GB/T 31793-2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 010 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31793—2015

　　油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofLeptosphaeriamaculans (Fuckel) Ces.etDeNot.

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31793—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国上海出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :吴品珊 、易建平 、周国梁 、杜洪忠 。

　　油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于油菜和油菜茎基溃疡病菌其他十字花科寄主种子和植株中油菜茎基溃疡病菌的检疫和鉴定 。

　　2 仪器和用具

　　2. 1 仪器

　　电子天平(感量 0. 01 g) 、生物显微镜 、体视显微镜 、高速冷冻离心机 、纯水仪 、超净工作台 、高压灭菌锅 、制冰机 、PCR仪 、凝胶成像系统 、电泳仪 、实时荧光 PCR仪 、培养箱 、冰箱 。

　　2.2 用具

　　烧杯 、三角瓶 、量筒 、培养皿 、酒精灯 、镊子 、剪刀 、解剖刀 、接种针 、载玻片 、盖玻片 、研钵 、移液器 、移液器吸头 、离心管 、液氮罐 、孔径 2. 5 mm 和 1. 5 mm 的网筛 。

　　3 试剂和培养基

　　3. 1 试剂

　　1. 0%次氯酸钠(NaClO) ,琼脂粉 ,马铃薯 ,葡萄糖 ,乳酸 ,琼脂糖 ,无菌双蒸水 ,液氮 ,蛋白胨 ,磷酸二氢钾 ,硫酸镁 ,链霉素 ,新霉素 , 五氯硝基苯 ,氯四环素 ,利福平 ,Tris-HCl, MgCl2 , HCl,EDTA,NaOH , NaOAc,KCl,Tris,CTAB,TAE,无水乙醇(ethanol) ,苯酚(phenol) ,溴化乙锭(EB) ,三氯甲烷(chloro- form) ,异丙醇(isopropanol) ,异戊醇(isoamylalcohol) ,蛋白酶 K,Taq DNA 聚合酶 ,dNTP,DNA 相对分子质量标准物 ,PCR特异性引物和实时荧光 PCR特异性引物及探针 。

　　3.2 培养基

　　马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) ,酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基(APDA) 。具体配方参见附录 A。

　　4 检疫鉴定方法

　　4. 1 种子检测

　　未带有种衣剂的种子 ,解剖镜下挑取皱缩 、干瘪 、变色 、畸形 、残缺或有霉变的种子 1 g~ 2 g;带有种衣剂的种子 ,先用自来水浸泡洗去种衣剂 ,或用纱布包裹浸泡搓洗种子 , 自来水冲洗去种衣剂 ,待风干后挑取异常种子 ,做分离培养 。

　　商用油菜籽样品取 1 kg,用孔径 2. 5 mm 和 1. 5 mm 的网筛过筛 ,孔径 2. 5 mm 筛上物多为豆荚和茎等植株残体 ,孔径 1. 5 mm 筛下物多为碎屑和细小油菜籽 。筛上物和筛下物混匀后 , 取 1 g~ 2 g 制样 ,进行 PCR初检 ,初检如果阳性 ,再挑取异常种子做分离培养 。

　　GB/T 31793—2015

　　4.2 植株症状检查

　　检查植物的根 、茎和叶片等部位 ,对茎部溃疡黑斑 、根部变色黑腐 、叶上有灰色斑点的植物 ,取样送实验室做进一步检验 。油菜茎基溃疡病菌为害症状参见附录 A。

　　4.3 分离培养

　　种子样品用无菌水室温浸泡 0. 5 h~ 1 h;无菌水洗涤 3 次后加入无菌水浸泡 ,置于 20 ℃ ~ 25 ℃培养 1 d;无菌水洗涤 3 次后转入 -20℃下冷冻处理过夜;1%次氯酸钠消毒 10min,无菌水 3 次洗涤后置于 APDA培养基上 ,30粒/皿 ~40粒/皿;20℃下黑暗培养 10 d。

　　取可疑症状的根 、茎 、叶的病健交界处 ,剪成 5 mm×5 mm 小块 ,1%的次氯酸钠溶液消毒 5 min,无菌水冲洗 3 次 , 吸干水分 ,置 APDA培养基上 ,20 ℃下黑暗培养 10 d。

　　4.4 形态学鉴定

　　在 APD培养基上 ,从第 3 天开始观察分离样品周围是否有菌丝产生 ,挑出菌丝转接到 PDA培养基上 ,20 ℃下黑暗纯化培养 , 5 d~ 7 d后开始观察记录病菌的培养性状 ,显微镜下观察记录分生孢子和分生孢子器的形态和大小 。

　　4.5 分子生物学鉴定

　　4.5. 1 DNA提取

　　将制备的商用油菜籽初检样品用液氮研磨后 ,取样 0. 1 g~0. 2 g,采用 CTAB方法提取 DNA(参见附录 B) 。

　　将分离到的真菌菌丝收集 ,放入 1. 5 mL浸在液氮里的离心管中 ,用塑料杵碾碎 ,采用 CTAB方法提取 DNA(参见附录 B) 。

　　4.5.2 PCR检测

　　常规 PCR 方 法 一 : 特 异 性 引物 Lm3(5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3') 和 Lm4(5'-AG GCGAGTCCCAAGTGGAACA-3') 。PCR反应总体积为 30 μL,包含 10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl(pH 8. 3) , 2. 5 mmol/L MgCl2 , dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为 100 μmol/L, 引物浓度 各 为100 nmol/L,2 μL模板 DNA,1. 5 UTaq DNA 聚合酶 。反应循环程序为 :94℃ 3 min;94℃ 30 s,67℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环 ;最后 72 ℃ 5 min。取 10 μL扩增产物与 3 μL的 6×上样缓冲液混匀 ,在1. 5% 琼脂糖凝胶 1×TAE缓冲液中 ,4 V/cm~ 6 V/cm 电泳 30min,溴化乙锭(EB)染色后在成像系统中成像分析 。

　　常规 PCR 方 法 二 : 特 异 性 引 物 LmacF(5'-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3') 和 LmacR (5'-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3') 。PCR 反应总体积为 30 μL,包含 10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/LKCl(pH8. 3) ,2. 5 mmol/LMgCl2 ,dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为 100 μmol/L,引物浓度各为 100 nmol/L,2 μL模板 DNA,1. 5 U Taq DNA 聚合酶 。反应循环程序为 :94 ℃ 3 min;94℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35个循环 ;最后 72 ℃ 5 min。取 10μL扩增产物与 3 μL的 6×上样缓冲液混匀 ,在 1. 5%琼脂糖凝胶 1×TAE缓冲液中 ,4 V/cm~ 6 V/cm 电泳 30 min,溴化乙锭(EB) 染色后在成像系统中成像分析 。

　　套式 PCR:第一 轮 扩 增 引 物 Lm2(5'-TCAGTGGCGGCAGTCTACTT-3') 和 Lm6(5'-GCCGGCT GCCAATTGTTTCA-3') , 第二轮扩增引物 Lm3(5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3')和 Lm4(5'-

　　AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3') 。 PCR 反 应 总 体 积 为 30 μL, 包 含 10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/LKCl(pH 8. 3) ,1. 5 mmol/LMgCl2 ,dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为 100μmol/L,引物浓度各为 100 nmol/L,模板 DNA 为 2 μL, 1. 5 U Taq DNA 聚 合 酶 。 反 应 循 环 程 序 为 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s,67 ℃(引物 Lm2/6为 60 ℃) 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环(引物 Lm2/Lm6第一轮扩增 25个循环) ;最后 72℃ 5 min。第一轮扩增产物 1 μL用作第二轮扩增的模板 。取 10μL扩增产物与 3 μL的6×上样缓冲液混匀 ,在 1. 5%琼脂糖凝胶 1×TAE缓冲液中 ,4 V/cm~ 6 V/cm 电泳 30 min,溴化乙锭(EB)染色后在成像系统中成像分析 。

　　实 时 荧 光 PCR: 引 物 Lm3 (5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3')/R2(5'-GGCGCAAAAT GTGCTGCGCT-3') , 探 针 Probe-M (5'-FAM-CACTTGGGACTCGC-MGB-3') 。 PCR 反 应 体 系 为25μL, 包括 12. 5 μL2×Premix ExTaq、上下游引物(5μmol/L)和探针(5μmol/L)各 1 μL、2 μL模板DNA、0. 5 μL 50×ROX Reference DyeⅡ ,加无菌水补至 25 μL。 反应程序为 : 95 ℃ 10 s; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min,40个循环 。

　　5 鉴定特征

　　5. 1 病菌形态

　　初生菌丝无色 ,有分隔 ;菌丝呈白色放射状 ,初期可见结节状菌丝结 ,后期菌丝结形成黑色至褐色分生孢子器 ;分生孢子器球形至扁球形 , 褐色至深黑褐色 , 散生 、埋生或半埋生于菌丝中 , 直径 100 μm~ 400μm ,顶部具孔 口 ,周围有浅粉色 、红色或紫色的黏性分生孢子团溢出 , 内含大量的分生孢子 ;分生孢子无色透明 ,椭圆形至纺锤形 , 内含 2个油球 ,孢子大小(3. 3 μm~ 6. 1 μm) × (1. 4 μm~ 2. 4 μm) 。

　　假囊壳在感病的木质化部位上产生 ,黑色 ,球形 ,埋生或爆裂 ,具孔 口 ,直径 360 μm~ 500 μm;子囊棍棒形到圆柱形 ,双层壁 ,大小(70 μm~ 120 μm) × (10 μm~ 17 μm) , 内含 8 个双列的子囊孢子 ;子囊孢子长椭圆形 ,黄褐色 ,具 5个隔膜 ,大小(30 μm~ 70 μm) × (4 μm~ 9 μm) 。人工培养条件下未见有性型的形成 。

　　病菌形态图参见附录 C 中图 C. 1,与其近似种的形态比较参见附录 D 中表 D. 1。

　　5.2 PCR检测

　　如常规 PCR 引物 Lm3/Lm4扩增产物为 279bp,或引物 LmacF/LmacR 扩增产物为 331 bp,视为油菜茎基溃疡病菌阳性 。

　　如套式 PCR 引物 Lm2/Lm6和 Lm3/Lm4扩增产物为 279bp,视为油菜茎基溃疡病菌阳性 。

　　实时荧光 PCR检测 ,在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 :

　　—Ct值小于或等于 36,判定油菜茎基溃疡病菌阳性 ;

　　—Ct值大于或等于 40,判定油菜茎基溃疡病菌阴性 ;

　　—Ct值在 36~40之间 ,应重做实时荧光 PCR,再次扩增后如 Ct值小于或等于 36,或者 Ct值大于或等于 40,判定同上 。

　　6 结果判定

　　分离菌形态特征与 5. 1 描述一致 ,且常规 PCR、套式 PCR 或实时荧光 PCR 检测为阳性 , 可判定为油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculans) 。

　　7 材料保存与处理

　　7. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出油菜茎基溃疡病菌的样品应保存于 4 ℃冰箱中 , 以备复核 。样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。

　　7.2 菌株保存与处理

　　分离鉴定的菌株应妥善保存 ,菌株在 PDA平板培养后可于 4 ℃冰箱保存 ,每 90 d定期继代 ,或将带有菌丝的培养基块转入 30%灭菌甘油中于 -80℃保存 。保存期满后高压灭菌处理 。

　　7.3 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法和结果等 ,并有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　油菜茎基溃疡病菌相关信息

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 病菌基本信息

　　英文名 : Crucifers stem canker, Crucifers black leg, Phoma leaf spot, Crucifers canker, Crucifers dry rot,Blackleg of cabbage

　　学名 :Leptosphaeriamaculans (Fuckel) Ces. etDe Not.

　　无性态 :Phoma lingam(Tode)Desm.

　　分类地位 : 真 菌 界 (Fungi) , 子 囊 菌 门 (Ascomycota) , 座 囊 菌 纲 (Dothideomycetes) , 格 孢 腔 菌 目(Pleosporales) ,小球腔菌科(Leptosphaeriaceae) ,小球腔菌属(Leptosphaeria) 。

　　传播途径 :病菌以子囊壳和菌丝体在病残株中越夏和越冬 。菌丝体在土中可存活 2 年 ~ 3 年 ,在种子内可存活 3 年 ,子囊壳在残株中可存活 5 年以上 。病菌分生孢子可借风雨作短距离传播 ,病残体和带菌种子是远距离传播的主要方式 。

　　近似种 :与油菜茎基溃疡病菌形态上较为近似的种类为油菜黑胫病菌(Leptosphaeriabiglobosa) 。

　　A. 1.2 方法原理

　　根据油菜茎基溃疡病菌为害症状 、病菌形态学特征 、PCR反应目标片段的特征为鉴定依据 。

　　A.2 基本情况

　　油菜茎基溃疡病也称十字花科蔬菜黑胫病 ,主要为害油菜等十字花科作物 ,其致病力强 ,可引起产量损失 10% ~ 20% , 我 国 多 次 在 加 拿 大 和 澳 大 利 亚 进 口 的 榨 油 用 油 菜 籽 上 截 获 过 该 菌 。 其 近 似 种Leptosphaeriabiglobosa(我国有分布)也在油菜等十字花科作物上引起茎秆部位的变黑 ,称油菜黑胫病(black leg) ,但其致病力较弱 ,一般为害植株茎的中上部 。

　　A.3 寄主范围

　　主要寄主是油菜以及其他十字花科蔬菜 ,包括芸苔属(Brassica) 的一些种 , 例如油菜(B. campes- tris) 、大白菜(B. rapa subsp. pekinensis) 、榨菜(B. juncea var. tumida) 、芜菁甘蓝(B. napus var. na- pus) 、黑芥(B. nigra) 、甘 蓝(B. oleracea) 、花 椰 菜(B. oleracea var.botrytis) 、结 球 甘 蓝(B. oleracea var.capitata) 、芜菁(B. campestris) ;野生寄主有葱芥(Alliaria petiolata) , 菊科(Asteraceae) ,龙胆 目(Gentianales) ,屈曲花属(Iberis) ,香雪球(Lobularia maritima) ,紫罗兰属(Matthiola) ,柳叶菜科(On- agraceae) ,萝 卜属(Raphanus) ,野芥(Sinapisarvensis)和菥蓂(Thlaspiarvense) 。

　　A.4 病害症状

　　病菌对幼苗和成株都引起为害 , 主要症状是叶部损坏 、变色 ,茎部溃疡 。受害的茎 、叶上有灰色斑

　　点 ,茎基部有凹陷的溃疡斑 ,上有黑色小点 ,根部病斑长条形 ,易腐朽 。发病严重时 ,茎溃疡环绕茎基部导致茎部变弱 、植株倒伏 ,甚至死亡 。油菜茎基溃疡病症状参见图 A. 1。

　　说明 :

　　a — 子叶接种症状(标尺= 2 mm) ;

　　b — 叶片症状 ;

　　c,d— 茎基部症状 。

　　图 A. 1 油菜茎基溃疡病症状

　　A.5 分布

　　中国无分布 ,广泛分布亚洲 、非洲 、美洲 、欧洲和大洋洲等地 。

　　欧洲 :奥地利 、比利时 、保加利亚 、捷克 、丹麦 、爱沙尼亚 、芬兰 、法国 、德国 、匈牙利 、爱尔兰 、意大利 、拉脱维亚 、立陶宛 、马耳他 、荷兰 、挪威 、波兰 、葡萄牙 、罗马尼亚 、俄罗斯 、斯洛伐克 、西班牙 、瑞典 、瑞士 、乌克兰 、英国 。

　　亚洲 :亚美尼亚 、印度 、伊朗 、以色列 、日本 、哈萨克斯坦 、韩国 、朝鲜 、吉尔吉斯斯坦 、巴基斯坦 、马来西亚 、菲律宾 、泰国 、土耳其 。

　　非洲 :埃及 、埃塞俄比亚 、肯尼亚 、莫桑比克 、尼 日利亚 、赞比亚 、津巴布韦 、南非 。

　　美洲 :美国 、加拿大 、墨西哥 、哥斯达黎加 、萨尔瓦多 、巴拿马 、波多黎各 、阿根廷 、巴西 。

　　大洋洲 :澳大利亚 、新西兰 、新喀里多尼亚 、巴布亚新几内亚 。

　　A.6 培养基

　　马铃薯葡萄糖培养基(PDA) :去皮马铃薯 200g,切碎 ,加适量蒸馏水煮沸 20min左右 ,双层纱布过滤 ,在滤汁中加入葡萄糖 20 g、琼脂 18 g,继续煮至琼脂完全溶化后 ,加蒸馏水补足 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基(APDA) :去皮马铃薯 200 g,切碎 ,加适量蒸馏水煮沸 20 min左右 ,双层纱布过滤 ,在 滤 汁 中 加 入 葡 萄 糖 20 g、琼 脂 18 g, 继 续 煮 至 琼 脂 完 全 溶 化 后 , 加 蒸 馏 水 补 足1 000 mL, 121 ℃高 压 灭 菌 20 min。 培 养 基 冷 却 至 50 ℃左 右 时 , 无 菌 操 作 条 件 下 , 加 入 85%乳 酸0. 6 mL, 摇匀 ,倒皿备用 。

　　附 录 B (资料性附录) DNA提取方法

　　离心管加入 300 μL~ 500 μLCTAB缓冲液(其中含 0. 1 g蛋白酶 K)混匀 ,65 ℃水浴 1 h; 13 000g离心 5 min~ 10 min,保留上清液 ;加 500 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 24 ∶ 1) 混匀 , 13 000g离心5 min~ 10 min, 保留上清液 ; 再 加 500 μL三 氯 甲 烷 ∶ 异 戊 醇(体 积 比 为 24 ∶ 1) 混 匀 , 13 000g 离 心5 min~ 10 min, 保留上清液 ;加入 1 mL异丙醇混匀 , -70 ℃下放置 1 h,或 -20℃过夜;13000g离心30 min, 可见 DNA沉淀;70%乙醇洗 DNA沉淀 ,室温干燥 ;用 30 μL~ 50 μL Tris-EDTA 缓冲液溶解DNA,待用 。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　菌落培养性状和病菌形态特征图

　　说明 :

　　a— 菌落形态 ;

　　b— 菌落和分生孢子器(标尺= 1 mm) ;

　　c— 分生孢子器及分生孢子团(标尺= 100 μm) ;

　　d— 分生孢子(标尺= 10 μm) 。

　　图 C. 1 菌落培养性状和病菌形态特征图

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　Leptosphaeriamaculans与其近似种L.biglobosa的形态比较

　　表 D. 1 Leptosphaeriamaculans与其近似种L. biglobosa的形态比较

　　参 考 文 献

　　[1] 周国梁 , 尚琳琳 ,林泓 ,等 . 油菜茎基溃疡病菌的实时荧光 PCR 检测[J] . 植物病理学报 ,2011, 41(1) :10-17.

　　[2] FittB B H , BarbettiM , etal. World-wide importance of phoma stem canker (Leptospha- eriamaculansandL. biglobosa) on oilseed rape(Brassicanapus)[J] . European JournalofPlantPa- thology, 2006, 114:3-15.

　　[3] LiuS Y, Liu Z, FittB DL, etal. ResistancetoLeptosphaeriamaculans (phomastem can- ker) in Brassicanapus (oilseed rape) induced byL. biglobosa and chemicaldefenseactivatorsinfield and controlled environments[J] . PlantPathology, 2006, 55:401-412.

　　[4] Taylor J L. A simple, sensitive, and rapid method for detecting seed contaminated with highly virulentLeptosphaeriamaculans[J] . Applied and EnvironmentalMicrobiology, 1993, 59(11) : 3681-3685.

　　[5] WestJS, Kharbanda P D, BarbettiM J, et al. Epidemiology and management of Lepto- sphaeria maculans (Phoma stem. canker) on oilseed rapein Australia, Canada and Europe[J] . Plant Pathology, 2001, 50:10-27.

　　[6] Zhou Y, FittB DL, Welham SJ, etal. Effectsofseverityand timing ofstem canker(Lep- tosphaeriamaculans) symptoms on yield ofwinter oilseed rape (Brassicanapus) in the UK[J] . Eu- ropean JournalofPlantPathology, 1999, 105:715-728.