GB/T 31808-2015 向日葵白锈病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31808—2015

　　向 日葵白锈病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofAlbugotragopogonis (Pers.) S. F. Gray

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31808—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国新疆出入境检验检疫局 、新疆生产建设兵团农业技术推广总站 。

　　本标准主要起草人 :张祥林 、王翀 、赵冰梅 、王文正 、张江国 、乾义柯 。

　　向 日葵白锈病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了向 日葵白锈病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于向 日葵种子和植株中向 日葵白锈病菌的检疫和鉴定 。

　　2 仪器和用具

　　生物显微镜 、体视显微镜 、超净工作台 、高压灭菌器 、高速离心机 、制冰机 、全温水浴 、PCR 扩增仪 、电泳仪 、凝胶成像仪 、往复式振荡器 、培养皿 、烧杯 、酒精灯 、三角瓶 、载玻片 、盖玻片 、镊子 、剪刀 、量筒 、吸管 。

　　3 试剂

　　乳酸 、苯酚 、甘油 、棉蓝 、藏红花 、次氯酸钠(NaClO) , 十二烷基硫酸钠(SDS) ,三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) ,氯化镁(MgCl2 ) , 乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA) , 氢氧化钠(NaOH) , 醋酸钠(NaOAc) ,氯化钾(KCl) ,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) ,无水乙醇(Ethanol) ,苯酚(Phenol) ,三氯甲烷(Chloro- form) , 异丙醇(Isopropanol) , 异 戊 醇(Isoamyl alcohol) , 核 酸 染 料(SYBR Green Ⅰ ) , 蛋 白 酶 K,Taq DNA 聚 合 酶 (Taq DNA polymerase) , 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 (dNTP) , DNA 分 子 量 标 记 (DNA Marker) ,TAE 电泳缓冲液(TAE buffer) 。

　　4 检疫鉴定方法

　　4. 1 田间症状检查

　　在向 日葵现蕾中期至盛花期 ,到向 日葵隔离种植区或大田进行调查 ,观察向 日葵植株发病情况 。

　　4.2 种子带菌检查

　　选取 5 g 瘪小的向 日葵种子 ,置于干净三角瓶中 ,加入 200mL清水和少量洗衣粉 ,在往复式振荡器上振荡 10min,倒去洗涤液 ,再加入等量的清水 ,重复洗涤 3 次 ~ 5 次 ,直至洗净向 日葵种子上的种衣剂(如无种子包衣 ,可省略此步) , 晾干 ,剥开向 日葵种子 ,将果皮和种仁一起放入装有乳酚油的烧杯中 ,酒精灯下煮沸 3 min,冷却后在解剖镜下用镊子剥取内果皮和种皮 ,放入一干净培养皿中 ,加入少量棉蓝-藏红花染色液 ,静置 5 h左右 ,用 95%乙醇清洗后 ,用镊子夹取内果皮或种皮置于载玻片上 ,加一滴乳酚油作浮载剂 ,盖片镜检 。

　　4.3 病原菌形态观察

　　用干净刀片刮取少量向 日葵病叶背面(或叶柄 、花盘等)的白色疱斑中的病菌 ,置于载玻片上 ,在生物显微镜下观察该病菌形态特征 ,记录孢囊梗 、孢子囊 、卵孢子的形状及大小 。

　　将制备的向 日葵内果皮或种皮玻片 ,置于生物显微镜下观察病菌形态特征 ,记录孢囊梗 、孢子囊 、卵孢子的形状及大小 。

　　GB/T 31808—2015

　　4.4 分子生物学检测

　　4.4. 1 DNA提取

　　取向 日葵种子或具疑似症状的向 日葵病组织 ,用 CTAB法或试剂盒法提取核酸(见附录 B) 。

　　4.4.2 巢式 PCR检测

　　向 日葵白锈病菌的巢式 PCR检测方法见 B. 2。

　　4.4.3 实时荧光 PCR检测

　　向 日葵白锈病菌的实时荧光 PCR检测方法见 B. 3。

　　5 鉴定特征

　　5. 1 为害症状

　　向 日葵受白锈病菌侵染为害后 ,在叶片正面产生淡黄色或淡绿色病斑 ,直径 1 mm~ 2 mm , 叶片背面相对应的部位形成突起的白色疱斑 。疱斑表皮破裂后散出白色粉状物(病原菌孢子囊) 。疱斑可相互汇合 ,形成大的斑块 。 田间发病严重时 , 向 日葵叶柄和花盘上也会发病 。

　　5.2 病原形态

　　向 日葵白锈病菌菌丝无色 ,分支 ,产生短的孢囊梗 , (31. 48μm~ 59. 19 μm) × (6. 07 μm~ 16. 12 μm) 。孢子囊成 串 产 生 。 孢 子 囊 球 形 、卵 形 或 多 角 形 , 单 胞 , 无 色 , (16. 32 μm ~ 21. 18 μm) × (15. 12 μm ~ 20. 54μm) 。卵孢子褐色至黑色 ,壁有刺突 ,生长在寄主组织(向 日葵种子 、叶片 、叶柄 、花盘等) 中 , 大小 (46. 57μm~ 66. 82μm) × (45. 49μm~ 65. 77μm) 。孢子囊在水滴中 30 min就可萌发 ,产生游动孢子 ,游动孢子直径 6 μm~ 12μm ,具 1条鞭毛 。经染色后 ,带菌向 日葵种子的果皮和种皮中可观察到蓝色菌丝体 、孢子囊和孢囊梗 , 以及褐色卵孢子 。

　　向 日葵白锈病菌的形态图参见附录 C。

　　5.3 巢式 PCR检测结果

　　在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,通用引物 NL1/NL4首轮 PCR 扩增片段大小为 700 bp,特异性引物 ATHP3/ATHP4第二轮 PCR扩增片段大小为 370 bp。

　　5.4 实时荧光 PCR检测结果

　　当空白对照的 Ct值 ≥40,供试菌株的 Ct值 ≤36,则检测结果为阳性 ,否则为阴性 。

　　6 结果判定

　　田间向 日葵为害症状同 5. 1, 向 日葵病组织(向 日葵病叶和种子)中病原菌的形态特征与 5. 2 的描述一致 ,可判定为向 日葵白锈病菌 。

　　在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,巢式 PCR扩增获得片段大小为 370 bp的条带 ,可判定为向 日葵白锈病菌 。

　　在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,用实时荧光 PCR法检测结果为 :

　　—Ct值小于或等于 36,则判定为向 日葵白锈病菌 ;

　　—Ct值大于或等于 40,则判定为非向 日葵白锈病菌 ;

　　—Ct值在 36~40之间 ,应重做实时荧光 PCR,再次扩增后 ,如 Ct值小于或等于 36或者 Ct值大于或等于 40,判定同上 ;如果检测 Ct值仍在 36~40之间 ,则应进行形态学方法鉴定 。

　　7 样品与原始数据保存

　　7. 1 样品保存

　　存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式妥善保存 。如样品中发现向 日葵白锈病菌 ,该样品应保存半年以上 , 以备复验 ,如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕 ,保存期满后应经灭菌处理 。

　　7.2 原始数据保存

　　样品检测结束后 ,其原始记录单和检验报告或证书应归档 ,妥善保管 , 以备复验 、谈判和仲裁 。

　　7.3 菌种保存

　　用干净剪刀将具典型症状的向 日葵白锈病叶剪成 1 cm×1 cm 左右的小片 ,置于菌种保藏管中 ,经脱水干燥后封好管盖 ,置于 4 ℃黑暗条件下保存至少 12个月 , 以备复验 、谈判和仲裁 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　向 日葵白锈病菌相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 病菌基本信息

　　中文名 : 向 日葵白锈病菌

　　英文名 :sunflower white rust

　　学名 :Albugotragopogonis (Pers. ) S. F. Gray

　　异名 :Albugotragopogi(Pers. ) Schroct,Cystopustragopogonis (Pers. ) J. Schrit

　　分 类 地 位 : 藻 菌 界 ( Chromista) 、卵 菌 门 ( Oomycota) 、卵 菌 纲 ( Oomycetes) 、霜 霉 目(Peronsporsles) 、白锈菌科(Albuginaceae) 、白锈菌属(Albugo) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据向 日葵白锈病菌形态学特征 、为害症状和目标片段的序列特征作为鉴定依据 。

　　A.2 地理分布

　　世界分布 :法国 、德国 、匈牙利 、罗马尼亚 、前苏联 、津巴布韦 、肯尼亚 、南非 、美国 、阿根廷 、乌拉圭 、玻利维亚 、澳大利亚 、印度 。

　　中国分布 :新疆伊犁 。

　　A.3 寄主范围

　　向 日葵(Helianthusannuus L. ) 。

　　A.4 传播途径

　　向 日葵白锈病菌主要随种子及种子间夹杂的病残体进行远距离传播扩散 , 田间通过气流 、雨水和灌溉水作近距离传播 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　向 日葵白锈病菌 PCR检测方法

　　B. 1 DNA提取方法

　　将向 日葵种子或病变组织冷冻加液氮研磨 ,放入 1. 5 mL离心管中 ,在离心管加入 300 μL~ 500 μL CTAB缓冲液(含 0. 1 g蛋白酶 K) 混 匀 , 65 ℃水 浴 1 h; 13 000 g 离 心 5 min, 保 留 上 清 液 ; 加 500 μL Tris饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 25 ∶ 24 ∶ 1) 混匀 , 13 000 g 离心 5 min,保留上清液 ;再加500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 24 ∶ 1)混匀 ,13000g 离心 5 min,保留上清液 ;加入 1 mL异丙醇混匀 , -70 ℃下放置 1 h,或 -20℃过夜;13 000g 离心 30 min,可见 DNA沉淀;70%乙醇洗 DNA 沉淀 ,室温干燥 ;用 30 μLTris-EDTA缓冲液溶解病原菌 DNA,待用 。

　　也可采用市售试剂盒法提取样品 DNA。

　　B.2 巢式 PCR检测

　　用真菌通用引物 NL1/NL4对供试材料进行首轮 PCR扩增 ,通用引物序列如下 :

　　NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'

　　25μLPCR反应体系 : 10×缓冲液 2. 5 μL, 25 mmol/L MgCl2 1. 8 μL, 2. 5 mmol/L dNTP 2 μL, 5 U/μLTaqDNA聚合酶 0. 2 μL,10 μmol/L上 、下游引物各 1 μL,DNA模板 1 μL,dd H2 O 15. 5 μL。

　　反应条件 :预变性 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 共 35个 循 环 ; 72 ℃延 伸10 min。

　　将首轮 PCR扩增产物稀释 500倍后做模板 ,再用特异性引物 ATHP3和 ATHP4进行第二轮 PCR扩增 。 引物序列为 :

　　ATHP3:5'-CTTGCAGTCTCTGCTCGG-3';ATHP4:5'-ACTGAC TTTGACTCCTCCT-3'

　　25μL反应体系 :10×缓冲液 2. 5 μL,25 mmol/LMgCl2 1. 8 μL,2. 5 mmol/L dNTP 2 μL,5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0. 2 μL,10 μmol/L上 、下游引物各 1 μL,DNA模板 3 μL,dd H2 O 13. 5 μL。设阳性对照为向 日葵白锈病菌的 DNA, 阴性对照为健康向 日葵叶片的 DNA等 , 以灭菌去离子水作空白对照 ,每个样品重复 2 次 。

　　反应条件 :预变性 95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 min。

　　取 PCR扩增产物 5 μL, 加入 1. 5 μL上样缓冲液(0. 25%溴酚蓝 , 40%蔗糖水溶液) , 混 匀 , 在 1× TAE 电泳缓冲液 、1. 5%琼脂糖凝胶中电泳 ,5 V/cm ,凝胶成像仪分析结果 。

　　B.3 实时荧光 PCR检测

　　实时荧光 PCR法检测所用的特异性引物为 ATHF和 ATHR,引物序列为 :

　　ATHF:5'-CTGACTTTGACTCCTCCGTGGC-3',ATHR:5'-GAGACCGATAGCGAACAAG-3';

　　探针 ATH-X: 5'-FAM-TTTCAGCAGTTTCAGGTACTCTTTAAC-TAMRA-3', 探 针 5'端 标 记为报告荧光染料 (FAM) ,3'端标记为淬灭荧光染料 (TAMRA) 。

　　25μL反应体系中含 :样品 DNA 1 μL, 10×缓冲液 2. 5 μL,25 mmol/L MgCl2 2 μL, 2. 5 mmol/L dNTP 2. 5 μL, 5 μmol/L Primers各 2 μL, 2 μmol/L探 针 5 μL, 5 U/μL Taq DNA 聚 合 酶 0. 2 μL, dd H2 O 7. 8 μL。

　　反应条件 :50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;然后进入 95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,循环 40次 。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　向 日葵白锈病菌形态及为害症状图

　　图 C. 1 向 日葵白锈病菌孢囊梗 图 C.2 向 日葵白锈病菌孢子囊

　　图 C.3 向 日葵白锈病菌卵孢子 图 C.4 向 日葵白锈病叶正面症状

　　图 C.5 向 日葵白锈病叶背面症状 图 C.6 向 日葵白锈病花盘症状

　　参 考 文 献

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