侵染 2 300多种双子叶植物 ,但不侵染单子叶植物(参见表 A. 1) 。

　　表 A. 1 棉花根腐病菌的寄主

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　表 A. 1 (续)

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　棉花根腐病菌为害症状及形态特征

　　说明 :

　　a— 受侵染的棉花根部 ,箭头示菌丝索 ; b— 去除表皮后皮层受害状 。

　　注 : a引 自 S. M. MARKER 2009,b 引 自 S. R. UPPALAPATI2010。

　　图 B. 1 棉花根腐病菌为害症状

　　说明 :

　　a — 棉花根腐病菌在 PDA上的菌落形态 ;

　　b — 分生孢子在分生孢子梗上萌发 ,标尺为 10 μm; c、d— 担子状分生孢子 ,标尺为 10 μm;

　　e— 分生孢子梗和分生孢子 ,标尺为 25 μm; f— 菌丝索 ,标尺为 100 μm;

　　g— 直角分支的菌丝 ,标尺为 50 μm。

　　注 : b~ g 引 自 S. M. MARKER 2009。

　　图 B.2 棉花根腐病菌形态特征

　　图 B.3 棉花根腐病菌针状分支菌丝体

　　说明 :

　　a— 湿筛法从土壤中获得的菌核 ;

　　b— 菌核在分离培养基上萌发 。

　　注 : 引 自 S. M. MARKER 2009。

　　图 B.4 棉花根腐病菌菌核及萌发

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　培养基及配制方法

　　C. 1 分离培养基

　　121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。 培 养 基 冷 却 至 47 ℃时 无 菌 操 作 下 添 加 硫 酸 链 霉 素 并 混 匀 , 倒 板备用 。

　　C.2 产孢培养基

　　称取 200 g 马铃薯 ,洗净去皮切成小块 ,加水煮沸 30 min,纱布过滤加入葡萄糖 20 g、琼脂 18 g,混匀后定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　棉花根腐病菌的 PCR鉴定

　　D. 1 试剂

　　D. 1. 1 Tris/EDTA/SDS提取缓冲液(TES)

　　100 mmol/LTris-HCl(pH8. 0) 、10 mmol/L EDTA、20 g/L SDS。

　　D. 1.2 CTAB/NaCl溶液

　　100 g/L CTAB、0. 7 mol/L NaCl。

　　D. 1.3 Tris硼酸盐 EDTA 缓冲液(TBE)

　　5×储存液 :Tris54 g,硼酸 27. 5 g,0. 5 mol/LEDTA(pH8. 0)20 mL,蒸馏水补足 1 000 mL。使用时稀释到 0. 5倍 。

　　D. 1.4 Tris/EDTA缓冲液(TE)

　　10 mmol/LTris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH8. 0。

　　D.2 DNA提取

　　D.2. 1 收集经干燥过的菌丝约 0. 5 g放入 1. 5 mL浸在液氮里的离心管中 ,用塑料杵碾碎待用 。

　　D. 2.2 离心管中加入 1 mL TES提取缓冲液 ,另加入 100mg~ 200mg蛋白酶 K,55 ℃保温 30min,期间轻轻混匀 。

　　D.2.3 加入 5 mol/L NaCl28μL、CTAB/NaCl溶液 138μL,65 ℃保温 10 min。

　　D.2.4 4 ℃ 13000g离心 10 min,保留上清液 。

　　D.2.5 加入等体积的三氯甲烷 ∶ 异 戊 醇(体 积 比 24 ∶ 1) , 轻 轻 混 匀 , 冰 浴 30 min; 4 ℃ 13 000g 离 心10 min,保留上清液 。

　　D.2.6 加入 450 μL 5 mol/L醋酸铵 ,冰浴至少 30 min。

　　D.2.7 4 ℃ 16000g离心 10 min,保留上清液 。

　　D.2. 8 加入约 2/3体积的异丙醇沉淀 DNA,13000g离心 15 min。

　　D.2.9 DNA沉淀用 1 mL 70%乙醇洗 2 次 ;室温干燥 ,用 100 μLTE缓冲液溶解 DNA备用 。

　　注 : 也可使用商业化试剂盒提取 DNA。

　　D.3 引物序列

　　P. omnivora 的特异性引物的序列见表 D. 1。

　　表 D. 1 特异性引物序列

　　D.4 PCR扩增

　　反应体系见表 D. 2,每个样品设 2 个平行处理 。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。检测时以棉花根腐病菌 DNA或含有棉花根腐病菌目标片断的质粒作为阳性对照 , 以其他真菌菌株 DNA作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　表 D.2 PCR反应体系

　　PCR反应条件为 :94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 10 min。

　　D.5 产物检测

　　在 0. 5×TBE 电泳缓冲液中 ,1. 5%琼脂糖凝胶电泳 ,5 V/cm ,0. 5% EB染色 20 min,凝胶成像仪分析结果 。

　　D.6 结果判定

　　在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带 、阳性对照产生约 627bp的预期大小条带情况下 :

　　— 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阳性 ;

　　— 如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带 ,则为阴性 。

　　参 考 文 献

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