GB/T 31798-2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31798—2015

　　油菜黑胫病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofPlenodomusbiglobosus (Shoemaker& H. Brun) Gruyter,Aveskamp & Verkley

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31798—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国湖北出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 、华中农业大学 。

　　本标准主要起草人 :赵晖 、王振华 、曾宪东 、易建平 、李彬 、李国庆 、吴品珊 、蔡翔 。

　　油菜黑胫病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了油菜黑胫病菌(Plenodomusbiglobosus)的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于油菜种子 、植株及其产品中油菜黑胫病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 仪器设备和主要试剂

　　3. 1 仪器设备

　　生物显微镜 、体视显微镜 、高速冷冻离心机 、纯水仪 、超净工作台 、灭菌锅 、制冰机 、PCR 仪 、凝胶成像系统 、电泳仪 、培养箱 、超低温冰箱 、常规冰箱 、涡旋振荡器 。

　　3.2 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯或生化试剂 ,试验用水符合 GB/T 6682。

　　3.2. 1 1%次氯酸钠

　　3.2.2 DNA提取试剂 :DNA提取试剂盒 ,异丙醇 ,无水乙醇 。尿素提取液(7 mol/L Urea、50 mmol/L Tris-HClpH 8. 0、62. 5 mmol/L NaCl、1% SDS) , 蛋 白 酶 K(20 mg/mL) , 苯 酚 ∶ 三 氯 甲 烷 ∶ 异 戊 醇(25 ∶ 24 ∶ 1)溶液 ,3 mol/LNaAc(pH 5. 2) 。

　　3.2.3 PCR 试剂 :10×PCR缓冲液(含 25 mmol/LMgSO4 ) ,Taq酶 ,dNTPs。

　　3.2.4 凝胶电泳试剂 :琼脂糖 ,TAE,Loading缓冲液 ,EB。

　　3.2.5 20%V8培养基 :V8蔬菜汁(CampbellSoup公司) 200mL,CaCO3 0. 75 g, 琼脂粉 13. 0 g, 蒸馏水定容至 1 000 mL,调整 pH 至 5. 8,121 ℃高压灭菌 20 min。

　　3.2.6 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) :马铃薯浸粉 5. 0 g,葡萄糖 20. 0 g,氯霉素 0. 1g,琼脂 13. 0 g,蒸馏水定容至 1 000 mL,调整 pH 至 5. 6,121 ℃高压灭菌 20 min。

　　4 病菌的鉴定

　　4. 1 症状检查

　　4. 1. 1 种子症状检查

　　取样品量 1% ~ 5%(若样品少可适量增大比例) 的种子 ,在解剖镜下挑选皱缩 、干瘪 、变色 、残缺的种子或有霉变的籽粒或病残体 ,每份种子样品挑选不少于 500粒 ,用做病原菌的分离 。另取 1 kg种子 ,

　　GB/T 31798—2015

　　用孔径 2. 5 mm 和 1. 5 mm 的网筛过筛 ,取筛上物 、筛下物和种子各 1 g~ 2 g用于 DNA提取 。

　　4. 1.2 植株症状检查

　　取病变的植株的茎根部和叶部进行检查 。 主要检查茎根部和叶部 。选取叶片上出现圆形或不规则形 、稍凹陷 、中部灰白色病斑 、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位 。植茎则选取不规则形淡褐色斑 ,或灰白色病斑 、稍凹陷 、上生黑色小点 ,或茎基及根系溃疡 、枯萎症状的病变部位(参见附录 A) 。

　　4.2 分离培养

　　4.2. 1 种子病原菌的分离培养

　　将挑选的疑带菌种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理 1 d,转入 -20 ℃下冷冻处理 1 d, 1%次氯酸钠消毒 5 min~ 7 min,无菌水洗涤 3 次后 ,用滤纸吸干种子 ,按 25粒/皿置于 V8培养基或 PDA培养基上 ,在 20 ℃ ~ 25 ℃ ,12 h黑暗/12h光照(12h光暗交替)条件下培养 ,第 3 天开始观察 。

　　4.2.2 植株病原菌的分离培养

　　用解剖刀取植株病健交 界 处 的 组 织 , 剪 成 约 0. 4 cm × 0. 4 cm 小 段 , 用 1%的 次 氯 酸 钠 溶 液 消 毒5 min,无菌水洗涤 3 次 ,灭菌滤纸吸干水分后置于 V8脂培养基或 PDA培养基上 , 同 6. 2. 1 培养观察 。

　　4.3 鉴定特征

　　该病菌在培养基上可良好生长 ,气生菌丝发达 ,产孢量大 。后期(15d)可见到明显的孢子座和粉红色的孢子溢出 。气生菌丝呈白色或微黄 ,后期菌丝上会分泌出淡黄棕色的油状液滴 。分生孢子呈长杆形或梭形 ,长度在 2. 5 μm~ 3. 0 μm 之间 ,宽度在 0. 8 μm~ 1. 1 μm 之间 。在孢子的两端各有一个透明的小液滴 。PDA培养基会随着菌丝的生长呈黑色或黄色 。该病菌在 PDA上产生黄褐色色素 。

　　4.4 PCR检测

　　4.4. 1 样品 DNA提取

　　取筛上物 、筛下物和种子 ,或植株可疑病变组织各 1 g~ 2 g,液氮研磨后各取样 0. 1 g~ 0. 2 g,采用商业化试剂盒或尿素法提取 DNA(参见附录 B) 。

　　4.4.2 PCR检测方法

　　PCR检测方法参见附录 C,重复 3 次 。用油菜黑胫病菌(Plen. biglobosus) 参照菌株 DNA 作阳性对照 ,用灭菌蒸馏水作空白对照 。

　　5 结果判定

　　病菌的分离培养形态特征符合 4. 3 中描述 ,可报告检出油菜黑胫病菌 。PCR 检测作为筛选和辅助方法 。

　　6 样品保存与结果记录

　　6. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出油菜黑胫病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　6.2 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为油菜黑胫病菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌株接种于 V8培养基或 PDA培养基斜面上 ,20 ℃ ~ 25 ℃培 养 5 d, 然 后 4 ℃冰 箱 保 存 , 或 将 菌 丝 块 转 入 20%灭 菌 甘 油 并 混 匀 , -80 ℃长期保存 。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理 。

　　6.3 结果记录与资料保存

　　完整的试验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并应有试验人员和审核人员签字 。PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　油菜黑胫病菌相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 油菜黑胫病菌基本信息

　　中文名 :油菜黑胫病菌 。

　　学名 :Plenodomusbiglobosus (Shoemaker & H. Brun) Gruyter,Aveskamp & Verkley。

　　异名 :Leptosphaeriabiglobosa Shoemaker & H. Brun。

　　分类地位 : 真 菌 界 (Fungi) , 子 囊 菌 门 (Ascomycota) , 座 囊 菌 纲 (Dothideomycetes) , 格 孢 腔 菌 目(Pleosporales) ,小球腔菌科(Leptosphaeriaceae) 。根据对油菜的侵染能力不同 , 分为强致 病 性 菌 株 和弱致病性菌株 ,2001年前均命名为 Leptosphaeriamaculans。2001年 ,Shoemaker和 Brun根据传统的分类学 原 则 将 对 油 菜 弱 致 病 性 的 菌 株 定 为 Leptosphaeriabiglobosa Shoemaker & Brun。 2012 年 , Gruyter等根据分子和系统发育特征将该菌重新分类命名为 Plenodomusbiglobosus(Shoemaker & H. Brun) Gruyter,Aveskamp & Verkley。

　　传播途径 :感病的植株 、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播的主要途径 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据油菜黑胫病菌在寄主上的为害症状 ,培养基上生长的菌落 、菌丝 、分生孢子和分生孢子器形态 ,以及 PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定 。

　　A. 1.3 寄主范围

　　该病菌的寄主广泛 , 主要有如油菜 、甘蓝 、花椰菜等芸苔属 Brassica,萝 卜属 Raphanus,独行菜属Lepidium,香雪球属 Lobularia,屈 曲 花 属 Iberis,碎 米 荠 属 Cardamine,紫 罗 兰 属 Matthiola,糖 芥 属Erysimum,团扇荠属 Berteroa,葱芥属 Alliaria等植物 。

　　A.2 感病植株的症状、病菌形态特征图

　　说明 :

　　a— 叶片为害状 ;

　　b— 茎基部为害状 ;

　　c— 根部为害状 ;

　　d— 后期菌丝上分泌出淡黄棕色的油状液滴 ;

　　e— 病菌在 PDA上产生黄褐色色素 ;

　　f— 分生孢子 。

　　注 : 图片来自李国庆等 。

　　图 A. 1 感病植株的症状、病菌形态特征图

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　油菜黑胫病菌 DNA 的提取方法

　　B. 1 试剂盒提取 DNA 的方法

　　B. 1. 1 将植物样品用液氮碾碎 。

　　B. 1.2 按照试剂盒提供的操作步骤处理 。

　　B.2 尿素法提取菌丝 DNA 的方法

　　B.2. 1 取 500 μL尿素提取液(7 mol/L Urea、50 mmol/L Tris-HClpH 8. 0、62. 5 mmol/L NaCl、1% SDS)与 10 μL 20 mg/mL蛋白酶 K 至 EP管中 ,挑取 200 mg菌丝至 EP管 ,混匀 。

　　B.2.2 置 55 ℃温育 30 min,每隔 10 min振荡混匀 1 次 , 12 000 r/min离心 5 min,将上清液移入另一EP管中 ,加入 等 体 积 的 苯 酚 ∶ 三 氯 甲 烷 ∶ 异 戊 醇(25 ∶ 24 ∶ 1) 溶 液 , 颠 倒 混 匀 , 13 000 r/min离 心10 min。

　　B.2.3 取 上 清 液 到 另 一 EP 管 中 , 加 入 等 体 积 的 异 丙 醇 和 1/10体 积 的 3 mol/L NaAc(pH 5. 2) , -20 ℃ 放置 20 min,13 000 r/min离心 10 min。

　　B.2.4 弃上清液 ,倒置晾干 ,用 70%乙醇洗涤 ,室温倒置于吸水纸上晾干 ,溶于 20 μLTE溶液中 ,加入RNaseA (1μg/μL) 1 μL,13 000 r/min离心 10 min,弃上清液 ,37 ℃水浴 30 min, -20 ℃保存备用 。

　　附 录 C (资料性附录)定性 PCR方法

　　C. 1 PCR扩增

　　C. 1. 1 定性 PCR选择一

　　油 菜 黑 胫 病 菌 P. biglobosus 特 异 性 引 物 一 : 5'-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3'/5'- ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3', 预期扩增产物约为 444bp。

　　油菜黑胫病菌定性 PCR检测反应体系见表 C. 1。

　　PCR反应程序为 95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,70 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环 ,72 ℃ 10 min。

　　C. 1.2 定性 PCR选择二

　　油菜黑胫病菌 P.biglobosus特异性引物二 : 5'-CATTACCCTTCTATCAGAG-3'/5'-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3',预期扩增产物为 234bp。

　　油菜黑胫病菌定性 PCR检测反应体系见表 C. 1。

　　PCR反应程序为 93 ℃ 5 min;93 ℃ 40 s,40 ℃ 50 s,72 ℃ 60 s,40个循环;72 ℃ 10 min。

　　表 C. 1 检测油菜黑胫病菌定性 PCR反应体系

　　C.2 PCR扩增产物检测

　　扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶在 1×TAE缓冲液中电泳 ,EB染色后用凝胶成像系统分析 。

　　C.3 结果判定

　　PCR扩增产物检测 , 阳性对照出现一条 444bp(定性 PCR选择一)或 234bp(定性 PCR选择二)的DNA 片段 , 阴性对照和空白对照没有该核酸条带 ,待检样品如出现 444bp(定性 PCR选择一)或 234bp (定性 PCR选择二)的 DNA 片段为检测结果阳性 ,如未出现 444bp(定性 PCR选择一)或 234bp(定性PCR选择二)的 DNA 片段为检测结果阴性 。

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　近似种鉴定特征比较

　　D. 1 油菜黑胫病菌的鉴定特征

　　该病菌在培养基上可良好生长 ,气生菌丝发达 ,产孢量大 。后期(15d)可见到明显的孢子座和粉红色的孢子溢出 。气生菌丝呈白色或微黄 ,后期菌丝上会分泌出淡黄棕色的油状液滴 。分生孢子呈长杆形或梭形 ,孢子大小(2. 5 μm~ 3. 0 μm) × (0. 8 μm~ 1. 1 μm) 。在孢子的两端各有一个透明的小液滴 。 PDA培养基会随着菌丝的生长呈黄褐色或黄色 。该病菌在 PDA上产生黄色或黄褐色色素 。

　　D.2 油菜茎基溃疡病菌的鉴定特征

　　该病菌在培养基上菌落边缘不整齐 、有结节状颗粒点 ,气生菌丝白色 、多而致密 ,分枝较多 ,有分隔 。挑取见到的菌丝结制片 ,置于体视显微镜下观察 。分生孢子器直径 150 μm~ 225 μm ,球形至扁球形 ,褐色至深黑褐色 ,散生 、埋生或半埋生于菌丝中 ,有空 口 1 个 ~ 2 个 ,部分分生孢子器从孔口处溢出浅粉红色胶质状黏液 。分生 孢 子 无 色 透 明 , 椭 圆 形 至 纺 锤 形 , 两 端 常 见 各 1 个 油 球 , 孢 子 大 小(3. 3 μm ~ 6. 1 μm) × (1. 4 μm~ 2. 4 μm) 。该病菌在 PDA上不产生黄色或黄褐色色素 。

　　D.3 近似种鉴定特征的比较

　　近似种鉴定特征比较见表 D. 1。

　　表 D. 1 油菜黑胫病菌与油菜茎基溃疡病菌鉴定特征的比较

　　参 考 文 献

　　[1] 刘泽 . 农作物病害研究之油菜黑胫病病害 . 北京 :光明 日报出版社 ,2008.

　　[2] Shoemaker R A,Brun H. The teleomorph ofthe weakly aggressive segregate ofLeptospha- eriamaculans. Canadian JournalofBotany,2001(79) :412-419.

　　[3] XueB,Goodwin P H , Annis S L. Pathotype identification of Leptosphaeria maculans with PCR and oligonuclrotide primers from ribosomal internal transcribed spacers sequences. Physiological and MolecularPlantPathology,1992(41) :179-188.

　　[4] MahukhGS, HallR,Goodwin PH. Distribution ofLeptosphaeria maculans in two fields in southern Ontario as determined by the polymerase chain reaction. European Journal of Plant Pathology,1996(102) :569-576.

　　[5] LiuS Y,Liu Z,FittB D L, et al.Resistance to Leptosphaeria maculans (phoma stem can- ker) in Brassicanapus (oilseed rape) induced byL.biglobosa and chemical defence activators infield and controlled environments.PlantPathology,2006(55) :401-412.

　　[6] GruyterJ. de, Woudenberg J. H. C, Aveskamp M. M , et al. Redisposition of Phoma-like ana- morphsin Pleosporales. Studies in Mycology,2012(75) :1-36.