GB/T 31795-2015 番茄黑环病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31795—2015

　　番茄黑环病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofTomatoblackringvirus

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31795—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009 给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中华人民共和国天津出入境检验检疫局 、中华人民共和国北京出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :杨翠云 、于翠 、郭京泽 、魏亚东 、邓丛良 、乔艳艳 、崔学慧 、胡培龙 、孙娟 。

　　番茄黑环病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了番茄黑环病毒的 DAS-ELISA、RT-PCR、免疫磁珠 RT-PCR、实时荧光 RT-PCR、鉴别寄主检测和免疫电镜等检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于植物材料 ,包括无性繁殖材料 、种子和苗木中番茄黑环病毒的检疫鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 仪器设备、设施、用具和试剂

　　3. 1 仪器设备

　　酶标仪 、PCR仪 、实时荧光 PCR仪 、超净工作台 、电子天平(感量 0. 001 g) 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像系统 、电子透射显微镜 、水浴锅 、高速冷冻离心机 、超低温冰箱( - 80 ℃) 、高 压 灭 菌 锅 、制 冰 机 、微 波炉 、涡旋振荡器 。

　　3.2 设施

　　植物隔离检疫圃 。

　　3.3 用具

　　可调式微量移液器(2μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)及相应的无 RNase 吸头 、无 RNase 离心管 、PCR管 、研钵 、样品袋 、标签 、镊子 、放大镜 、磁力架等 。

　　3.4 主要试剂

　　除有特殊说明外 ,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 。

　　TBRV抗体 、磁珠(具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子 ,直径 280 nm ,表面标记有甲苯磺酰基) 、Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC) 、液 氮 、三 氯 甲 烷 、异 戊 醇 、异 丙 醇 、乙 醇 、AMV 反 转 录 酶 、RNA 酶 抑 制 剂 、Taq DNA 聚合酶 、DNA分子标记 、溴化乙锭 、琼脂糖 、溴酚蓝等 。

　　血清学和分子生物学检测试剂配制见附录 B。

　　4 症状观察及抽样

　　4. 1 症状观察

　　现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状 ,TBRV为害症状描述参见附录 A。

　　GB/T 31795—2015

　　4.2 抽样

　　发现有病毒为害症状的植物材料直接送检 ;未发现症状的 ,则按 SN/T 2122 中规定进行抽样 ,并送实验室检疫鉴定 。

　　5 检疫鉴定

　　5. 1 双抗体夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA)

　　对种苗 、球茎或由种子催生长出的叶片研磨 ,并加入抽提缓冲液 按 1 ∶ 10(质 量 ∶ 体 积) 的 比 例 稀释 ,制备的汁液分别盛装于离心管中 ,离心后吸取上清液作为待测样品,并设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。具体操作步骤见附录 C。

　　5.2 RT-PCR方法

　　将种苗 、种球或种子催生长出的叶片液氮研细 ,取 0. 1 g用于提取植物总 RNA。具体操作步骤见附录 D。

　　5.3 免疫磁珠 RT-PCR方法

　　首先进行免疫磁珠的分离 ,包括 :清洗磁珠 、抗体包被和抗原吸附 , 然后 RT-PCR 反应 。具体操作步骤见附录 E。

　　5.4 实时荧光 RT-PCR方法

　　将种苗 、种球或种子 催 生 长 出 的 叶 片 液 氮 研 细 , 取 0. 1 g 用 于 提 取 植 物 总 RNA。 具 体 操 作 步 骤见附录 F。

　　5.5 鉴别寄主测定方法

　　在栽种于 植 物 隔 离 检 疫 圃 中 的 鉴 别 寄 主 植 物 真 叶 长 出 后 用 于 摩 擦 接 种 , 对 DAS-ELISA 或RT-PCR检测 TBRV呈阳性的样品,加入适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主 。 当任意一种鉴别寄主植物出现如下描述症状时 , 即可判定接种成功 :

　　a) 昆诺藜(Chenopdium quinoa) 或苋 色 藜(Chenopdium amaranticolor) : 接 种 叶 出 现 局 部 褪 绿斑 ,然后出现系统褪绿斑驳 。

　　b) 黄瓜(Cucumissativus) :接种叶出现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑 ,后出现系统环线脉 ,畸形 。

　　c) “Prince”菜豆(Phaseolusvulgaris var.Prince) :接种叶出现局部褪绿 、坏死或畸形 。

　　d) 矮牵牛(Petunia hybrida) :接种叶出现局部枯斑或坏死环斑 ,然后出现系统褪绿环斑 、线纹或明脉 。

　　e) 番杏(Tetragonia expansa) :接种叶出现细轮纹 ,后出现环斑 。

　　f) 黄花烟(Nicotianarustica) :接种叶产生局部褪绿 、坏死斑或环斑 。

　　g) 白肋烟(N. tabacum White burley)或三生烟(N. tabacum Samsun NN) : 接种叶产生局部坏死环和斑点 ,系统斑点 、环或者线条斑 。

　　h) 克利夫兰烟(N. clevelandii) :接种后接种叶产生局部环斑 。

　　5.6 免疫电镜方法

　　利用番茄黑环病毒抗血清富集植物材料中的病毒 ,在透视电子显微镜下观察病毒粒子的形态特征 ,

　　具体操作步骤按照 SN/T 1840规定进行 。如观察到直径为 28 nm 的球状病毒粒子大量聚集或者有被抗体修饰的现象 , 即可判定免疫电镜结果阳性 。

　　6 结果判定

　　样品经 DAS-ELISA或者 RT-PCR检测结果为阴性 ,判定该样品不携带番茄黑环病毒 。

　　样品经 DAS-ELISA检测为阳性 ,如果 RT-PCR 或者免疫磁珠 RT-PCR 结果阳性 ,且序列测定结果证实与所检测的番茄黑环病毒一致 ; 或者经实时荧光 RT-PCR 检测为阳性时 ,可判定样品携带番茄黑环病毒 。

　　样品经 DAS-ELISA或者 RT-PCR检测结果为阳性 ,经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时 ,可判定样品携带番茄黑环病毒 。

　　7 样品保存与记录

　　7. 1 样品保存

　　经检测确定携带番茄黑环病毒的样品,应妥善保存在适合的条件下以备复核 。如种子保存在干燥室温环境中 ;种苗 、鳞球茎等样品保存在 -80℃冰箱中 ,做好登记和标记工作 。

　　7.2 记录

　　样品来源 、种类 、取样人员 、实验的时间 、地点 、方法和结果 、检疫员的签字等 。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值 , 生物学测定应有鉴别寄主的症状照片 , 免疫电镜检测需要有电镜 图 片 , RT-PCR 和免疫磁珠 RT-PCR检测应有电泳图及序列测定分析结果 。 实时荧光 RT-PCR 检测需要有荧光曲线图与 Ct值 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　番茄黑环病毒相关信息

　　A. 1 番茄黑环病毒基本信息

　　中文名 :番茄黑环病毒

　　学名 :Tomatoblackring virus

　　缩写 :TBRV

　　分类地位 :豇豆花叶病毒科(Comoviridae) ,线虫传多面体病毒属(Nepovirus) 。

　　传播途径 : 由土壤腐生线虫长针线虫属(Longidorus sp.) 传播 ,线虫介体只能短距离传播 。 TBRV可在超过 15个属的 24种以上的植物中种传 ,通过种子和土壤随运输过程传播 ,被害多年生植物的繁殖材料也可以传播病毒 。

　　A.2 方法原理

　　病毒粒子的形态特征 、为害症状 、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据 。采用 DAS-ELISA、RT-PCR、免疫磁珠 RT-PCR、实时荧光 RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行番茄黑环病毒的检疫鉴定 。

　　番茄黑环病毒有很多株系 ,所以异名较多 :大豆环斑病毒 Bean ringspotvirus;甜菜环斑病毒 Beet ringspotvirus;芹菜黄脉病毒 Celeryyellow vein virus;莴苣环斑病毒 Lettuceringspotvirus;马铃薯束状病毒 Potatobouquetvirus;马铃薯伪奥古巴病毒 Potato pseudo-aucuba virus。其中 ,甜菜环斑病毒的核苷酸序列与 TBRV其他株系的核苷酸序列差异较大 , 附录 F 的实时荧光 RT-PCR方法不适合甜菜环斑病毒的检测 。

　　根据血清学上的差异 ,番茄黑环病毒的株系主要属于两个血清型 :苏格兰血清型(S) 和德国血清型(G) 。S 血清型主要是莴苣环斑株系和马铃薯束状株系;G 血清型主要是甜菜环斑株系和马铃薯伪奥古巴株系 。而芹菜黄脉株系则居于二者之间 。

　　A.3 生物学特性

　　A.3. 1 主要寄主

　　番茄黑环病毒的寄主范围很广 ,可以广泛侵染单子叶 、双子叶的草本和木本植物 。包括其中重要的经济作物 ,如葡萄和其他果树 、甜菜 、马铃薯和蔬菜(葱属 、甜菜属 、芸薹属 、莴苣属 、番茄属和菜豆属的一些种)以及观赏植物 ,它还能侵染乔木和灌木以及一些杂草品种 。

　　主 要 寄 主 包 括 : 番 茄 (Lycopersicon esculentum ) , 韭 葱 (Allium porrum ) , 芹 菜 (Apium graveolens) , 甜 菜 ( Beta vulgaris var. saccharifera) , 莴 苣 (Lactuca sativa) , 菜 豆 ( Phaseolus vulgaris) ,马铃薯(Solanum tuberosum) , 黄 瓜(Cucumis sativus) , 朝 鲜 蓟(Cynara scolymus) , 唐 菖 蒲(Gladiolushybrids) ,黑莓(Rubusfruticosus) ,覆盆子(Rubusidaeus) ,茄子(Solanum melongena) , 葡萄(Vitisvinifera) , 黑 穗 醋 栗(Ribesnigrum) , 桃 子(Prunus persica) , 瑞 典 芜 菁(Brassica napus var napobrassica) ,芜菁(Brassicarapa) ,水仙(NarcissusLinn. ) ,洋葱(Allium cepa) ,甜椒(Capsicum an-

　　nuum) ,草莓(Fragaria ananassa) ,欧丁香(Syringavulgaris) ,金连翘(Forsythia intermedia)等 。

　　A.3.2 野生寄主

　　野生寄主 包 括 : 西 洋 接 骨 木 (Sambucus nigra) , 荠 菜 (Capsella bursa-pastor) , 宝 盖 草 (Lamium amplexicaule )等 。

　　A.3.3 受影响的植物部分

　　整株 、叶片 、果实/荚 。

　　A.3.4 为害症状

　　作物和杂草被害后很少有症状或无症状 ,但影响植物的生长 。生长不良的植株在田间块状分布 ,而且逐年扩展 。通常早春症状比较明显 ,而生长旺季的夏季不明显 。

　　TBRV 为害覆盆子(Rubusidaeus)时 ,可造成不同栽培品种的红覆盆子矮化 、褪绿斑驳 、环斑 、叶片卷曲或者果实变形易碎 ,产量降低 。 当与覆盆子环斑病毒同时出现时 ,病情加重 ,加速植物死亡 。

　　TBRV为害草莓时 ,依据不同的栽培品种或年限 , 可导致草莓变色 、斑点和环斑 ,后期叶片可能无症状 ,但在随后几年中症状会回复 ,并进一步矮化 ,最终死亡 。

　　TBRV为害甜菜和莴苣引起环斑 ;为害马铃薯形成坏死黑斑 ,造成花束状病害和伪奥古巴病害 ; 为害芹菜 、接骨木和其他一些灌木引起黄脉症状 ;为害洋葱造成叶片的黄色斑点 、条纹和变形等 。

　　A.3.5 传播方式

　　番茄黑环病毒由土壤腐生线虫长针线虫属(Longidorus sp.)传播 。线虫的幼虫和成虫均可传播病毒 ,但病毒无法在介体中增殖 ,蜕皮后不再带毒 ,也不能随卵传给后代 。L.elongatus在休耕土壤中能保持侵染性达 9 周 。线虫介体只能短距离传播 。

　　TBRV 可在超过 15个属的 24种以上的植物中种传 ,并能通过花粉和胚珠发生种传 ,特别是一些农作物 和 杂 草 经 常 发 生 种 传 现 象 , 使 得 病 毒 的 传 播 更 为 广 泛 。 许 多 植 物 种 传 率 超 过 10% , 甚 至 达 到100% ,如甜菜 、黄豆 、莴苣和番茄的种传率分别为 : 3% ~ 7%、83%、3%和 20% 。很多植物通过种传侵染表现无症 。病毒通过父本和母本传到悬钩子和草莓的种子 ,但是通过带有病毒的花粉进行授粉并不侵染 。在一些杂草种子 中 , TBRV 的 侵 染 延 迟 萌 芽 。病 毒 还 可 以 通 过 种 子 和 土 壤 随 运 输 过 程 进 行 传播 ,被害多年生植物的繁殖材料也可以传播病毒 。

　　A.4 分布

　　欧洲 :克罗地亚 、捷克 、丹麦 、芬兰 、法国 、德国 、希腊 、匈牙利 、爱尔兰 、意大利 、摩尔多瓦 、荷兰 、挪威 、波兰 、葡萄牙 、罗马尼亚 、俄罗斯 、西班牙 、瑞典 、英国 、南斯拉夫 。

　　亚洲 : 中国 、印度 、日本 、土耳其 。

　　非洲 :肯尼亚 、摩洛哥 。

　　美洲 : 巴西 、加拿大 、美国 。

　　大洋洲 :加罗林群岛 。

　　A.5 病毒粒体形态

　　病毒粒子为直径约 28 nm 的 正 二 十 面 体 结 构(T= 1) , 蛋 白 质 外 壳 的 相 对 分 子 质 量 为 57 000, 由

　　A.6 基因组

　　番茄黑环病毒由两条单链 RNA组成 ,德国血清型的 RNA-1为 7356nt ,RNA-2为 4662nt ;苏格兰血清型的 RNA-2为 4618nt。某些分离物含有 1375 nt的卫星 RNA 。RNA-1可独立于 RNA-2复制 ,但两个基因组 RNA是侵染植物所必需的 。每个 RNA都在 3'末端含有多聚腺苷酸 ,在 5'末端均含有基因组结合蛋白质 。RNA-2包含编码病毒外壳蛋白的基因 。

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　试剂配制

　　B. 1 10×PBST缓冲液(pH 7. 4)

　　氯化钠(NaCl) 80. 0 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 11. 5 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 2. 0 g

　　氯化钾(KCl) 2. 0 g

　　吐温-20(Tween-20) 5 mL

　　加入 900 mL水溶解 ,调 pH 到 7. 4,然后补水至 1 L。

　　B.2 样品抽提缓冲液(pH 7. 4)

　　加入 800 mL水溶解 ,调 pH 到 7. 4,然后补水至 1 L,4 ℃储存 。

　　B.3 包被缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　加入 900 mL水溶解 ,调 pH 到 9. 6,然后补水至 1 L,4 ℃储存 。

　　B.4 酶标抗体缓冲液(pH 7. 4)

　　B.5 底物(pNPP)缓冲液(pH 9. 8)

　　氯化镁(MgCl2 ) 0. 1 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　二乙醇胺 97 mL

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,调 pH 至 9. 8,蒸馏水定容至 1 L,4 ℃储存 。

　　B.6 反应终止液

　　氢氧化钠(NaOH)120g溶于 1000 mL 的无菌蒸馏水中 ,浓度为 3 mol/L。

　　B.7 电泳缓冲液 TAE(50× )

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

　　冰乙酸 52. 1 mL

　　乙二胺四乙酸二钠(EDTA,0. 5 mol/L) 100 mL

　　用时加蒸馏水稀释至 1×TAE。

　　B. 8 溴化乙锭(EB)溶液(10μg/μL)

　　溴化乙锭 20 mg

　　灭菌去离子水 20 mL

　　B.9 缓冲液 B(0. 1 mol/L 硼酸缓冲液,pH 9. 5)

　　硼酸(H3BO3 ) 6. 183 g

　　溶解于 800 mL去离子水中 , 以 5 mol/L NaOH 调 pH 至 9. 5并定容至 1 000 mL。

　　B. 10 缓冲液 C[磷酸盐缓冲液(含 0. 1%BSA) pH 7. 4]

　　氯化钠(NaCl) 0. 88 g

　　牛血清白蛋白(BSA) 0. 1g

　　溶解于 80 mL 0. 01 mol/L磷酸钠缓冲液中 ,调 pH 至 7. 4,彻底混匀并定容至 100 mL。

　　B. 11 缓冲液 D (0.2 mol/L TrispH 8.5 和 1 g/L BSA)

　　2. 42 gTris溶 于 80 mL 去 离 子 水 中 , 用 1 mol/L HCl调 pH 至 8. 5。 然 后 加 入 0. 1% BSA 至100 mL。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　C. 1 检测

　　C. 1. 1 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上 ,包括 2 个阳性对照孔 , 2 个阴性对照孔 , 2 个空白对照孔和多个待检测样品孔 。待测样品孔每个样品重复 2 次 。

　　C. 1.2 每孔加入 100 μL的 TBRV 的包被抗体溶液 , 封口膜包好 , 37 ℃孵育 2 h~ 4 h(或 4 ℃冰箱过夜) 。

　　C. 1.3 将酶联板孔中溶液控干 ,用 200 μL的 1×PBST洗涤液洗涤酶联板 3 次 ,每次 3 min,然后在滤纸上扣干 。

　　C. 1.4 将 100 μL待测样品溶液加入到待检测孔中 ,对照孔中也各加入 100 μL相应的阴性对照 、阳性对照和空白对照 。封口膜包好 ,37 ℃孵育 2 h~ 3 h(或 4 ℃冰箱过夜) 。

　　C. 1.5 洗涤 ,步骤同 C. 1. 3。

　　C. 1.6 用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体 , 每孔加入 100 μL酶标抗体溶液 ,封口膜包好 , 37 ℃孵育 2 h~4 h。

　　C. 1.7 洗涤 ,步骤同 C. 1. 3。

　　C. 1. 8 将 pNPP溶于底物缓冲液中 ,使最终浓度为 1 mg/mL。 每孔加入 100 μL配好的底物溶液 , 室温孵育 0. 5 h~ 2 h。必要时每孔加入 50 μL的 3 mol/L氢氧化钠溶液终止反应 。

　　C. 1.9 酶标仪 405 nm 波长下检测各孔的吸收值并记录 。

　　注 : 若采用商品化试剂盒 ,则按照试剂盒的说明进行操作 。

　　C.2 结果判定

　　C.2. 1 质量控制要求

　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值小于 0. 15, 阴性对照孔的 OD405值小于 0. 05时 ,按 0. 05计算 。 阳性对照有明显的颜色反应 ,孔的重复性以样品 OD值的平行允许率控制 ,按照式(C. 1)进行计算 :

　　P

　　式中 :

　　P — 平行允许率 ;

　　OD1— 重复样品 1 的 OD值 ;

　　OD2— 重复样品 2 的 OD值 。

　　当重复检测样品 OD值平行允许率(P)小于 20%时 ,判定检测结果有效 。

　　C.2.2 判定原则

　　若满足不了 C. 2. 1 的质量要求 ,则不能进行结果判定 。

　　在满足了 C. 2. 1 的质量要求后 ,则按如下原则作出判定 :

　　样品 OD405/阴性对照 OD405值明显大于 2,结果判定为阳性 ;

　　样品 OD405/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重做一次或者用其他方法进行验证 ;样品 OD405/阴性对照 OD405值明显小于 2,判为阴性 。

　　附 录 D (规范性附录) RT-PCR方法

　　D. 1 引物序列

　　上游引物 TBRV-F723: 5'-CCCTAGAAGTGAGCCTATG-3'

　　下游引物 TBRV-R723: 5'-TCAGGTAGGAGTTTCGCAG-3'

　　扩增片段长度 723bp。

　　D.2 RNA提取

　　D.2. 1 适量待测样品液氮研细 ,然后取 0. 1 g放到新的 1. 5 mL离心管中 ,加入 1 mL Trizol,混匀 。

　　D.2.2 加入 0. 2 mL三氯甲烷 ,猛烈振荡 15 s,4 ℃ 11 000 r/min离心 10 min,小心吸取上层无色水相到新离心管中 。

　　D.2.3 加入等体积异丙醇 ,混匀 , -20 ℃静置 10 min,4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min,保留沉淀 。 D.2.4 加入 1 mL 75%冷乙醇 ,悬浮沉淀 ,4 ℃ 8000 r/min离心 10 min,干燥沉淀 。

　　D.2.5 加入 30 μL DEPC-H2 O,溶解沉淀(必要时 ,55 ℃ ~ 60 ℃水浴 10 min,加速溶解) ,存于 -80 ℃备用 。

　　注 : 或者按照植物总 RNA提取试剂盒说明进行操作 。

　　D.3 反转录

　　反应体系及反应条件见表 D. 1,试剂加样量可根据具体情况进行适当调整 。也可采用 RT-PCR 一步法试剂盒 ,操作步骤按使用说明进行 。

　　表 D. 1 反转录反应体系与反应条件

　　D.4 核酸扩增

　　PCR反应体系见表 D. 2,每个样品设 2个平行处理 。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。检测时以含番茄黑环病毒材料的 cDNA 或含有番茄黑环病毒材料 目标片断的质粒作为阳性对照 , 以健康植物材料的 cDNA作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　PCR反应条件 :94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s,30个循环;72 ℃ 10 min延伸 。

　　表 D.2 PCR反应体系

　　D.5 琼脂糖凝胶电泳检测

　　D.5. 1 制备凝胶

　　用 1×TAE配制 1. 5%琼脂糖凝胶 ,加热溶化后冷却至 55 ℃左右 。

　　D.5.2 加溴化乙锭

　　将溴化乙锭(EB)加入到配制好的凝胶中 ,EB终浓度为 0. 5 μg/mL。将凝胶倒入凝胶槽中 ,插上样品梳子 。冷却凝固后拔掉梳子 ,在电泳槽内加入 1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约 1 mm。

　　D.5.3 加样

　　将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔 , 同时设计 PCR 的阴性对照和阳性对照 ,并加入相对分子质量标准物(Marker) 。

　　D.5.4 电泳

　　接通电源 , 以 3 V/cm~ 5 V/cm 电场强度进行电泳 ,0. 5 h后观察结果 。

　　D.5.5 结果观察

　　电泳结束后 ,将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察 ,记录结果 。

　　D.6 结果判定

　　如果阴性对照和空白对照未出现条带 , 阳性对照出现 723bp大小的条带 ,样品未出现 723 bp大小

　　的条带 ,则可判定样品为番茄黑环病毒阴性 。

　　如果阴性对照和空白对照未出现条带 , 阳性对照出现 723bp大小的条带 ,样品出现 723 bp大小条带 ,可通过测序的方式进一步确认 。如果 PCR产物序列与番茄黑环病毒的序列同源 ,则可判定样品为番茄黑环病毒阳性 ,若序列不同源 ,则可判定样品为番茄黑环病毒阴性 。

　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　免疫磁珠 RT-PCR方法

　　E. 1 免疫磁珠分离

　　E. 1. 1 磁珠清洗

　　取充分混匀后的磁珠 5 μL加入到 0. 2 mL PCR管中 ,加入 100μL的缓冲液 B后充分混匀并离心 , PCR管于磁性分离架上静置约 2 min, 至磁珠贴壁 、液体部分澄清透明后吸去清液 。该清洗过程重复3 次 ,彻底清洗磁珠 , 以备后用 。

　　E. 1.2 抗体包被

　　用包被缓冲液稀释抗体到所需浓度 ,在已清洗的磁珠中分别加入 100 μL抗体溶液 ,充分混匀后置37 ℃孵育器中旋转悬挂 16h~ 18h。取出离心 ,放于磁性分离架上静置约 2 min,磁珠贴壁后吸除清液 ,分别加入 100 μL缓冲液 C 4 ℃清洗 5 min,重复清洗 3 次 ;再分别加入 100 μL缓冲液 D,充分混匀后37℃悬挂 4 h,最后用缓冲液 C 4 ℃清洗 5 min。

　　已经包被抗体的磁珠可以直接用于抗原吸附 。若暂时不用 ,也可保存于缓冲液 C 中 ,在 4 ℃的温度条件下可保存数月 ,为避免滋生细菌 ,可加 0. 02%的叠氮钠 。

　　E. 1.3 抗原吸附

　　取带毒叶片 50 mg置于研钵中 ,加入 1 mL病毒提取缓冲液研磨均匀 ,8 000 r/min离心 5 min,加入到包被有抗体的磁珠中 ,用枪头轻轻吹打 1 min,混合均匀 ; 将此悬浊液置 37℃孵育器中 2 h,过程中始终保持离心管的旋转振荡 ,避免磁珠沉淀到管底 ,影响吸附效果 ;将包被好抗原的磁珠放于磁力架上吸附 2 min左右 ,待磁珠贴壁 ,液体部分澄清透明 ,去除清液 ,备用 。将吸附好抗原的磁珠用无 RNase的水漂洗 ,5 000g 30 s离心沉淀磁珠 。

　　E.2 cDNA 第一链的合成

　　直接在吸附了病毒的带有磁珠的离心管中进行反转录 。反转录体系总体积为 20 μL,其中 1 μL反向引物(20μmol/L) ,4 μL5×AMV酶缓冲液 ,2 μLdNTP(10 mmol/L) ,10μL无 RNase水 ,稍离心混匀后置于 85 ℃孵育器中变性 5 min,迅速置冰上 2 min~ 3 min, 然 后 迅 速 加 入 2 μL AMV 反 转 录 酶(5U/μL) ,1 μL RNA酶抑制剂(40U/μL) ,42 ℃反应 1 h。

　　E.3 PCR反应

　　具体操作步骤见 D. 4 和 D. 5。

　　E.4 结果判定

　　结果判定见 D. 6。

　　附 录 F

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR方法

　　F. 1 实验步骤

　　F. 1. 1 引物和探针设计

　　引物序列 :上游引物 TBRV-FP:5'-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3'

　　下游引物 TBRV-RP:5'-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3'

　　探针序列 :TBRV-MGB-PROBE:FAM-CACAGATACCACATGTGGA-MGB

　　F. 1.2 RNA提取及反转录

　　操作方法见 D. 2 和 D. 3。

　　F. 1.3 实时荧光 PCR反应体系

　　实时荧光 PCR反应体系见表 F. 1,每个样品设 2 个平行处理 。并设阳性对照 、阴性对照和空白对照 , 以含有番茄黑环 病 毒 的 cDNA 为 阳 性 对 照 ; 以 健 康 植 物 材 料 或 线 虫 传 多 面 体 病 毒 属 其 他 病 毒 的cDNA作为阴性对照 ; 以水代替 DNA模板作为空白对照 。每种对照各做 2个平行管 。

　　表 F. 1 实时荧光 PCR反应体系

　　F. 1.4 实时荧光 PCR反应参数

　　反应条件 :预变性 94 ℃ 10 min, 94 ℃ 15 s,60 ℃ 40 s,共 40个循环 。

　　本反应条件适用于 ABI7500型荧光 PCR 仪 , 如使用其他荧光 PCR 仪 , 可根据仪器性能进行适当调整 。操作方法按照仪器的使用说明进行 ,反应结束后保存各项数据和图像 。

　　F.2 结果判定

　　F.2. 1 阈值设定

　　阈值设定根据仪器噪音情况进行调整 ,或以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点 ,结果显示阴性为准 。

　　F.2.2 结果判定

　　在阳性样品和阴性样品 Ct值正确的情况下 ,进行以下判定 :

　　— 待测样品的 Ct值为 40或无 Ct值时 ,则判定结果阴性 。

　　— 待测样品的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定结果阳性 。

　　— 待测样品的 Ct值小于 40且大于 35时 ,应重新进行测试 ,如果重新测试的 Ct值为 40时 ,则判定结果阴性 。如果重新测试的 Ct值小于 40且大于 35时 ,则判定结果阳性 。