GB/T 31797-2015 啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31797—2015

　　啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofHoplatentviroid

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31797—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局 、中国农业科学研究院植物保护研究所 、石河子大学 。

　　本标准主要起草人 :郭立新 、邓丛良 、段维军 、张祥林 、李世访 、姜冬梅 、荣德福 、刘升学 。

　　啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于啤酒花(Humuluslupulus)及其无性繁殖材料 、种子 、花粉上啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定 , 同时也适用于葎草(Humulusjaponicus)和异株荨麻(Urtica dioica)上啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 仪器设备、主要用具和主要试剂

　　3. 1 仪器设备

　　电子天平(感量 0. 001 g) 、普通天平(感量 0. 1 g) 、高速冷冻离心机 、小型瞬时离心机 、普通冰箱 、超低温冰箱( -80 ℃) 、制冰机 、涡旋振荡器 、磁力搅拌器 、高压灭菌锅、pH 计 、PCR 仪 、微波炉 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶分析成像系统 、实时荧光 PCR仪 、杂交炉 、塑料薄膜封口机 、紫外交联仪 、暗箱 、摇床 、可调移液器(2. 5 μL,10 μL,20 μL,200 μL,1 000 μL,5 000 μL) 。

　　3.2 主要用具

　　无 RNase吸头(10 μL, 20 μL, 200 μL, 1 000 μL, 5 000 μL) 、无 RNase 离 心 管 (1. 5 mL, 5 mL, 10 mL) 、研钵 、研棒 、磁性分离架 、PCR反应管(200μL) 、实时荧光 96孔反应板 、杂交瓶 、杂交膜 、杂交袋 、X光片 。

　　3.3 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定 。RT-PCR 检测试剂见附录 B;实时荧光 RT-PCR检测试剂见附录 C;斑点杂交检测试剂见附录 D。

　　4 检测样品制备

　　4. 1 种子类

　　随机抽取至少 50粒种子样品,进行表面消毒后 ,置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中 ,在适宜的发芽温度条件下催芽 ,直至长出第一对真叶(发芽时间大约一周) ;或者在消毒的土壤中直接种植 ,直至长出第一对真叶 。取适量叶片 ,放入洁净的研钵中 ,加入液氮后迅速研磨成细粉状 。

　　GB/T 31797—2015

　　4.2 种苗类

　　对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片 ,对于无症状的种苗类样品选取适量样品的叶片 ,放入洁净的研钵中 ,加液氮后迅速研磨成细粉状 。

　　5 检测与鉴定

　　5. 1 试验设计

　　每个样品设置两个平行反应 。检测时以感染啤酒花潜隐类病毒的植物组织作为阳性对照 , 以健康植物组织作为阴性对照 , 以双蒸水代替模板作为空白对照 。

　　5.2 普通 RT-PCR方法

　　普通 RT-PCR方法见附录 B。

　　5.3 实时荧光 RT-PCR方法

　　实时荧光 RT-PCR方法见附录 C。

　　5.4 斑点杂交方法

　　斑点杂交方法见附录 D。

　　6 结果判定

　　样品经普通 RT-PCR检测为阳性 ,且实时荧光 RT-PCR 检测为阳性或斑点杂交检测为阳性 ,则判定为检出啤酒花潜隐类病毒 。

　　样品经普通 RT-PCR检测为阳性 ,且序列测定结果与已知的 HpLVd序列一致 ,则判定为检出啤酒花潜隐类病毒 。

　　7 结果记录与样品保存

　　7. 1 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,试验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并要有实验人员和审核人员签字 。普通 RT-PCR检测结果保存电泳照片 ,实时荧光 RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及 Ct值 ,斑点杂交检测保存照片 ,序列测定结果保存测序报告图 。

　　7.2 样品保存与处理

　　样品经登记人和经手人签字后妥善保存 3个月 ,种子保存在干燥条件下或 4 ℃冰箱内 ,生长苗木保存在隔离温室中 ,其他繁殖材料可取实验样品在 -80℃冰箱内保存 。对检出啤酒花潜隐类病毒的样品应至少保存 6个月 , 以备复检 、谈判和仲裁 。保存期满后 ,应灭活处理 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　啤酒花潜隐类病毒相关资料

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 啤酒花潜隐类病毒基本信息

　　学名 :Hop latentviroid。

　　缩写 : HpLVd。

　　分类地位 :马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae) 、椰子死亡类病毒属(Cocadviroid) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 、实时荧光 RT-PCR反应及斑点杂交方法是本标准制定的主要依据。

　　A.2 寄主范围

　　HpLVd寄主范围较窄 ,仅侵染啤酒花(Humuluslupulus) 、葎草(Humulusjaponicus)和异株荨麻(Urtica dioica) 。

　　A.3 病害症状

　　寄主受 HpLVd侵染后一般不表现症状 ,但在英国 , 啤酒花 Omega品种受 HpLVd侵染后 , 出现萎黄 、生长缓慢及球果较小等症状 。

　　A.4 分布地区

　　欧洲 : 比利时 、捷克 、英国 、法国 、德国 、匈牙利 、波兰 、葡萄牙 、俄罗斯 、西班牙 、南斯拉夫 。

　　亚洲 : 日本 、韩国 、中国(新疆) 。

　　美洲 : 巴西 、美国 。

　　非洲 :南非 。

　　大洋洲 :澳大利亚 。

　　A.5 传播方式

　　HpLVd主要通过无性繁殖材料 、农事操作工具进行传播 ; 也可通过种子(8%传毒率) 、花粉传播 ,但传毒率很低 ;至今尚无昆虫介体传播的报道 。

　　A.6 基因组

　　HpLVd的基因组为一条环状单链 RNA,长 256 nt,具有 5 个功能区 ,形成稳定的棒状二级结构 。 HpLVd通过不对称滚环模式进行复制 ,基因组不编码蛋白质 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　普通 RT-PCR检测方法

　　B. 1 主要试剂

　　B. 1. 1 1 mol/L磷酸氢二钾(K2HPO4 )

　　磷酸氢二钾 17. 42 g

　　加双蒸水定容至 100 mL。用 0. 22 μm 滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌 。

　　B. 1.2 2.5 mol/L磷酸氢二钾(K2HPO4 )

　　磷酸氢二钾 43. 55 g

　　加双蒸水定容至 100 mL。用 0. 22 μm 滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌 。

　　B. 1.3 3 mol/L 乙酸钠(NaAc)(pH 5. 2)

　　三水乙酸钠 40. 83 g

　　用 3 mol/L乙酸调节 pH 至 5. 2。用双蒸水定容至 100 mL。高压蒸汽灭菌 。

　　B. 1.4 4 mol/L氯化锂(LiCl)

　　氯化锂 16. 96 g

　　加双蒸水定容至 100 mL。用 0. 22 μm 滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌 。贮存于 4 ℃ 。

　　B. 1.5 研磨缓冲液

　　异硫氰酸胍(GITC) 4 mol/L

　　十二烷基肌氨酸钠 5 g/L

　　曲拉通 X-100(Triton X-100) 0. 1%(体积分数)

　　氯化钠(NaCl) 10 mmol/L

　　柠檬酸钠缓冲液(pH 7. 0) 25 mmol/L

　　聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 20 g/L

　　B. 1.6 50× TAE缓冲液

　　Tris碱 242 g

　　冰乙酸 57. 1 mL

　　乙二胺四乙酸(EDTA )(0. 5 mol/L,pH 8. 0) 100 mL

　　加双蒸水定容到 1 L。

　　贮存于 4 ℃ 。

　　B.2 引物序列

　　正向引物 HLVdF:5'-ATA CAA CTC TTG AGC GCC GA -3'; 反向引物 HLVdR: 5'-CCA CCG GGT AGT TTCCAA CT -3';扩增片段大小为 256bp。

　　B.3 试验步骤

　　B.3. 1 RNA 的提取

　　B.3. 1. 1 方法一

　　B.3. 1. 1. 1 取 1 g样品,加液氮研磨成粉末状 ,将研磨物迅速移入 10 mL离心管中 ,并加入 2 mL 1 mol/L磷酸氢二钾和 8 μL巯基乙醇 ,混匀 ,再加入 2 mL水饱和酚 ∶ 三氯甲烷(体积比 1 ∶ 1) ,充分混匀 ; 4 ℃ , 10 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1. 1.2 取上层液体 ,加入同体积的水饱和酚 ∶ 三氯甲烷(体积比 1 ∶ 1) ,充分混匀;4 ℃ ,10 000g 离心 10 min。

　　B. 3. 1. 1.3 取上层液体 ,加入 2. 5倍体积的无水乙醇 ,充分混匀 ; -20 ℃下放置 2 h~4 h或 -80℃下放置至少 30 min;4 ℃ ,10 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1. 1.4 取沉淀 ,加 1 mL无 RNase的水充分溶解后 ,再加入 1 mL 2. 5 mol/L磷酸氢二钾 、1 mL 的乙二醇单甲醚(即 :2-甲氧基-乙醇) ,充分混匀;4 ℃ ,10 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1. 1.5 取上层液体 ,加入无 RNase的水至 10 mL,再加入 100μL 20g/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液 ,充分混匀 ,冰浴 3 h~4 h;4 ℃ ,10 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1. 1.6 取沉淀 ,加入 2 mL无 RNase的水充分溶解后 ,加入 5 mL无水乙醇 、0. 2 mL 3 mol/L乙酸钠(pH 5. 2) ,充分混匀 , -20 ℃下放置至少 2 h;4 ℃ ,10 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1. 1.7 取沉淀 ,加 200 μL无 RNase的水反复吹打 ,待沉淀充分溶解后 ,将溶解物移入 1. 5 mL离心管中 ;加入 200 μL 4 mol/L氯化锂 ,充分混匀 ,冰浴至少 4 h;4 ℃ ,10 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1. 1. 8 取上层液体于 1. 5 mL离心管中 ,加入 2. 5倍体积的无水乙醇 ,混匀 , -20 ℃下放置至少 2 h或 -80℃下放置至少 30 min;4 ℃ ,12 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1. 1.9 取沉淀 ,70%乙醇清洗沉淀;4 ℃ , 12 000 g 离心 2 min;取沉淀 ,待其干燥后 ,加入 50 μL~ 60 μL无 RNase的水充分溶解 , -20 ℃下保存备用 。

　　B.3. 1.2 方法二

　　B. 3. 1.2. 1 取 0. 1 g样品,加液氮研磨成粉末状 ,将研磨物迅速移入 1. 5 mL离心管中 ,加入 1 mL Trizol Reagent,颠倒混匀 ,2 ℃ ~ 8 ℃ ,12 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1.2.2 取上清液 ,15 ℃ ~ 30 ℃ ,放置 5 min;加入 0. 2 mL三氯甲烷 ,用手剧烈振荡(勿涡旋振荡)约15 s。 15 ℃ ~ 30 ℃ ,放置 2 min~ 3 min;2 ℃ ~ 8 ℃ ,12 000g 离心 15 min。

　　B.3. 1.2.3 小心吸取约为 600 μL 的上层水相 ,勿扰动中间相和下层相 。加 500μL异丙醇混合上清液 , 15 ℃ ~ 30 ℃ ,放置 10 min。2 ℃ ~ 8 ℃ ,12 000g 离心 10 min。

　　B.3. 1.2.4 去除上清液 ,沉淀中加入 1 mL 75%乙醇 ,洗涤;2 ℃ ~8 ℃ ,7 500g 离心 5 min。

　　B.3. 1.2.5 去除上清液 ,沉淀自然干燥后 ,将其溶于 30 μL ~ 50 μL无 RNase的水中 。

　　B.3. 1.3 方法三

　　B.3. 1.3. 1 取 0. 05 g样品,加液氮研磨成粉末状 ,待研磨物温度升到室温 ,加入 2. 5 mL 的研磨缓冲液 ,

　　继续充分研磨 ,将研磨物移入 5 mL 的离心管 ,4 ℃ ,5 000g 离心 5 min, 留上清液备用 。

　　B.3. 1.3.2 取 2 mg纳米磁珠于 1. 5 mL 的 离 心 管 中 , 离 心 管 置 于 磁 性 分 离 架 上 , 吸 附 纳 米 磁 珠 , 弃 上清液 。

　　B.3. 1.3.3 向含有纳米磁珠的离心管中加入 800μL备用上清液 ,用枪反复吹打至没有明显结块 。

　　B.3. 1.3.4 再向离心管中加入 400 μL无水乙醇 ,颠倒混匀 ,室温放置 5 min~ 10 min,放置期间颠倒混匀几次 。将离心管瞬离后 ,置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,弃上清液 。

　　B.3. 1.3.5 向离心管中加入 150μL70%的乙醇 ,用枪吹打混匀 ,将离心管置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,弃上清液 ,并重复 2 次 ~ 5 次 ,至上清液没有明显颜色 。

　　B.3. 1.3.6 将离心管瞬离后 ,置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,完全弃除上清液 。 向离心管中加入约50 μL无 RNase的水 ,用枪反复吹打重新悬浮纳米磁珠 ,室温放置 2 min~ 5 min。

　　B.3. 1.3.7 将离心管置于磁性分离架上 , 吸附纳米磁珠 ,将含有 RNA 的上清液转移至一无 RNA 酶污染的离心管中 , -80 ℃冰箱保存备用 。

　　注 : RNA也可使用相应市售 RNA提取试剂盒提取 。

　　B.3.2 RT-PCR

　　在 25 μL反应体系中加入 2. 5 μL 10× RT-PCR 缓冲液 , 5 μL MgCl2 (25 mmol/L) , 2. 5 μL dNTP Mixture (各 10 mmol/L) , 0. 5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL) , 0. 5 μL AMV RTase XL(5 U/μL) , 0. 5 μLAMV-OptimizedTaq(5U/μL) ,0. 5 μL 引 物 HLVdF(20 μmol/L) , 0. 5 μL 引 物 HLVdR (20 μmol/L) ,1 μL RNA,RNaseFreedH2 O 补至 25μL。反应条件为 :50℃ 30min,94℃ 2 min;然后94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共 35个循环;72 ℃ 5 min。

　　注 : 反应体系中各试剂的量可根据具体 情 况 或 不 同 的 反 应 总 体 积 进 行 适 当 调 整 。也 可 采 用 其 他 商 业 RT-PCR 试剂盒 。

　　B.3.3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

　　灌制 2%琼脂糖凝胶板 , 室温凝胶 30 min,取 5 μLPCR产物与 6×Loading缓冲液混匀后点样 ,用DNA Marker作分子量标记 ,在 1×TAE 中以 5 V/cm 的电压电泳 30 min。溴化乙锭溶液(0. 5 μg/mL)染色 10min,用凝胶成像仪照相 。

　　B.4 结果判断

　　阴性对照和空白对照在 256 bp处未出现扩增条带 ,待测样品与阳性对照在 256 bp处出现扩增条带 ,判定结果为阳性 。

　　阴性对照和空白对照在 256bp处未出现扩增条带 , 阳性对照在 256bp处出现扩增条带 ,且样品无特异性扩增 ,判定结果为阴性 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测方法

　　C. 1 主要试剂

　　RNA提取试剂 :见 B. 1. 1~B. 1. 5。

　　C.2 引物和探针序列

　　引物 HLV-F: 5'-CGT GGA ACG GCT CCT TCT T-3'; 引 物 HLV-R: 5'-AGA GTT GTA TCC ACC GGG TAG TTT-3',探针 HLV-P:5'-CACCAG CCG GAG TT-3',探针 5'端含有 FAM报告荧光染料 ,3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有 MGB分子 。

　　C.3 实验步骤

　　C.3. 1 RNA 的提取

　　见 B. 3. 1。

　　C.3.2 实时荧光 RT-PCR

　　以提取的 RNA 为模板进行实时荧光 RT-PCR反应 , 即在 25 μL反应体系中加入 12. 5 μL2×实时荧光 RT-PCR Master Mix(含终浓度 4. 0 mmol/L的 Mg2+ ) ,1. 5 μLMgCl2 (25 mmol/L) ,0. 875 μL引物 HLV-F(20 μmol/L) , 0. 875 μL引 物 HLV-R(20 μmol/L) , 0. 625 μL探 针 HLV-P(20 μmol/L) , 0. 25μL实时荧光 RT Mix,1 μL RNA,RNase FreedH2 O 补至 25μL。

　　反应条件为 :50 ℃ 30 min;95 ℃ 15 min;然后 94 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共 40个循环 。

　　注 : 反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。也可采用其他商业实时荧光 RT- PCR试剂盒 。

　　C.4 结果判定

　　实时荧光 PCR反应结束后 ,应设置无效基线范围 ,基线范围选择在 3 个 ~ 15个循环 ,如果有强阳性样本 ,应根据实际情况调整基线范围 。 阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高

　　点 ,且在、。对照和空白对照正确的前提下 :

　　a) 如果待测样品的 Ct值大于或等于 40时 ,则判定结果为阴性 。

　　b) 如果待测样品的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定结果为阳性 。

　　c) 如果待测样品的 Ct值小于 40且大于 35时 ,应重新进行测试 ,如果重新测试的 Ct值大于或等于 40时 ,则判定结果为阴性 ;如果重新测试的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定结果为阳性 ; 如果重新测试的 Ct值小于 40且大于 35,且分离曲线明显时 ,则判定结果为阳性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　斑点杂交检测方法

　　D. 1 主要试剂

　　D. 1. 1 RNA提取试剂

　　见 B. 1. 1~B. 1. 5。

　　D. 1.2 10×MOPS(pH 7. 0)

　　MOPS(pH 7. 0) 0. 4 mol/L

　　乙酸钠(NaAc) 0. 1 mol/L

　　乙二胺四乙酸(EDTA) 0. 01 mol/L

　　用 2 mol/L氢氧化钠(NaOH)调 pH 至 7. 0。加双蒸水定容至 1 L,用 0. 45μm 的滤膜过滤除菌 ,室温避光保存 。

　　D. 1.3 变性液(现用现配)

　　甲醛(12. 3 mol/L) 162μL

　　甲酰胺 500 μL

　　10×MOPS 100 μL

　　4 ℃贮存 ,无须灭菌 。

　　D. 1.4 20×SSC(pH 7. 0)

　　氯化钠(NaCl) 17. 53 g

　　柠檬酸钠 8. 82 g

　　用 1 mol/L盐酸(HCl)溶液调 pH 至 7. 0,加双蒸水定容至 100 mL,高压灭菌待用 。

　　D. 1.5 10%十二烷基磺酸钠(SDS)

　　十二烷基磺酸钠 10 g

　　用 80 mL双蒸水溶解 ,加热到 68 ℃并用磁力搅拌器搅拌有助于溶解 。如果需要 ,用 1 mol/L盐酸溶液调 pH 至 7. 2。用双蒸水定容至 100 mL。室温保存 。无须蒸汽高压灭菌 。

　　D. 1.6 马来酸缓冲液(pH 7. 5)

　　马来酸 1. 16 g

　　氯化钠(NaCl) 0. 877 5 g

　　加双蒸水定容至 100 mL,灭菌待用 。

　　D. 1.7 1%封闭液(现用现配)

　　封闭剂( -20℃保存) 1 g

　　用马来酸缓冲液定容至 100 mL。

　　注 : 此处要求马来酸 pH严格 ,否则不溶 ;封闭剂很难溶 ,要稍加热(50℃左右) ,并用磁力搅拌子搅拌溶化 。 D. 1. 8 抗体溶液(现用现配)

　　Anti-DIG-AP(4℃保存) 10 μL

　　用封闭液定容至 100 mL。

　　D. 1. 10 检测缓冲液(pH 9. 5)

　　Tris碱 1. 211 g

　　氯化钠(NaCl) 0. 585 g

　　加双蒸水定容至 100 mL,灭菌待用 。

　　D. 1. 11 CSPD稀释液

　　将 CSPD用力摇匀后 ,每 6滴 ~ 8滴 CSPD加入 1 mL检测缓冲液 ,混匀 。

　　D. 1. 12 通用显影粉 。

　　D. 1. 13 酸性定影粉 。

　　D.2 试验步骤

　　D.2. 1 RNA 的提取

　　见 B. 3. 1。

　　D.2.2 样品处理

　　将 1. 5 μL RNA 加 入 PCR 反 应 管 中 , 加 入 3 倍 体 积(4. 5 μL) 的 变 性 液 , 混 匀 , 瞬 离 , 65 ℃放 置15 min,冰浴 2 min,瞬离 ,加入等体积(6μL)的 20×SSC,混匀 , 即得到变性后的 RNA样品 。

　　D.2.3 点膜

　　吸取 3 μL变性后的 RNA样品点于杂交膜上 ,待干燥后 ,再重复一次 。

　　D.2.4 固定

　　将点好的膜正面朝上放于紫外交联仪中 ,能量 120 mJ/cm2 放置 3 min或将点好的膜放入烘箱中 , 80 ℃放置 1 h~ 2 h或 120 ℃放置 30 min。

　　D.2.5 预杂交

　　将固定好的膜放入杂交瓶中 ,并加入杂交液(12 mL/100 cm2 ~ 15 mL/100 cm2 膜) , 68 ℃预杂交30 min~ 3 h,弃杂交液 。

　　D.2.6 杂交

　　将标记的 RNA探针(20ng/mL~ 100ng/mL杂交液)加入 1. 5 mL离心管中 ,覆盖 50μL~ 100μL杂交液 ,勿混合 ,沸水中煮 6 min~10min,冰浴 2 min,将其与杂交液(8mL/100 cm2 ~10mL/100 cm2 膜)混匀 ,加入杂交瓶中 ,68 ℃杂交 6 h 以上(一般过夜) ,倒出杂交液 。

　　D.2.7 洗膜

　　用 2×SSC 和 0. 1%十二烷基磺酸钠混合液(12mL/100 cm2 ~ 15 mL/100 cm2 膜)室温洗膜 2 次 ,每次 5 min,弃混合液 。用 68 ℃预热的 0. 1× SSC和 0. 1%十二烷基磺酸钠混合液(12mL/100 cm2 ~ 15 mL/100 cm2 膜)68℃洗膜 2 次 ,每次 15 min,弃混合液 。用洗涤缓冲液(12mL/100 cm2 ~ 15 mL/ 100 cm2 膜)室温洗膜 5 min,弃洗涤液 。

　　D.2. 8 封闭

　　用 1%的封闭液(12mL/100 cm2 ~ 15 mL/100 cm2 膜)室温孵育 30 min,弃封闭液 。

　　D.2.9 结合抗体

　　加入抗体溶液(12mL/100 cm2 ~ 15 mL/100 cm2 膜)37℃孵育 30 min,弃抗体溶液 。

　　D.2. 10 洗涤

　　用洗涤缓冲液(12mL/100 cm2 ~ 15 mL/100 cm2 膜)室温洗膜 2 次 ,每次 15 min,弃洗涤液 。

　　D.2. 11 平衡

　　用检测缓冲液(12mL/100 cm2 ~ 15 mL/100 cm2 膜)室温平衡 10 min。

　　注 : D. 2. 5~D. 2. 11步骤中用到的各种液体可根据试验具体情况进行调整 ,但要确保膜能浸没于液体中且不漂浮 。

　　D.2. 12 感光处理

　　将杂交膜放入一边封好的杂交袋中(杂交膜点样面朝上) ,并将相邻两边封好 ,在点样面上加入适量的 CSPD稀释液(1mL/100 cm2 膜) ,迅速将杂交袋放平 ,用手反复轻推数次 ,使 CSPD稀释液在膜上扩散均匀 ,严防杂交袋与膜之间有气泡 ,20 ℃ ~ 30 ℃放置 5 min~ 10 min。此步骤操作要快 , 防膜干燥 。将多余的 CSPD液体挤干净 ,封 口 ,37 ℃温育 15 min~ 25 min。

　　D.2. 13 压片

　　在暗室中 ,膜正面向上放于暗盒 ,将比膜稍大的 X光片平整地压于膜上 ,封好暗盒 ,必要时可用胶带固定杂交袋 。 暗盒内曝光约 1. 5 h。

　　D.2. 14 显影和定影

　　曝光后 ,在暗室内取出感光后的胶片放于显影液内显影 4 min~ 5 min, 打开绿光灯一尺距离观察显影效果 , 当可以清楚地看到阳性对照或检测到的阳性显影清楚后 ,将胶片放入清水中冲洗 30 s,放入定影液中定影 10 min,再用流水冲洗 30 s,拿出暗室 。

　　注 : 曝光和显影时间可根据试验具体情况进行调整 , 以达到最佳效果 。

　　D.3 结果判断

　　阴性对照和空白对照未出现杂交斑 ,待测样品与阳性对照出现杂交斑 ,判定结果为阳性 。

　　阴性对照和空白对照未出现杂交斑 , 阳性对照出现杂交斑 ,且样品无杂交斑 ,判定结果为阴性 。

　　参 考 文 献

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