GB/T 31796-2015 南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 010 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31796—2015

　　南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofFusarium tucumaniae and

　　Fusarium virguliforme

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31796—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :吴品珊 、王颖 、章桂明 、陈枝楠 。

　　南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆

　　猝死综合症病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于田间大豆和大豆粒携带的土壤和病残体中南 、北美大豆猝死综合症病菌的鉴定 。

　　2 仪器和用具

　　2. 1 仪器

　　生物显微镜 、超净工作台 、光照培养箱 、电子天平(1/1 000 g) 、高压灭菌锅 、冰箱 、PCR 扩增仪 、荧光PCR扩增仪 、电泳仪 、凝胶成像仪 、高速冷冻离心机 、恒温水浴锅 、摇床 。

　　2.2 用具

　　烧杯 、三角瓶 、量筒 、试管 、培养皿 、酒精灯 、镊子 、剪刀 、解剖刀 、接种针 、载玻片 、盖玻片 、塑料研杵 、移液器 、移液器吸头 、离心管 、液氮罐 。

　　3 试剂和培养基

　　3. 1 试剂

　　琼脂粉 ,马铃薯 ,葡萄糖 ,乳酸 ,琼脂糖 ,无菌双蒸水 ,液氮 ,蛋白胨 ,磷酸二氢钾 ,硫酸镁 ,链霉素 ,新霉素 , 五 氯 硝 基 苯 , 氯 四 环 素 , 利 福 平 , Tris-HCl, MgCl2 , HCl, EDTA, NaOH , NaOAc, KCl, Tris, CTAB,TAE,无 水 乙 醇 (Ethanol) , 苯 酚 (Phenol) , 溴 化 乙 锭 (EB) , 三 氯 甲 烷 (Chloroform) , 异 丙 醇(Isopropanol) ,异戊醇(Isoamylalcohol) ,蛋白酶 K,Taq DNA 聚合酶 ,dNTP,DNA相对分子质量标准物 ,双重 PCR 特 异 性 引 物 Fu1/2和 Fsg-α-1/2, 实 时 荧 光 PCR 特 异 性 引 物 及 探 针 16-FP/16-RP 和16-AG,TaqMan UniversalPCR Master Mix。

　　3.2 培养基

　　0. 2%水 琼 脂 培 养 液 , 选 择 性 培 养 基 PCNB, 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 (PDA) , 低 营 养 合 成 培 养 基

　　(SNA) 。具体配方参见附录 A。

　　4 检疫鉴定方法

　　4. 1 症状检查

　　南 、北美大豆猝死综合症在症状上区别不大 ,病害典型的症状是叶片的叶肉枯黄坏死 , 叶脉有时保持绿色 ,根部维管束组织有褐色病变 ,髓部白色 。参见附录 A病害症状描述 。

　　采集田间疑似症状大豆植株的根部 、植株周围的土壤 ,备用 。在大豆粒中筛选其携带的土壤 ,并挑选其中混杂的病残体 ,尤其是大豆的地下部分根 ,备用 。

　　GB/T 31796—2015

　　4.2 分离培养

　　将土壤样品每份取 2 g 放入 100 mL 0. 2%的水琼脂培养液中 ,摇床摇动 、混匀 20 min,用无菌水将培养液分别稀释 10倍和 20倍 ,分别取 1 mL土壤稀释液涂抹于选择性培养基 PCNB平板上 。 每处理5个重复 ,23 ℃光照培养 ,4 d~ 7 d后观察菌落的产生情况 。

　　将病残体切取边长为 5 mm~ 10 mm 的见方小块 ,70%乙醇表面消毒 10 s~ 30 s,放置在选择性培养基 PCNB上 ,20 ℃ 12 h光照/12h黑暗培养 1周 ~ 2周 。

　　4.3 形态学鉴定

　　如在选择性培养基 PCNB上观察到真菌菌落的形成 ,转接到 PDA 上 ,20 ℃ 12h光照/12h黑暗或自然光线下培养 ,3 d~ 5 d 后 开 始 观 察 记 录 病 菌 的 培 养 性 状 , 显 微 镜 下 观 察 记 录 分 生 孢 子 的 形 状 和大小 。

　　如 PDA上有疑似菌落出现 ,转 到 SNA 上 20 ℃黑 暗 培 养 , 显 微 镜 下 观 察 记 录 分 生 孢 子 的 形 状 和大小 。

　　4.4 分子生物学检测

　　4.4. 1 DNA提取

　　收集分离到的真菌菌丝 ,采用 CTAB方法提取 DNA,参见附录 B。

　　4.4.2 双重 PCR检测

　　北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme)的双重 PCR特异性引物为 :Fu1: 5'-GGAGGG ATCATTACCGAGTT-3', Fu2: 5'-TTCCAGTTGCGAGGTGTTA-3', Fsg-α-1: 5'-AGTCGACCACCGTAAG TCG-3',Fsg-α-2:5'-GATCAGGGCTTTGTCCAAC-3'。

　　反应体系(25μL) : 10× PCR 缓冲液 3 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 10 mmol/L dNTP 0. 5 μL, 10 μmol/L Fu1/2引 物 各 0. 8 μL, 10 μmol/L Fsg-α-1/2引 物 各 1. 0 μL,Taq DNA 聚 合 酶 1 U , 模 板DNA 4 ng,加灭菌双蒸水至 25 μL。

　　反应条件 :94 ℃ ,5 min变性处理后 ,经 30个循环(94℃ ,1 min;55℃ ,30s;72℃ 30 s) ,72 ℃延伸10 min。

　　1. 2%琼脂糖凝胶电泳 ,EB染色 ,凝胶成像系统观察电泳结果 。

　　4.4.3 荧光 PCR检测

　　南美 大 豆 猝 死 综 合 症 病 菌 (Fusarium tucumaniae) 荧 光 PCR 引 物 及 探 针 序 列 为 : 16-FP: CCAGTGGTGCGGAAGGTA,16-RP:GACGGCGATTCCAACAGTAG,16-AG:JUP-ACCCTAGAG CTCGTCTT-JUP。

　　反应体系(10μL) :实时荧光反应混合液 5 μLTaqMan UniversalPCR MasterMix,0. 3 μL各引物(10μmol/L) ,0. 3 μL探针(10μmol/L) ,1 μL DNA(10ng/μL) ,无菌双蒸水 3. 1 μL。将反应体系混匀 ,离心后置于实时荧光 PCR仪中进行反应 ,每个反应重复 2 次 。 以无菌双蒸水作空白对照 , 阳性对照以南美大豆猝死病菌 DNA为模板 , 阴性对照以大豆上其他镰刀菌 DNA 为模板 。

　　反应条件为 50 ℃预热 2 min, 95 ℃变 性 10 min, 然 后 进 入 循 环 反 应 : 95 ℃变 性 15 s, 60 ℃延 伸1 min,共 40次循环 。

　　5 鉴定特征

　　5. 1 培养性状

　　南 、北美大豆猝死综合症病菌在菌落培养形状上区别不大 。

　　南 、北美大豆猝死综合症病菌的菌落在选择性培养基 PCNB上 4 d~ 7 d可显现 。特征是生长速度较缓慢 ,直径小 ,一般为 0. 5 cm~0. 9 cm;颜色为白色 , 中心有时为浅黄色突起 ;形状为圆形 、星型或放射状 ;菌落微隆 ,表面为粉笔末的颗粒状 ,较致密 ,无气生菌丝覆盖 。

　　南 、北美大豆猝死综合症病菌在 PDA 上菌落通常为蓝绿色 、灰绿色 、浅绿色或蓝色 ,偶尔黄白色 ,菌落边缘为灰白色 ,缺乏气生菌丝 。 随着菌落的年龄增长 ,颜色由蓝绿色变化为蓝紫色或深绿色 。

　　5.2 病菌形态

　　南美大豆猝死综合症病菌(F. tucumaniae)菌丝在 SNA上宽 1 μm~ 5 μm(~ 14μm) ,厚垣孢子形成在菌丝和分生孢子上 ,通常在末端 ,偶尔在中间形成 ,亚球型 、单个 ,无色至白色 、黄灰或白黄 ,外表光滑至粗糙 ,有时有小疣 ,大小(8μm~ 20 μm) × (10μm~ 20μm) 。F. tucumaniae在荧光或自然光培养的 PDA上 ,菌落蓝绿色 ,黑暗条件下为浅色 , 产孢快速且丰富 。 SNA 和 PDA 上的分生孢子座都很丰富 ,但 PDA上很少有菌丝链 。气生的分生孢子梗在 SNA上丰盛 ,通常无分枝或零星分枝 ,长 230 μm ,宽 2 μm~ 2. 5 μm ,形成单瓶梗粘在顶部 ,气生瓶梗钻型到近圆柱型 。气生分生孢子有两种类型 ,第一种是弯柱状到镰刀形 ,2~ 5 隔膜 ,有足细胞 , 与镰刀形的分生孢子座的分生孢子形态区分明显 , 主要形成在较高的分生孢子梗上 ;第二种分生孢子微小 、卵圆 、0~ 1分隔 ,大小范围(4. 5 μm~ 13 μm) × (2 μm~ 3. 5 μm) ,平均(6. 6 μm~ 7. 7 μm) × (2. 4 μm~ 2. 7 μm) , 在 菌 落 的 一 小 部 分 上 形 成 , 长 在 高 50 μm、宽2 μm~ 3 μm 的短分生孢子梗上 。

　　F. tucumaniae分生孢子座的分生孢子梗轮状分枝或很少分枝 ,顶部生成单瓶梗 ,分生孢子座瓶梗简单 、钻形 、安锫瓶形 ,顶端通常有个显著的囊领 。分生孢子座的分生孢子通常圆柱形 、微弯 ,有时镰刀形 ,背部和腹部线条接近平行 ,有尖锐的顶部细胞和明显的足细胞 , (2~ )3~4(~ 6)隔膜 。SNA 上 3 隔膜大型分生孢子大小 范 围 为 (38 μm ~ 72. 5 μm) × (4 μm ~ 6. 5 μm) , 平 均 (52. 2 μm ~ 63. 3 μm) × (4. 7 μm~4. 9 μm) , 在 PDA 上 , 大 小 范 围 (34. 5 μm ~ 71 μm) × (4 μm ~ 5. 5 μm) , 平 均 (55. 0 μm ~ 58. 3 μm) × (4. 7 μm~4. 9 μm) ,SNA上 4 隔膜大型分生孢子大小范围为(50. 5 μm~ 81 μm) × (4 μm~ 5. 5 μm) ,平 均 (62. 5 μm ~ 67. 3 μm) × (4. 8 μm ~ 5. 0 μm) , PDA 上 (55 μm ~ 77. 5 μm) × (4 μm ~ 5. 5 μm) ,平均(58. 0 μm ~ 61. 4 μm) × (4. 7 μm ~ 5. 0 μm) , SNA 上 5 隔 膜 大 型 分 生 孢 子 大 小 范 围(57. 5 μm~ 88. 5 μm) × (3. 5 μm~ 6 μm) ,平均(65. 3 μm~ 74. 1 μm) × (4. 8 μm~ 5. 1 μm) 。第二种分生孢子座孢子或缺乏 ,短棍 棒 状 、椭 圆 形 或 舟 形 , 直 或 微 弯 , 有 一 个 圆 的 顶 端 和 平 截 的 基 部 , 0~ 1 分 隔 , [20 μm~ 27μm(~ 51. 5 μm)] × (2. 5 μm~ 6 μm) ,在 PDA上偶尔形成链状 。

　　北美大豆猝死综合症病菌(F. virguliforme)在 20 ℃黑暗条件下 PDA 上的菌落每 日生长速度为1. 4 mm~ 1. 6 mm ,黑暗条件下 PDA上的菌落白色或黄白色 ,有时有蓝灰色色素 ,分生孢子的疣突浅黄色 ;在荧光和 日光条件下 ,PDA 的菌落颜色从浅黄至灰黄 、灰绿 、浅绿 、松石绿 、深绿 。气生菌丝在粘分生孢子团中稀疏分布在菌落上 ,有时丰富 ,为稀疏或密集的卷毛状 , 白色 、黄白 ,有时灰绿色 ;菌落边缘完整或波状 ,背面色素缺乏 ,有时灰黄色 、橘褐色 , 或橄榄褐色 、黄褐色 ,无味或有腐烂或霉味 。 SNA 上的菌丝宽 1. 5 μm ~ 6 μm(~ 9 μm) ,厚垣孢子在菌丝和分生孢子上形成丰富 ,多数亚球形 , 间生或端生 ,单个不成链 ,透明或浅黄色 ,外表光滑或粗糙 , (8 μm~ 15 μm) × (5. 5 μm~ 12 μm) ,没有菌核 ,产孢快速而丰富 。

　　F. virguliforme在 PDA黑暗条件下菌落为浅色 ,在荧光和日光条件下有绿色到蓝色色素 ,分生孢

　　子座在 SNA 和 PDA 上形成丰富 。气生分生孢子梗在 SNA 上形成丰富 ,有时在 PDA 上形成丰富 ,无分枝或偶有分枝 ,长可到 250μm ,宽 3 μm~ 5 μm ,顶部生成单瓶梗 ,气生瓶梗简单 ,钻形到近圆柱形 ,顶端通常有个显著的囊领 。气生分生孢子有两类 ,第一类是弯柱状到镰刀形 , (~ 2)3(~ 4) 隔膜 ,有足细胞 ,形态与镰刀形分生孢子座上的分生孢子区别明显 , 主要形成在较高的分生孢子梗上 ;第二类孢子微小 ,长圆形 、椭圆形到短棍棒形 ,0~ 1 隔膜 ,范围(4μm~ 11. 5 μm) × (1. 5 μm~ 3. 5 μm) ,平均(6. 8 μm~ 7. 6 μm) × (2. 5 μm~2. 6 μm) ,在菌落的一小部分上形成 ,长在最长为 56μm、宽 2. 5 μm~ 3 μm 的短的分生孢子梗上 。

　　F. virguliforme 的分生孢子座分生孢子轮状分枝 ,很少无分枝 ,在顶部瓶梗上形成 ,分生孢子座瓶梗简单 ,钻形 、安锫瓶形到近圆柱形 ,顶端通常有个显著的囊领 。分生孢子座分生孢子有两种 :第一种是典型的镰刀形 ,有腹背面 , 中部通常最宽 ,两端逐渐变尖变细 , 向彼此方向同等弯曲 ,具相似的顶端和足细胞常难以区分 ,在 PDA 和 SNA上 , (~ 2)3~4(~ 5)隔膜 ,顶部和足部同等份 ,形态上对称 。SNA 上3 隔膜大型分生 孢 子 大 小 范 围 为 (38 μm~ 62 μm) × (4. 5 μm~ 6 μm) , 平 均(50. 2 μm~ 53. 5 μm) × (5. 1 μm~ 5. 2 μm) ,在 PDA 上(36μm~ 61 μm) × (4. 5 μm~ 6 μm) ;4隔膜大型分生孢子在 SNA 上大小范围为(45μm~65μm) × (5μm~ 6 μm) ,平均(53. 8 μm~ 57. 5 μm) × 5. 3 μm,PDA上范围(46 μm~ 65 μm) × (4. 5 μm~ 6 μm) ,平均(54. 6 μm~ 55. 7 μm) × (5. 0 μm~ 5. 5 μm) ; 5 隔 膜 大 型 分 生 孢 子 在SNA上大小范围为(45. 8 μm~ 85. 5 μm) × (5 μm~ 6. 5 μm) ,平均(62. 1 μm~ 63. 5 μm) × (5. 2 μm~ 5. 4 μm) 。第二种类型孢子为逗号形 ,有时短棍棒形 ,有一个鼓起的圆形顶部 ,基部渐细弯曲 , 只在黑暗条件下 PDA上产生;0~1(~2)隔膜 ,大小范围(15. 5 μm~ 30. 5 μm) × (4. 5 μm~ 8 μm) ,平均(22. 0 μm~ 23. 2 μm) × (5. 8 μm~ 6. 3 μm) 。

　　南 、北美大豆猝死综合症病菌形态图参见附录 C,与几个近似种的形态比较参见附录 D。

　　5.3 双重 PCR检测

　　若引物 Fu1/2扩增出 452bp条带 , 同时引物 Fsg-α-1/2扩增出 327 bp条带 ,视为北美大豆猝死综合症病菌阳性 。

　　5.4 实时荧光 PCR检测

　　南美大豆猝死综合症病菌 MGB探针实时荧光 PCR 检测 ,在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 :

　　—Ct值小于或等于 36,判定南美大豆猝死病菌阳性 ;

　　—Ct值大于或等于 40,判定南美大豆猝死病菌阴性 ;

　　—Ct值在 36~40之间 ,应重做实时荧光 PCR,再次扩增后如 Ct值小于或等于 36,或者 Ct值大于或等于 40,判定同上 。

　　6 结果判定

　　病菌的培养性状和形态特征与 5. 1 和 5. 2 的北美大豆猝死综合症病菌描述一致 ,且双重 PCR 检测结果呈阳性 ,可判定为北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme) 。

　　病菌的培养性状和形态特征与 5. 1 和 5. 2 的南美大豆猝死综合症病菌描述一致 ,且实时荧光 PCR检测结果呈阳性 ,可判定为南美大豆猝死综合症病菌(Fusarium tucumaniae) 。

　　7 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出南美大豆猝死综合症病菌或北美大豆猝死综合症病

　　菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　8 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离 并 鉴 定 为 南 、北 美 大 豆 猝 死 综 合 症 病 菌 的 菌 株 , 应 妥 善 保 存 。 将 菌 株 接 种 于PDA培养基斜面上 ,20 ℃培养 5 d,4 ℃ ~ 8 ℃黑暗条件下保存 ,定期(60d)转接 ,至少保存 6个月 。必要时可保存在无菌土壤中 。保存期满后高压灭菌灭活处理 。

　　9 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并应有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　南、北美大豆猝死综合症病菌相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 病菌基本信息

　　英文名 :Sudden death syndrome of soybean(SDS)

　　学名 :Fusarium tucumaniae T. Aoki, O’Donnell, Yos. Homma etLattanzi(南美大豆猝死综合症病菌) ;Fusarium virguliforme O’DonnelletT. Aoki(北美大豆猝死综合症病菌)

　　分类 地 位 : 真 菌 界 (Fungi) , 子 囊 菌 门 (Ascomycota) , 粪 壳 菌 纲 (Sordariomycetes) , 肉 座 菌 目(Hypocreales) ,丛赤壳科(Nectriaceae) 。

　　传播途径 :病菌近距离传播主要通过流水 、土壤的移动和农事操作 ,远距离传播主要通过大豆种苗 、大豆种子中携带的土壤和病残体 。

　　近似种 :与南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌形态上较为近似的种类有巴西大豆猝死综合症病菌(Fusarium brasiliense) 、楔形喙豆类根腐病菌(Fusarium cuneirostrum) 、菜豆根腐病菌(Fusarium phaseoli)和马特镰刀菌(Fusarium martii) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　以南 、北美大豆猝死综合症病菌菌落性状 、形态特征和目标片段的序列特征为判断依据 。

　　A.2 基本情况

　　大豆猝死综合症是美国 、巴西 、阿根廷等几个大豆主产国的一种较新的 、危害性很大的大豆真菌土传病害 ,病菌可在土壤中存活多年 ,可随大豆的贸易传入新的地区 。

　　大豆猝死综合症病原菌于 1997年确定为 Fusarium solanif. sp. glycines,2003年病菌被分为 2个种 , 即南美大豆猝死综合症病菌(Fusarium tucumaniae)和北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virgu- liforme) ,2005年又分出 2个种 , 即巴西大豆猝死综合症病菌(Fusarium brasiliense)和楔形喙大豆猝死综合症病菌(Fusarium cuneirostrum) 。

　　A.3 寄主范围

　　大豆(Glycinemax) 。

　　A.4 病害症状

　　南 、北美大豆猝死综合症在症状上区别不大 ,可表现在幼苗期 、花期和荚果充实期 , 叶部和根部都有症状 。幼苗发病导致发育不正常 ,甚至叶片组织和整个植株迅速死亡 。危害稍轻的成株虽能结荚 ,但豆粒小 ,没有生活力 ,种子坚硬 ,严重影响大豆的产量和质量 。环境条件适合时 ,症状一旦出现 ,整个植株

　　就停止发育 ,迅速死亡 。

　　幼苗期症状通常表现为植株矮小 , 叶片上有圆形褪绿色斑点 ,斑点沿叶脉扩大 , 叶边缘干枯 ,变褐 ,有时卷曲 。根部褐色 ,侧根稀少 。

　　SDS的叶部症状为 ,病害初期 , 叶面上首先出现圆形至不规则型的几个毫米或更大的褪绿色斑点 ,斑点扩大坏死或愈合成叶脉间枯黄的伸长区域 ,最终部分或全部的枯黄组织坏死 ,仅在靠近主脉处保留一点绿色组织 , 叶片的边缘通常会伴随有卷曲的现象 ,有时成杯状 。发病重时叶片脱落 ,仅留有叶柄悬挂在茎上 。

　　根部症状与叶面症状密切相关 。 叶面不表现症状或症状轻微的植株 , 根部无症状 ; 叶片发病严重时 ,则根部腐烂 ,纵向剖开根茎部 ,维管束从灰到红色的褐变可从主根扩展到地面以上几个节的茎部 ,但髓部仍保持白色 。严重感病的植株的主根和下层茎秆上可形成肉眼可见的蓝色菌落 , 即 SDS病原菌的大分生孢子 。

　　图 A. 1所示为北美大豆猝死综合症苗期和成株期症状 。

　　图 A. 1 北美大豆猝死综合症苗期和成株期症状

　　A.5 地理分布

　　南美大豆猝死综合症病菌分布在巴西 、阿根廷 ;北美大豆猝死综合症病菌分布于美国 、阿根廷 。

　　A.6 培养基

　　0. 2%水琼脂培养液 :琼脂 2. 0 g,1 000 mL蒸馏水 ,灭菌 。

　　选择性培养基 PCNB:每 1 L培养基中含 30 g琼脂粉 ,15g蛋白胨 ,1 g磷酸二氢钾 ,0. 5 g硫酸镁 。高压灭菌后冷却到 50 ℃ ,再加入 0. 3 g链霉素 ,0. 3 g新霉素 ,0. 3 g 五氯硝基苯 ,0. 1 g 氯四环素 ,0. 05 g利福平 ,混匀 ,制备平板 。

　　马铃薯葡萄糖培养基(PDA) :马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂 20 g,1 000 mL蒸馏水 ,灭菌 。

　　低营养合成培养基(SNA) :磷酸二氢钾 1. 0 g,硝酸钾 1. 0 g,七水硫酸镁 0. 5 g,氯化钾 0. 5 g,葡萄糖0. 2 g,蔗糖 0. 2 g,琼脂 20 g,1 000 mL蒸馏水 ,灭菌 。

　　附 录 B (资料性附录) DNA提取方法

　　刮取培养基上的菌丝体 ,放入 1. 5 mL浸在液氮里的离心管中 ,用塑料杵碾碎待用 。

　　离心管加入 300 μL~ 500 μLCTAB缓冲液(其中含 0. 1 g蛋白酶 K)混匀 ,65 ℃水浴 1 h;13000g离心 5 min~ 10 min,保留上清液 ;加 500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 24 ∶ 1) 混匀 , 13 000 g 离心5 min~10min,保留上清液 ;再加 500μL三氯甲烷 ∶异戊醇(体积比为 24 ∶ 1)混匀 ,13000g 离心 5 min~ 10 min,保留上清液 ;加入 1 mL异丙醇混匀 , -70℃下放置 1 h,或 -20℃过夜;13000g 离心 30min,可见 DNA沉淀;70%乙醇洗 DNA 沉淀 , 室温干燥 ; 用 30 μL~ 50 μL Tris-EDTA 缓 冲 液 溶 解 DNA,待用 。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　南、北美大豆猝死综合症病菌菌落图片和形态图

　　图 C. 1 北美大豆猝死综合症病菌在选择性培养基 PCNB上的菌落

　　图 C.2 北美大豆猝死综合症病菌在 PDA 上的菌落

　　说明 :

　　A — 细长的气生分生孢子梗上的分隔 、镰刀形分生孢子和足细胞 ;

　　B — 短的气生分生孢子梗上的无分隔 、短棒状分生孢子 ;

　　C, F — 分隔 、镰刀形到弯柱形具足细胞的分生孢子在分生孢子座的有分枝的分生孢子梗上 ; D — 分生孢子上形成的厚垣孢子 ;

　　E, H — 菌丝上形成的表面光滑至粗糙的 、顶生或间生的厚垣孢子 ;

　　G —PDA上的无分隔 、小卵形分生孢子 ;

　　标尺 :25 μm。

　　注 : 引 自 AokiT等 。

　　图 C.3 南美大豆猝死综合症病菌形态

　　说明 :

　　A — 细长的气生分生孢子梗上的分隔 、镰刀形分生孢子和足细胞 ;

　　B — 短的气生分生孢子梗上的微小 、无分隔 、短棒状分生孢子 ;

　　C — 密集有分枝的分生孢子座分生孢子梗上的瓶梗 ,产生的分隔 、镰刀形 、具足细胞的分生孢子 ;

　　D, I — 分生孢子上形成的厚垣孢子 ;

　　E, J — 菌丝上产生的表面光滑至粗糙的 、顶生或间生的厚垣孢子 ;

　　F — 分生孢子座的妇女生孢子梗上的瓶梗 ,产生的分隔 、镰刀形 、具足细胞的分生孢子和逗号型分生孢子 ; G —PDA上的无分隔 、小卵形分生孢子 ;

　　H —PDA上 0~ 1 隔膜逗号型分生孢子 ;标尺 :25 μm。

　　注 : 引 自 AokiT等 。

　　图 C.4 北美大豆猝死综合症病菌形态

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　南、北美大豆猝死综合症病菌及其近似种的形态比较

　　表 D. 1 南、北美大豆猝死综合症病菌及其近似种的形态比较

　　参 考 文 献

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