GB/T 40174-2021 工具酶纯度的检测方法

　　ICS 07 . 080 CCS C 27

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40174—2021

　　工具酶纯度的检测方法

　　puritydetectionmethodofreagentenzymes

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40174—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG 11)提出并归口 。

　　本文件起草单位：福建南生科技有限公司、夏禾(深圳)生物技术有限公司、苏州坤琪生物科技有限公司、上海鹰姿生命科技有限公司、雷谷(厦门)生物医药有限公司、福建华灿制药有限公司、厦门大学、安琪酵母股份有限公司、山东大学、北京化工大学、复旦大学、中国科学院微生物研究所、深圳华因康基因科技有限公司。

　　本文件主要起草人：黄发灿、詹学雄、郑登忠、赵晶、朱力、钟江、张永有、姚鹃、陈秀兰、陈劲春、刘文军、郭延巍。

　　GB/T 40174—202 1

　　工具酶纯度的检测方法

　　1 范围

　　本文件描述了工具酶纯度检测方法的术语和定义、原理、试剂或材料、仪器设备、样品制备、试验步骤、结果计算及质量控制。

　　本文件适用于工具酶纯度的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 YY/T 0087

　　分析实验室用水规格和试验方法电泳装置

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　工具酶纯度 purityofreagentenzymes

　　目标工具酶在样品总蛋白质或固含物中所占的质量百分比。

　　3.2

　　蛋白质含量 contentofprotein

　　样品经福林酚法测定出每毫克或每毫升样品中的蛋白质所占的质量。

　　3.3

　　固含物含量 contentofsolid

　　样品烘干后获得的无水固体物质在每毫克或每毫升样品中所占的质量。

　　4 原理

　　用牛血清白蛋白标准品作对照，对样品经十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶带进行扫面，再进行灰度值计算，获得样品中目标工具酶的质量，再采用福林酚法测定样品总蛋白质的质量或用炽灼残渣检查法测定样品固含物含量，从而计算出工具酶纯度。

　　5 试剂或材料

　　除非另有规定，所用的试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。

　　5 . 1 碱性铜溶液

　　称取氢氧化钠 10 g,碳酸钠 50 g,加水 400 mL使溶解，作为甲液;取酒石酸钾 0.5 g,加水 50 mL使

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　　溶解，另取硫酸铜 0.25 g,加水 30 mL使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，甲液、乙液按 50 ∶ 1(体积

　　比)混合。

　　5 . 2 福林酚溶液

　　称取钨酸钠 100 g、钼酸钠 25 g,加水 700 mL、85%磷酸 50 mL 与盐酸 100 mL,置磨 口圆底烧瓶中，缓缓加热回流 10 h,放冷，再加硫酸锂 150 g、水 50 mL 和溴数滴，加热煮沸 15 min,冷却，加水稀释至 1 000 mL,过滤，滤液作为贮备液，置棕色瓶中。临用前加一倍的水，摇匀，即得。

　　5 . 3 标准溶液的配制

　　准确称取牛血清白蛋白标准品适量，用合适的溶液溶解制成 1 mg/mL 的标准溶液。

　　5 . 4 30%丙烯酰胺溶液-0.8% N，N/-亚甲基双丙烯酰胺(Acr-Bis)溶液

　　取丙烯酰胺 30.0 g, Acr-Bis 0.8 g,溶于水，定容到 100 mL 。用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，储于棕色瓶，宜 4 ℃避光保存。

　　5 .5 0 .5 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-Hcl)缓冲液

　　称取三羟甲基氨基甲烷 6.05 g,加适量水使溶解，用盐酸调 pH 值至 6.8,加水定容至 100 mL,宜4 ℃ 保存。

　　5 . 6 1 . 5 mol/L 的 Tris-Hcl缓冲液

　　称取三羟甲基氨基甲烷 18.15 g,加适量水溶解，用盐酸调 pH 值至 8.8,加水定容至 100 mL,宜4 ℃

　　保存。

　　5 . 7 10%的 SDS溶液

　　称取 2.5 g SDS,加适量水溶解，定容至 25 mL,室温保存备用。

　　5 . 8 10%过硫酸铵溶液

　　称取 1.0 g 过硫酸铵，加适量水溶解，定容至 10 mL,宜现配现用。

　　5 . 9 样品缓冲液

　　称取三羟甲基氨基甲烷 0.152 g、溴酚蓝 1 mg、SDS 0.4 g,甘油 2 mL,用盐酸调 pH 值至 6.8,加水溶解并稀释至 10 mL。该缓冲液用于非还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。如用于还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加β-巯基乙醇 1 mL。

　　5 . 10 电泳缓冲液

　　称取三羟甲基氨基甲烷 3 g、甘氨酸 14.4 g、SDS 1.0 g,加适量水溶解，用盐酸调 pH 值至 8.3,加水稀释至 1 000 mL。

　　5 . 1 1 固定液

　　称取三氯醋酸 5 g,加水 200 mL溶解后，加甲醇 200 mL,再加水定容至 500 mL。

　　5 . 12 染色液

　　称取 1.0 g 考马斯亮蓝 R250,加入甲醇 200 mL、冰醋酸 50 mL,加水定容至 250 mL,混匀。

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　　5 . 13 脱色液

　　取甲醇 400 mL、冰醋酸 100 mL,加水定容至 1 000 mL,混匀。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 紫外-可见分光光度计。

　　6 . 2 电泳装置，应符合 YY/T 0087 的要求。

　　6 . 3 凝胶薄层扫描仪。

　　6.4 电子分析天平，分度值为 0.000 1 g。

　　7 样品制备

　　准确称取样品 W1(若样品为液体时，准确量取)，用合适的溶液溶解制成 1 mg/mL 的样品溶液，按照附录 A 的方法测得样品中蛋白质含量 cy 。

　　8 试验步骤

　　8 . 1 电泳

　　分别取样品 8 μL,标准溶液 2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL,加水至 20 μL,再加入 20 μL 的样品缓冲液，100 ℃煮沸 3 min,按照附录 B 的方法进行电泳。

　　8 . 2 扫描

　　取脱色好的胶片，置凝胶薄层扫描仪中，分别对样品和牛血清白蛋白电泳胶带进行扫描。

　　8 . 3 标准曲线的绘制

　　用软件计算牛血清、白蛋白电泳胶带灰度值，以灰度值为横坐标，蛋白质含量为纵坐标，绘制标准曲线，见公式(1) :

　　W=bH+a …………………………( 1 )

　　式中：

　　W — 蛋白质的质量，单位为毫克(mg) ;

　　H — 灰度值;

　　a — 截距;

　　b — 斜率。

　　9 结果计算

　　9 . 1 样品中目标工具酶质量的计算

　　用软件计算样品中 目标工具酶电泳胶带的灰度值，代入公式(1) ,计算出上样样品中 目标工具酶的质量(W2) 。样品中 目标工具酶质量按公式(2)计算：

　　W3 =W2 × F …………………………( 2 )

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　　式中：

　　犠3 — 样品中 目标工具酶的质量，单位为毫克(mg) ;

　　犠2 — 上样样品中 目标工具酶的质量，单位为毫克(mg) ;

　　犉 — 稀释倍数。

　　9 . 2 样品总蛋白质中工具酶纯度的计算

　　样品总蛋白质中工具酶纯度按公式(3)计算：

　　犆p =犠1 犆y × 100% …………………………( 3 )

　　式中：

　　犆p — 样品总蛋白质中工具酶纯度;

　　犠3 — 样品中 目标工具酶的质量，单位为毫克(mg) ;

　　犠1 — 样品质量或体积，单位为毫克(mg)或毫升(mL) ;

　　犆y — 样品中的蛋白质含量，单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL)。

　　9 . 3 样品固含物中工具酶纯度的计算

　　样品固含物中工具酶的纯度按公式(4)计算：

　　犆s =犠1 犆d × 100% …………………………( 4 )

　　式中：

　　犆s — 样品固含物中工具酶纯度;

　　犠3 — 样品中 目标工具酶的质量，单位为毫克(mg) ;

　　犠1 — 样品质量或体积，单位为毫克(mg)或毫升(mL) ;

　　犆d — 样品中的固含物含量，单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL)。

　　10 质量控制

　　在重复性条 件 下，获 得 的 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 大 于 这 两 个 测 定 值 的 算 数 平 均 值的 10% 。

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　福林酚法测定蛋白质含量

　　A.1 原理

　　依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与 Cu2+ 螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试

　　剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。 在一定范围内其颜色深浅与蛋白质的浓度呈正比，以蛋白质标准溶液作标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。

　　A.2 试验步骤

　　A.2 . 1 牛血清白蛋白标准溶液的配制

　　准确称取适量的牛血清白蛋白标准品，加水溶解并制成 0.2 mg/mL 的标准溶液。

　　A.2 . 2 标准曲线的绘制

　　准确量取标准溶液 0 . 0 mL、0 . 2 mL、0 . 4 mL、0 . 6 mL、0 . 8 mL、1 . 0 mL,分别置于具塞试管中，加水至 1 .0 mL,再分别加入碱性铜溶液(5 .1 ) 1 .0 mL,摇匀，室温放置 10 min 后，分别加入福林酚溶液(5 .2)

　　4.0 mL,立即混匀，室温放置 30 min后，在 650 nm 的波长处测定吸光度。以标准溶液浓度与其相对应

　　的吸光度绘制标准曲线，回归方程见公式(A. 1) :

　　C=bX+a …………………………( A.1 )

　　式中：

　　C — 蛋白质含量，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　X — 在 650 nm 的波长处测定吸光值;

　　a — 截距;

　　b — 斜率。

　　A.2 . 3 样品测定

　　将第 7 章中制备得到的样品溶液用水稀释为 0.1 mg/mL 的试样溶液，准确量取试样溶液适量，按

　　A. 2 . 2 的操作进行测定。 从标准曲线计算出每毫升测定样品溶液中的蛋白质含量。

　　A.3 结果计算

　　按照 A. 2 . 3 测出样品溶液的吸光值，再将吸光值代入公式(A. 1) ,计算出每毫升测定样品溶液中的

　　蛋白质含量(C1)。样品中的蛋白质含量(Cy ) ,按公式(A.2)计算：

　　C …………………………( A.2 )

　　式中：

　　Cy — 样品中的蛋白质含量，单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL) ;

　　C1 — 每毫升测定样品溶液中的蛋白质含量，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　V — 测定样品溶液的体积，单位为毫升(mL) ;

　　F — 稀释倍数;

　　W1 — 样品质量或体积，单位为毫克(mg)或毫升(mL)。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　B.1 原理

　　依据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂 SDS按质量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按相对分子质量大小进行分离。

　　B.2 试验步骤

　　B.2 . 1 分离胶溶液的制备

　　根据不同相对分子质量的需要，按表 B. 1 制成分离胶溶液，灌入模具内至一定髙加水封顶，室温下聚合。

　　表 B.1 分离胶和浓缩胶配制比例

　　B.2 . 2 浓缩胶溶液的制备

　　待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶溶液，配方见表 B. 1,插入样品梳，应避免出现气泡。

　　B.2 . 3 加样

　　待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将电泳缓冲液注满电泳槽前后槽，在加样孔中加入样品溶

　　液，样品溶液与标准溶液均不应超过 20 μL。

　　B.2 . 4 电泳

　　将正负电极与电泳仪连接好，开始电泳。 刚开始电泳时，将电压调至 80 V;当染料溴酚蓝进入分离

　　胶后，将电压调至 150 V~200 V。直到染料迁移至离分离胶底部 1.5 cm 时，停止电泳。

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　　B.2 . 5 固定、染色和脱色

　　电泳结束后，取出胶片(条)，置固定液中 30 min,取出胶片(条)，置染色液中染色 1 h~2 h,用脱色

　　液脱色至凝胶背景为透明。