GB/T 28073-2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28073—2011

　　南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofarabismosaicvirus

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28073—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271) 提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国福建出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :廖富荣 、于翠 、张永江 、陈红运 、林石明 、陈青 、黄蓬英 、沈建国 、吴媛 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28073—2011

　　南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法 。

　　本标准适用于植物种子 、鳞球茎 、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定 。

　　2 南芥菜花叶病毒基本信息

　　中文名 :南芥菜花叶病毒 。

　　英文名 :arabis mosaic virus。

　　异名 :arabis mosaicnepovirus;hop nettlehead virus(啤酒花荨麻病病毒) ;rhubarb mosaicvirus(大黄花叶病毒) ;raspberry yellow dwarf virus(悬钩子黄矮病毒) ;ash ring and line pattern viurs(白腊树环线状病毒) ;rhabarber-mosaik-virus(大 黄 花 叶 病 毒) ;forsythia yellow net virus(连 翘 黄 网 状 病 毒) ; jasmine yellow blotch virus(茉莉黄斑病毒) 。

　　英文缩写 :ArMV。

　　属豇豆花叶病毒科 Comoviridae,线虫传多面体病毒属 Nepovirus。

　　南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 、反转录和体外 DNA 扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 进行检测鉴定 。

　　4 主要仪器设备

　　本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备 :

　　微量榨汁机 、酶标仪 、洗板机 、微量天平(感量 :0. 001 g) 、PCR 仪 、荧光 PCR 仪 、电泳仪 、水平电泳槽 、凝胶成像仪 、高速冷冻台式离心机 、水浴槽、pH 计等和各种量程的可调移液器(1 000 μL、200 μL、 100 μL、20 μL、10μL、2 μL) 。

　　5 检测与鉴定

　　5. 1 DAS-ELISA检测

　　把 0. 5 g~ 1. 0 g样品充分研磨或在液氮中研磨 ,按 1 ∶ 10 比例加入样品提取缓冲液 ,转移到 5 mL离心管中 ,8 000 r/min离心 5 min,上清液作为 DAS-ELISA 的检测提取液 。

　　设置阴性对照 、阳性对照和空白对照 , 阴性对照的种类和材料(如 :种子或叶片) 应该尽量与所检测样品类型相一致 。具体操作过程见附录 B。

　　注 : 提取液在 3 h 内使用 ,否则保存在 4 ℃中 。

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　　5. 2 RT-PCR检测

　　分别提取检测 样 品 的 总 RNA, 然 后 用 RT-PCR 检 测 。 用 健 康 的 植 物 组 织 作 阴 性 对 照 , 用 感 染ArMV 的植物组织作阳性对照 ,用超纯水作空白对照 。

　　具体操作过程见附录 C。

　　5. 3 实时荧光 RT-PCR检测

　　分别提取检测样品的总 RNA,反转录合成 cDNA 后用实时荧光 PCR检测 。用健康的植物组织作阴性对照 ,用感染 ArMV 的植物组织作阳性对照 ,用超纯水作空白对照 。

　　具体操作过程见附录 D。

　　5. 4 序列测定

　　将 PCR产物回收后 ,进行克隆 、测序 ,或者直接测序 ,测序可由生物公司完成 。把测序所得到的核苷酸序列与已知的 ArMV相应序列进行比对 ,如果翻译后氨基酸序列与已知的 ArMV 相应序列同源性大于 75%则判定为 ArMV序列 ,小于 75% 则判定为非 ArMV序列 。

　　注: 序列比对可利用 NCBI网站上的 BLAST软件进行, 网址为 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/

　　6 结果判定与报告

　　6. 1 结果判定

　　当产生以下检测结果时 ,则判定为检出 ArMV:

　　— 当 DAS-ELISA检测 、RT-PCR检测 、实时荧光 RT-PCR 检测 ,其中有两种方法检测结果呈阳性时 , 判定为检出 ArMV;

　　— 当 RT-PCR检测结果呈阳性 ,测定的序列为 ArMV序列 ,则判定为检出 ArMV。

　　6. 2 结果记录与保存

　　记录各项实验数据 ,包括样品种类 、来源 ,检测时间 、地点 、方法和结果等 。血清学检测结果保存吸光值的数据报告 ,RT-PCR检测结果保存电泳照片 ,实时荧光 RT-PCR 检测结果保存采集的数据 ,序列测定结果保存测序报告图 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　南芥菜花叶病毒简介

　　A. 1 分布

　　欧洲 :奥地利 、白俄罗斯 、比利时 、保加利亚 、塞浦路斯 、捷克共和国 、丹麦 、芬兰 、法国 、德国 、匈牙利 、爱尔兰 、意大利 、拉脱维亚 、立陶宛 、卢森堡公国 、摩尔多瓦 、荷兰 、挪威 、波兰 、罗马尼亚 、俄罗斯 、斯洛伐克 、斯洛文尼亚 、瑞典 、瑞士 、英国 、乌克兰和南斯拉夫 。

　　亚洲 : 日本 、哈萨克斯坦 、土耳其 、伊朗 。

　　非洲 :南非 。

　　北美洲 :加拿大 、美国 。

　　大洋洲 :澳大利亚 、新西兰 。

　　A. 2 形态特征

　　该病毒属线虫传多面体病毒 ,病毒粒体为等轴对称二十面体 ,直径约 30 nm , 为双分体病毒 , 含有两条相对分子质量分别为 2. 4× 106 和 1. 4× 106 的单链 RNA。超速离心 后 分 为 T(53S) , M(93S) 和B(126S) 三个组分 。该病毒具有一个外壳蛋白 ,相对分子质量为 54kDa。

　　A. 3 寄主范围及症状

　　ArMV可侵染 174属 215种植物 。 主 要 为 害 的 作 物 有 大 麻(Cannabissativa) 、啤 酒 花(Humulus lupulus) 、黄瓜 (Cucumissativus) 、西 葫 芦 (Cucurbita pepo) 、莴 苣 (Lactuca sativa) 、草 莓 (Fragaia ananassa) 、葡 萄 (Vitis vinifera) 、香 石 竹 (Dianthuscaryophyllus) 、水 仙 (Narcissustazetta) 、蔷 薇(Rosamultiflora) 、草木樨(Melilotussuaveolens) 、郁金香(Tulipagesneriana) 、芹菜(Apium graveo- lens) 、薄荷(Menthasppiperita) 、丁香(Syringaoblata) 、大豆(Glycinemax) 、甜菜(Betavulgaris) 、马铃薯(Solanum tuberosm) 、烟草(Nicotianatabacum) 、番茄(Lycopericonesculentum) 、菜豆(Phaseolus vulgaris) 、豇 豆 (Vigna unguiculata) 、蚕 豆 (Viciafaba) 、豌 豆 (Pisum scatwum ) 、甜 瓜 (Cucumis melo) 、花 椰 菜 ( Brassica oleracea L. var. botrytis) 、菠 菜 (Spinacia oleracea) 、胡 萝 卜 ( Daucus carota) 等 。

　　ArMV 引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落 、植株矮化 、严重畸型 、耳突 。症状随着寄主植物 、病毒的分离物 、栽培条件 、季节和年份的不同而改变 。有时候 ArMV 的侵染是隐症的 ,并不会在寄主植物上表现症状 。

　　在鉴别寄主上产生的症状 :

　　a) 昆诺藜(Chenopodium quinoa) 和苋色藜(C. amaranticolor) 接种叶上形成褪绿的局部斑点 ,然后形成系统性斑驳 ;

　　b) 黄瓜(C. sativus) :接种的子叶上产生褪绿的局部斑点 , 以及系统性脉带或黄色斑点 ;

　　c) 菜豆(P. vulgaris) :产生坏死的局部枯斑 、系统性坏死和畸型 ;

　　d) 矮牵牛(Petuniahybrida) : 产 生 局 部 坏 死 斑 点 或 小 的 坏 死 环 和 系 统 性 环 斑 , 以 及 线 状 斑 或明脉 。

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　　然而 ,并不是所有株系能够产生这些明显区别的症状 , 如啤酒花株系(ArMV-H) 就不能产生这些明显的症状 。另外 ,ArMV经常与草莓潜隐环斑病毒(strawberry latent ringspot virus,SLRV) 等病毒混合侵染 ,从而产生更加复杂的症状 。 因此 , 使用鉴别寄主进行鉴定时 , 还需结合其他方 法 , 如 DAS- ELISA等 。

　　A. 4 传播途径

　　ArMV 主要通过汁液摩擦接种 ,种苗传播也很普遍 , 也可通过介体线虫传播 。

　　通过种子传播的寄 主 : 莴 苣(L. sativa) 、松 草 莓(F. ananassa) 、大 豆(G. max) 、甜 菜 (B. vulgaris var. saccharifera) 、番茄(L. esculentum) 等 。

　　通过块茎传播的寄主 :马铃薯(S. tuberosm) 等 。

　　通过鳞 球 茎 传 播 的 寄 主 : 水 仙 (N. tazetta) 、郁 金 香 (Tulipa gesneriana) 、百 合 (Lilium brownii var. colchesteri) 等 。

　　通过 苗 木 传 播 的 寄 主 : 葡 萄 (V. vinifera) 、草 莓 (F. ananassa) 、啤 酒 花 ( H. lupulus) 、香 石 竹(D. caryophyllus) 、蔷薇(R. multiflora) 等 。

　　传播介体主要为异尾剑线虫(Xiphinemadiversicaudatum) 。

　　A. 5 血清学特性

　　ArMV具有很强的免疫原性 ,提纯的病毒免疫兔子后 , 可以制备出高质量的抗血清 。 ArMV 抗血清与烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus, TRSV) 、番茄环斑病毒(tomato ringspot virus, ToRSV) 抗血清之间无交叉反应 ,与健康寄主和常见的自然寄主蛋白也无反应 。

　　A. 6 线虫传多面体病毒属区分种的标准

　　线虫传多面体病毒属区分种的标准是 :

　　a) 外壳蛋白(Coatprotein, CP) 的氨基酸序列同源性小于 75% ;

　　b) 聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于 75% ;

　　c) 在可能的成分间没有假重组 ;

　　d) 抗原反应有差异 ;

　　e) 不同的介体种类 。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　DAS-ELISA检测操作步骤

　　B. 1 DAS-ELISA所采用的试剂

　　B. 1. 1 包被缓冲液(pH9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮化钠(NaN3 ) 0. 20 g

　　加入 900 mL蒸馏水溶解 ,用 HCl调节 pH值到 9. 6,然后加水至 1 L。

　　B. 1. 2 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7. 4)

　　氯化钠 (NaCl) 8. 0 g

　　磷酸二氢钾 (KH2PO4 ) 0. 2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 1. 15 g

　　氯化钾(KCl) 0. 2 g

　　叠氮化钠 (NaN3 ) 0. 2 g

　　加入 900 mL蒸馏水溶解 ,用 NaOH 或 HCl调节 pH值到 7. 4,然后加水至 1 L。

　　B. 1. 3 PBST

　　每升 PBS中加入 0. 5 mL 的 Tween-20。

　　B. 1. 4 样品提取缓冲液(pH7. 4)

　　PBST+2% PVP (PVP-40聚乙烯基吡咯烷酮)

　　B. 1. 5 酶标抗体稀释缓冲液

　　PBST+2% PVP+0. 2%卵白蛋白 。

　　B. 1. 6 底物缓冲液

　　二乙醇胺 97 mL

　　蒸馏水 600 mL

　　叠氮化钠 (NaN3 ) 0. 2 g

　　用 HCl调整 pH 至 9. 8,然后加 H2 O 到 1 L。

　　注 : 缓冲液可以储存在 4 ℃ ~ 10 ℃中至少 2个月 ,使用前回温至室温 。

　　B. 2 操作步骤

　　B. 2. 1 包被

　　根据检测试剂盒说明 ,用包被缓冲液稀释 ArMV抗体(如 1 ∶ 200) ,在微孔板中每孔加入 100μL包

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　　被抗体溶液 。在室温下孵育 2 h~4 h或 4 ℃下包被过夜 。

　　B. 2. 2 捕获抗原

　　倒去孔中的抗体包被溶液 ,用 PBST洗 4次 ~ 5 次(可在洗板机上完成) 。加入 100 μL检测样品提取液到酶标板的孔中 ,每个样品至少 2个重复 。并设置阳性和阴性对照 。在室温下孵育 2 h 或 4 ℃下过夜 。

　　B. 2. 3 加入酶标抗体

　　根据试剂盒说明 ,用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如 1 ∶ 200) 。倒去孔中的检测样品提取液 ,用 PBST洗 4次 ~ 5 次孔(可在洗板机上完成) 。 每 孔 加 入 100 μL酶 标 抗 体 溶 液 。 在 室 温 下 孵 育2 h。

　　B. 2. 4 加底物

　　用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP) 配制 1 mg/mL 的底物溶液 。倒去酶标抗体溶液 ,用PBST洗 4次 ~ 5 次 或 在 洗 板 机 上 完 成 。 每 孔 加 入 100 μL新 鲜 配 制 的 底 物 溶 液 。 室 温 下 避 光 放 置30 min~ 60 min,至阳性对照孔明显显色 。

　　B. 2. 5 吸光值的测定

　　用酶标仪在 405 nm 处读取吸光值 。

　　B. 3 结果判定

　　通过酶标仪上 405 nm 的 OD值来判定 。

　　对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) 应该在质量控制范围内 , 即 :缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15, 当阴性对照孔的 OD405值<0. 05时 ,按 0. 05计算 。 阳性对照有明显的颜色反应 ;孔的重复性基本一致 。在满足了该要求后 ,结果判断如下 :

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显 >2,判为阳性 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显<2,判为阴性 ;

　　— 样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近 ,判为可疑样品,需重新做一次 ,或用其他方法加以验证 。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　RT-PCR检测操作步骤

　　C. 1 主要试剂

　　C. 1. 1 RNA提取试剂

　　TRIzolreagent、三氯甲烷 、异丙醇 、70%乙醇 。

　　C. 1. 2 反转录试剂

　　M-MLV反转录酶(200U/μL) 、5×反应缓冲液(250 mmol/LTris-HClpH8. 325 ℃、375 mmol/LKCl、 15 mmol/LMgCl2 、50 mmol/LDTT) 、dNTP混合液(各 10 mmol/L) 、RNase Inhibitor(40U/μL) 。

　　C. 1. 3 PCR试剂

　　10×PCR缓冲液(含 15 mmol/L的 Mg2+ ) 、TaqDNA 聚合酶 、dNTP混合液(各 10 mmol/L) 。

　　C. 2 引物序列

　　ArMV 的特异性引物及其序列见表 C. 1,位于 RNA2的 CP基因上 ,预计扩增产物大小为 370 bp。引物可由有关生物公司合成和纯化 。

　　表 C. 1 RT-PCR 的引物和序列

　　引物名称

　　引物序列

　　在 D10086a 上的位置

　　ArM1

　　5’-TTGGCAGCGGATTGGGAGTT-3’

　　1 120~ 1 139

　　ArM2

　　5’-ATTGGTTCCAGTTGTTAGTGAC-3’

　　1 468~ 1 489

　　注 : 也可以采用 ArMV其他特异性引物 。

　　a 在 GenBank上的基因序列登录号 。

　　C. 3 总 RNA 的提取

　　取 0. 05 g~0. 1 g检测样品,加入 1 mL TRIzol reagent充分研磨 ,室温放置 5 min; 12 000 g 离心5 min,取上清液到另一离心管中 ;加入三氯甲烷 200 μL,充分振荡 15 s,室温放置 3 min;12000g,4 ℃离心 15 min;取上层水相加入另一离心管中 ,加入 0. 5 mL异丙醇;12 000g,4 ℃ ,离心 10 min,弃去上清液 ;加入 1 mL 70%乙醇洗涤 ; RNA沉淀干燥后 ,加经过焦碳酸二乙酯(DEPC) 处理的超纯水 40 μL溶解即可 。

　　注 : 本方法是根据 TRIzolreagent方法提取总 RNA,在保 证 总 RNA 质 量 的 情 况 下 ,也 可 以 采 用 其 他 总 RNA 提 取方法 。

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　　C. 4 cDNA合成

　　在 3 μL的总 RNA 中加入 1 μL的 ArM2引物(10μmol/L) ,于 95 ℃的水浴中 7 min,然后迅速冰浴 5 min。继 续 加 入 5× RT 缓 冲 液 2. 5 μL、dNTP 混 合 物(10 mmol/L ) 0. 5 μL、M-MLV 反 转 录 酶(200U/μL)0. 5 μL、RNasin0. 5 μL、经 DEPC处理的 ddH2 O 4. 5 μL。然后 37 ℃水浴 1 h,95 ℃水浴10 min, 自然冷却至室温 , -20 ℃冰箱中保存 。

　　C. 5 PCR 扩增

　　以上述合成的 cDNA 为模板 ,进行 PCR 扩 增 。 在 PCR 的 薄 壁 管 中 分 别 加 入 以 下 试 剂 (25 μL体系) :10×PCR缓冲液(含 20 mmol/L的 Mg2+ ) 2. 5 μL、Taq DNA 聚合酶(2. 5 U/μL)0. 5 μL、dNTP混合物(每 种 各 含 10 mmol/L) 0. 5 μL、ArM1 引 物 (10 μmol/L) 1. 0 μL、ArM2 引 物 (10 μmol/L)

　　1. 0 μL、cDNA 3. 0 μL、ddH2 O 16. 5 μL。

　　反应条件 :94 ℃预变性 3 min,然后 94 ℃变性 30 s、56 ℃ 退火 30 s、72 ℃延伸 1 min,进行 35个循环 ,最后一个循环结束后 72 ℃继续延伸 7 min。

　　C. 6 琼脂糖凝胶电泳

　　RT-PCR产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析 。每个样品取 5 μL的 RT-PCR产物与 1 μL的 6×上样缓冲液混合均匀 ,并加到置于 0. 5×TBE缓冲液的 1. 5%琼脂糖凝胶孔中 ,然后在 120 V 下电泳 。 电泳结束后 ,放入装有 0. 5 μg/μL的溴化乙锭(EB) 溶液的容器中染色 ,然后在清水中清洗后 ,在凝胶成像系统中观察 ,拍照 ,并保存照片 。

　　C. 7 结果判定

　　在阴性对照没有产生条带 、阳性对照产生约 370 bp的预期大小条带情况下 ,如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带 ,则判定为阳性 ;否则判定为阴性 。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR方法

　　D. 1 引物及探针序列

　　本方法的引物及探 针 序 列 见 表 D. 1, 扩 增 区 域 在 ArMV 基 因 组 RNA2 的 CP 基 因 上 , 扩 增 长 度100 bp。其中 ArM3 为 正 向 引 物 , ArM4 为 反 向 引 物 , 探 针 5’-端 标 记 报 告 荧 光 染 料 6-carboxy fluorescent(FAM) ,3’-端标记淬灭荧光染料 tetra-methylcar-boxyrhoda mine(TAMRA) 。

　　注 : 探针也可以用其他荧光染料标记 。

　　表 D. 1 实时荧光 RT-PCR 的引物和探针序列

　　引物名称

　　引物序列

　　在 AM238665a 上的位置

　　ArM3

　　5’-CACTGTAGCCCTTGGAGATAATCCC-3’

　　22~ 45

　　ArM4

　　5’-GCCTTCCAGGTCCCACATTAACTTT-3’

　　98~ 121

　　ArM-Probe

　　5’-(FAM) CTCACATGATAGCTTGTCATGGACTCC(TAMRA)-3’

　　51~ 77

　　a 在 GenBank上的基因序列登录号

　　D. 2 总 RNA 的提取

　　总 RNA提取见 C. 3。

　　D. 3 实时荧光 RT-PCR检测

　　反转录合成 cDNA见 C. 4,然后进行实时荧光 PCR 检测 。 在 25 μL的反应体系中加入 : 12. 5 μL的 2×Premix ExTaq,1. 0 μL引物 ArM3(10μmol/L) ,1. 0 μL引物 ArM4(10μmol/L) ,Taqman探针ArM-Probe(10 μmol/L) 0. 5 μL,0. 5 μL的 Rox ReferenceDye,3. 0 μL合成的 cDNA,超纯水 6. 5 μL。使用实时数据采集模式 ,反应条件为 :95 ℃预变性 10 min,然后 95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s共 40个循环 。

　　注 : 也可采用其他公司的试剂盒 ,各种试剂的量根据具体情况进行调整 。

　　D. 4 结果判定

　　在阳性对照 Ct值 ≤34, 阴性对照和空白对照的 Ct值 ≥40前提下 :

　　— 如果检测样品的 Ct值 ≤35时 ,则判定为阳性 ;

　　— 如果检测样品的 Ct值 ≥40时 ,则判定为阴性 ;

　　— 如果 35

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