GB/T 31792-2015 向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31792—2015

　　向 日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofDiaporthehelianthiMuntanola-Cvetkovic

　　MihaljcevicetPetrov

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31792—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中国合格评定国家认可中心 、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :吴品珊 、杜洪忠 、蔡露敏 、张祥林 、严进 。

　　向 日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了向 日葵茎溃疡病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于向 日葵植株和种子中向 日葵茎溃疡病菌的检疫和鉴定 。

　　2 仪器和用具

　　2. 1 仪器

　　体视显微镜 、生物显微镜 、超净工作台 、光照培养箱 、电子天平(1/1 000 g) 、高压灭菌锅 、冰箱 、PCR扩增仪 、荧光 PCR扩增仪 、电泳仪 、凝胶成像仪 、高速冷冻离心机 、恒温水浴锅 。

　　2.2 用具

　　烧杯 、三角瓶 、量筒 、试管 、培养皿 、酒精灯 、镊子 、剪刀 、解剖刀 、接种针 、载玻片 、盖玻片 、塑料研杵 、移液器 、移液器吸头 、离心管 、液氮罐 、样品筛(10 目 ,φ1. 7 mm) 。

　　3 试剂和培养基

　　3. 1 试剂

　　葡萄糖 ,链霉素 ,乳酸 ,琼脂 ,1. 0%次氯酸钠(NaClO) ,液氮 ,Tris-HCl,MgCl2 , HCl,EDTA,NaOH , NaOAc,KCl,Tris,CTAB,TAE,无水乙醇(Ethanol) ,三氯甲烷(Chloroform) ,异丙醇(Isopropanol) ,异戊醇(Isoamylalcohol) ,SYBR Green Ⅰ 核酸染料 ,蛋白酶 K,Taq DNA 聚合酶 ,dNTP,通用引物 ITS5和 ITS4,实时荧光 PCR特异性引物 DH-F、DH-R及探针 DH-Pr。

　　3.2 培养基

　　马铃薯葡萄糖琼 脂 培 养 基(PDA) , 链 霉 素 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基(SPDA) 。 具 体 配 方 参 见 附录 A。

　　4 检疫鉴定方法

　　4. 1 症状检查

　　采集田间疑似症状的茎杆 、病叶或葵盘 ,剪取病健交界处的组织材料备用 。病害典型的症状是茎杆和叶柄处有淡褐色溃疡病斑 ,详见附录 A病害症状描述 。

　　在种子中挑选干瘪 、变色 、皱缩 、残缺或霉变的种子 , 同时挑选其中夹带的向 日葵残体 , 如叶柄 、茎杆 、花盘碎片等 。

　　4.2 分离培养

　　将有疑似症状的叶片 、叶柄 、茎杆 、花盘碎片等样品在病健交界处剪取 5 mm~ 10 mm 的小块 ,用

　　GB/T 31792—2015

　　1%次氯酸钠表面消毒 5 min~ 10 min, 灭 菌 水 冲 洗 3 次 , 用 灭 菌 滤 纸 将 水 吸 干 后 , 置 于 含 链 霉 素 的SPDA培养基平皿中 ,25 ℃ 、8 h光照/16h黑暗条件下培养 ,3 d~ 5 d后开始观察 。

　　将种子样品用 1%次氯酸钠表面消毒 5 min~ 10min,灭菌水冲洗 3 次 ,保持无菌状态 ,在室温25 ℃下放置 24h,再在 -20℃下冷冻 24h,然后转至含链霉素的 SPDA培养基平皿中 ,25 ℃ 、8 h光照/16h黑暗条件下培养 ,3 d~ 5 d后开始观察 。

　　有种衣剂的种子 ,先将种衣剂洗掉(参见附录 A) ,再进行上述操作 。

　　4.3 生物学鉴定

　　如在 SPDA培养基上观察到真菌菌落 ,转接到 PDA培养基平皿上纯化培养 , 5 d~ 7 d后开始观察记录病菌的培养性状 ,显微镜下观察记录分生孢子和分生孢子器的形态和大小 。

　　4.4 分子生物学检测

　　4.4. 1 DNA提取

　　收集分离到的真菌菌丝 ,采用 CTAB方法提取 DNA(参见附录 B) 。

　　4.4.2 实时荧光 PCR检测

　　实 时 荧 光 PCR 引 物 序 列 为 DH-F: 5'-CGCTTATCTCTTACACCAAAACCCT-3', DH-R: 5'-GCAGCTATTGAAACAGCTCATCTG-3', TaqMan 探 针 DH-Pr: 5'-FAM-ATGCACCCACCGCA CTCCTGC-BHQ-1-3'。探针 5'端标记的荧光报告基团为 FAM ,3'端标记的荧光猝灭基团为 BHQ-1。

　　反应体系(25μL) :样品 DNA 1 μL, 10×PCR缓冲液 2. 5 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 2. 5 mmol/L dNTPs2 μL,10 μmol/L Primers各 1 μL, 10 μmol/L 探针 DH-Pr1. 5 μL, 5 U/μLTaq DNA 聚合酶0. 3 μL,ddH2 O 13. 7 μL。 以无菌双蒸水作空白对照 , 阳性对照以向 日葵茎溃疡病菌 DNA 为模板 , 阴性对照以向 日葵上其他真菌 DNA 为模板 。

　　反应循环为 :94 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s、56 ℃ 60 s,40个循环 。

　　4.4.3 ITS基因检测和序列比对

　　可以选择利用真菌通用引物 PCR扩增后测序比对的分子方法 。

　　可利 用 真 菌 通 用 引 物 ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') 和 ITS4(5'-TCCTC- CGCTTATTGATATGC-3')进行扩增 。

　　25μL反应体系(25 μL) : 样 品 DNA 1 μL(1 ng~ 50 ng) , 10× PCR 缓 冲 液 2. 5 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 2. 5 mmol/L dNTPs 2 μL, 10 μmol/L Primers 各 0. 5 μL, 5 U/μL Taq DNA 聚 合 酶0. 2 μL,ddH2 O 16. 3 μL。 同时设置阴性对照 , 以 Tris-EDTA缓冲液代替 DNA样品 。

　　PCR反应条件为 :94 ℃ 4 min;95 ℃ 1 min 、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,35个循环 ; 72 ℃ 10 min;4 ℃保存 。

　　PCR产物的检测在 1×TAE 电泳缓冲液中 ,1. 5%琼脂糖(含 SYBR Green Ⅰ 核酸染料)凝胶电泳 , 5 V/cm ,凝胶成像仪分析结果 。如有 500 bp左右大小的条带出现 ,将扩增产物进行序列测定 。

　　将测序后的序列与 NCBI网站 GenBank 中公开发表的 Diaporthehelianthi的序列 进 行 BLAST分析 。

　　5 鉴定特征

　　5. 1 培养性状

　　向 日葵茎溃疡病菌在 PDA培养基上生长 , 菌落初期为白色 , 菌丝体较密集 , 两周后渐渐变为褐色

　　至深褐色 ,其间形成暗褐色分生孢子器 ,菌落形态图参见附录 C。

　　5.2 病菌形态

　　向 日葵茎溃疡病菌的菌丝分隔 ,分生孢子器聚生或散生 ,浅褐色 、褐色至黑色 ,球形或扁球形 ,直径120 μm~450 μm ,含有 α 和 β 两 种 类 型 的 分 生 孢 子 。 α 分 生 孢 子 无 色 、单 胞 , 纺 锤 形 或 椭 圆 形 , 常 有2个 ~4个油滴 ,大小为(8μm~ 21 μm) × (1. 7 μm~ 5. 5 μm) ;β分生孢子无色 、单胞 ,丝状线形 ,一端常为钩状 ,无油球 ,大小(16μm~42 μm) × (0. 5 μm~ 6. 9 μm) 。

　　病菌在 植 物 残 体 上 形 成 有 性 器 官 。 子 囊 壳 直 径 350 μm ~ 450 μm , 有 喙 状 突 起 长 350 μm ~ 600 μm;子囊无色 ,大小(44μm~ 67μm) × (7. 5 μm~ 12. 5 μm) ,含 8个子囊孢子 ;子囊孢子双胞 、无色 、椭圆形 ,大小(12. 5 μm~ 19μm) × (2. 8 μm~ 7. 5 μm) 。

　　向 日葵茎溃疡病菌的 α 型分生孢子 、β 型分生孢子的形态图参见附录 C。

　　5.3 实时荧光 PCR检测

　　在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 :

　　—Ct值小于或等于 36,判定阳性 ;

　　—Ct值大于或等于 40,判定阴性 ;

　　—Ct值在 36~40之间 ,应重做实时荧光 PCR,再次扩增后如 Ct值小于或等于 36,或者 Ct值大于或等于 40,判定同上 。

　　5.4 ITS序列比对

　　经 BLAST分析 ,PCR 扩增到的 ITS基因序列与 NCBI网站 GenBank 中登录号为 FJ841862. 1 的Diaporthehelianthi的序列同源性为 99% ~ 100% ,则判定为阳性 。

　　6 结果判定

　　病菌的培养性状和形态特征与 5. 1 和 5. 2 的描述一致 ,且实时荧光 PCR检测结果呈阳性 ,或ITS序列比对 99% ~ 100%同源 ,可判定为向 日葵茎溃疡病菌 。

　　7 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出向 日葵茎溃疡病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中 , 以备复核 。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　8 菌株保存与处理

　　从检测样品中分离并鉴定为向 日葵茎溃疡病菌的菌株 ,应妥善保存 。将菌株接种于 PDA 培养基斜面上 ,20 ℃培养 5 d,4 ℃ ~ 8 ℃黑暗条件下保存 ,定期(60d) 转接 , 至少保存 6 个月 。必要时用病菌的分生孢子作冻干菌种保存 。保存期满后高压灭菌灭活处理 。

　　9 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并要有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　向 日葵茎溃疡病菌的其他信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 病菌基本信息

　　英文名 :stem canker of sunflower,stalk rotof sunflower

　　学名 :DiaporthehelianthiMuntanola-Cvetkovic MihaljcevicetPetrov

　　无性态 :Phomopsishelianthi

　　分类 地 位 : 真 菌 界 (Fungi) , 子 囊 菌 门 (Ascomycota) , 粪 壳 菌 纲 (Sordariomycetes) , 间 座 壳 目(Diaporthales) , 间座壳科(Diaporthaceae) 。

　　传播途径 : 向 日葵茎溃疡病菌近距离传播主要是病菌孢子借助雨水飞溅 、病残体以及农事操作工具传播 ,远距离传播主要通过种子和种子中夹带的病残体传播 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据向 日葵茎溃疡病菌的菌落性状 、形态学特征和目标片段的序列特征为鉴定依据 。

　　A.2 寄主范围

　　向 日葵(Helianthusannuus) 。

　　A.3 病害症状

　　茎杆和叶柄结合处枯黄色至淡褐色大型病斑 ,病斑可溃疡 ,边缘呈日烧状 ;发病严重时 ,病斑逐步扩展并包围茎杆 ,导致茎杆上部干枯 ,易折断 ,茎杆和叶柄的髓部腐烂坏死 。 叶片病斑棕色或褐色 ,可整叶萎蔫 、干枯变黑 。花盘受害后发育不良 ,不能形成成熟的种子 ,或干枯败育 。发病严重时可导致整个植株死亡 。

　　注 : 引 自 M. Desanlis。

　　图 A. 1 向 日葵茎溃疡症状

　　A.4 地理分布

　　波黑 、克罗地亚 、塞尔维亚 、法国 、匈牙利 、意大利 、摩尔多瓦 、罗马尼亚 、俄罗斯 、斯洛伐克 、西班牙 、乌克兰 、巴基斯坦 、摩洛哥 、美国(明尼苏达州 、俄亥俄州 、德克萨斯州) 、墨西哥 、阿根廷和委内瑞拉 。

　　A.5 培养基

　　马铃薯葡萄糖培养基(PDA) :去皮马铃薯 200g,切碎 ,加适量蒸馏水煮沸 20min左右 ,双层纱布过滤 ,在滤汁中加入葡萄糖 20 g、琼脂 18 g,继续煮至琼脂完全溶化后 ,加蒸馏水补足 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　链霉素马铃薯葡萄糖培养基(SPDA) :去皮马铃薯 200 g,切碎 ,加适量蒸馏水煮沸 20 min左右 ,双层纱布过滤 ,在滤汁中加入葡萄糖 20 g、琼脂 18g,继续煮至琼脂完全溶化后 ,加蒸馏水补足 1000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。 当培养基冷却至 50 ℃左右时 ,无菌操作下加入 100 mg链霉素 ,并用 85%乳酸调节 pH 至 4. 5~ 5. 0,摇匀 ,倒皿 ,待平皿中的培养基凝固后备用 。

　　A.6 种衣剂洗涤方法

　　将种子放入样品筛(10 目或 ϕ1. 7 mm)中 ,然后将样品筛置于一个盛有灭菌水的小盆中浸泡 3 次 ~ 5 次 ,每一次浸泡 20 min~ 30 min,期间缓慢摇晃样品筛 3 次 ~ 5 次 , 以洗去向 日葵种子表面的种衣剂 。

　　附 录 B (资料性附录) DNA提取方法

　　刮取菌落上的菌丝体 ,将收集的菌丝放入 1. 5 mL浸在液氮里的离心管中 ,用塑料杵碾碎待用 。

　　离心管加入 300 μL~ 500 μLCTAB缓冲液(其中含 0. 1 g蛋白酶 K)混匀 ,65 ℃水浴 1 h;13000g离心 5 min~ 10min,保留上清液 ;加 500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 24 ∶ 1) 混匀 , 13 000 g 离心5 min~ 10 min, 保 留 上 清 液 ; 再 加 500 μL三 氯 甲 烷 ∶ 异 戊 醇(体 积 比 为 24 ∶ 1) 混 匀 , 13 000 g 离 心5 min~ 10 min,保留上清液 ;加入 1 mL异丙醇混匀 , -70 ℃下放置 1 h,或 -20℃过夜;13000g 离心30 min,可见 DNA沉淀;70%乙醇洗 DNA沉淀 ,室温干燥 ; 用 30 μL~ 50 μL Tris-EDTA 缓冲液溶解DNA,待用 。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　向 日葵茎溃疡病菌形态图

　　图 C. 1 向 日葵茎溃疡病菌在 PDA培养基上菌落形态图

　　图 C.2 向 日葵茎溃疡病菌 α 型分生孢子

　　图 C.3 向 日葵茎溃疡病菌 β型分生孢子

　　参 考 文 献

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