GB/T 28070-2011 黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28070—2011

　　黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofTilletiawalkeriCastlebury&Carris

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28070—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271) 提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 ,深圳市检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :章桂 明 、程 颖 慧 、王 颖 、陆 清 、凌 杏 元 、龙 海 、陈 枝 楠 、刘 新 娇 、仲 建 忠 、杨 伟 东 、缪建锟 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28070—2011

　　黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了黑麦草腥黑粉菌的检疫鉴定方法和检疫鉴定流程 , 明确了取样和样品保存方法 。

　　本标准适用于黑麦草传带黑麦草腥黑粉菌的检测以及小麦中污染的黑麦草腥黑粉菌的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 18085 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法

　　GB/T 19495. 2 转基因产品检测 实验室技术要求

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 黑麦草腥黑粉菌基本信息

　　中文名 :黑麦草腥黑粉菌 。

　　学名 :TilletiawalkeriCastlebury & Carris(简称 TW) 。

　　英文名 :ryegrass bunt。

　　属真菌界 Fungi、担子菌门 Basidiomycota、黑粉菌纲 Ustomycetes、黑粉菌 目 Ustilaginales、腥黑粉菌科 Tilletiaceae、腥黑粉菌属 Tilletia。

　　病粒及附着于健康种子表面的冬孢子是病原菌进行远距离传播的主要途径 , 由于该病局部侵染的特性 ,在收获期间很难有效的清除混杂于健康种子中的病粒 , 因而病粒可随同小麦或黑麦草的资源性引种或科研性引种而进行远距离传播 。

　　黑麦草腥黑粉菌的其他信息参见附录 A。

　　4 方法原理

　　根据黑麦草腥黑粉菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征 ,应用相关仪器 ,包括显微镜和PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定 。

　　5 检疫鉴定流程

　　检疫鉴定流程见图 1。

　　1

　　GB/T 28070—2011

　　图 1 黑麦草腥黑粉病菌检疫鉴定流程图

　　6 取样方法

　　散装船运黑麦草种子及小麦参照 GB/T 18085取样方法进行取样 。袋装黑麦草及小麦参照 SN/T 2122取样方法进行取样 。

　　2

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　　7 主要仪器设备和试剂

　　7. 1 主要仪器设备

　　7. 1. 1 摇床 。

　　7. 1. 2 显微镜 。

　　7. 1. 3 纯水器 。

　　7. 1. 4 测序仪 。

　　7. 1. 5 电泳仪 。

　　7. 1. 6 低温冰箱 。

　　7. 1. 7 显微操作仪 。

　　7. 1. 8 超净工作台 。

　　7. 1. 9 高压灭菌锅 。

　　7. 1. 10 光照培养箱 。

　　7. 1. 11 旋涡振荡器 。

　　7. 1. 12 普通离心机 。

　　7. 1. 13 冷冻干燥机 。

　　7. 1. 14 凝胶成像仪 。

　　7. 1. 15 核酸蛋白分析仪 。

　　7. 1. 16 PCR仪(常规 PCR仪 、实时荧光 PCR仪) 。

　　7. 1. 17 破壁针(具有平截切面的针 ,能将孢子压碎) 。

　　7. 1. 18 培养皿(9 cm) 。

　　7. 1. 19 筛网(40 μm、20 μm) 。

　　7. 1. 20 孔径 100 μm 的毛细管 。

　　7. 1. 21 锥形瓶(250 mL、500 mL) 。

　　7. 1. 22 盖玻片(18 mm×18 mm) 。

　　7. 1. 23 PCR反应管(0. 2 mL,0. 5 mL) 。

　　7. 1. 24 载玻片(25 mm×76 mm) ,厚(0. 8 mm~ 1. 0 mm) 。

　　7. 1. 25 Tip头(0. 1 μL~ 10 μL,5 μL~ 200 μL,100 μL~ 1 000 μL) 。

　　7. 1. 26 可调微量移液器(2μL,10 μL,20 μL,100 μL,200 μL,1 000 μL)

　　7. 2 主要试剂

　　除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯或生化试剂 。

　　7. 2. 1 三氯甲烷 。

　　7. 2. 2 异戊醇 。

　　7. 2. 3 异丙醇 。

　　7. 2. 4 醋酸钠 。

　　7. 2. 5 甲酰胺 。

　　7. 2. 6 70%乙醇 。

　　7. 2. 7 无水乙醇 。

　　7. 2. 8 Tris饱和酚 。

　　7. 2. 9 Taq酶 。

　　3

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　　7. 2. 10 Gelatin。

　　7. 2. 11 溴化乙锭 。

　　7. 2. 12 DNA Marker。

　　7. 2. 13 PDA培养基 。

　　7. 2. 14 SDS提取液 。

　　7. 2. 15 PCR缓冲液 。

　　7. 2. 16 电泳缓冲液 。

　　7. 2. 17 上样缓冲液 。

　　7. 2. 18 Bigdye试剂盒 。

　　7. 2. 19 TaqMan UniversalPCR Master Mix。

　　7. 2. 20 席尔氏浮载剂 ,见 GB/T 18085。

　　7. 2. 21 dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 。

　　8 检测与鉴定

　　8. 1 实验室器皿和晒网前处理

　　将所有实验器皿和筛网浸泡于 1. 6%的次氯酸钠中 15 min,然后用蒸馏水冲洗 5 次 。

　　8. 2 形态学鉴定

　　对查找到菌瘿 ,或通过洗涤检验获得冬孢子的 ,先进行形态学鉴定 。对菌瘿采用解剖针挑取菌瘿的冬孢子 ,置于席尔氏液中制片 ,对洗涤检验采用滴管吸取冬孢子悬浮液制片 ,待冬孢子胶质鞘允分展开后 ,进行封片 ,观察冬孢子的形状 ,孢壁结构 ,在 100×油镜下测量冬孢子的大小 ,每个样品测量 100个冬孢子 。

　　形态学鉴定的具体操作过程见附录 B,TW 与近似种的形态学图参见附录 C。

　　8. 3 单个冬孢子直接分子检测

　　对未查找到菌瘿 ,但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌冬孢子的 ,要进行单个孢子分子方法检测 。每个 PCR反应检测 1个冬孢子 ,共检测 5个冬孢子 。每次 PCR检测应设立相应的阳性对照 、阴性对照和空白对照 。

　　单个冬孢子直接分子鉴定的具体操作过程见附录 D。

　　8. 4 孢子培养物的分子检测

　　对未查找到菌瘿 ,但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌 ,而这些疑似黑麦草腥黑粉菌通过形态学和单个孢子检测无法获得准确结果时 ,则要对孢子进行培养(培养方法见 E. 1) ,用培养物分子检测 。每次 PCR检测须设立相应的阳性对照 、阴性对照和空白对照 。

　　孢子培养物分子检测的具体操作过程见附录 E、附录 F。

　　8. 5 序列测定与比对

　　将 PCR产物纯化后 ,进行测序 ,或由生物公司完成 。把测序所得的核苷酸序列与已知的黑麦草腥黑粉菌相应序列进行比对 。

　　序列比对的具体操作过程见附录 G。

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　　9 结果判断与表述

　　9. 1 形态学鉴定结果判断和表述

　　对查找到的菌瘿中的冬孢子或通过洗涤检验获取的冬孢子 ,所观察的症状和形态学特征与黑麦草腥黑粉菌冬孢子的一致 ,且对其 100个孢子大小测量平均值介于 30 μm~ 31 μm ,则判定该样品中含有黑麦草腥黑粉菌 ;对其 100个孢子大小测量平均值小于 25μm 或者大于 35μm ,则判定该样品不含有黑麦草腥黑粉菌 ;如孢子大小介于 25 μm~ 30 μm 或 31 μm~ 35 μm 之间 ,则判定该样品含有疑似黑麦草腥黑粉菌 ,须进行进一步分子检测 。

　　9. 2 单个孢子直接分子检测结果判断和表述

　　9. 2. 1 常规 PCR检测结果判断和表述

　　单个孢子进行常规 PCR检测 ,在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,如样品的扩增产生 473 bp的特异性条带 ,且测序比对与黑麦草腥黑粉菌一致的判定为该样品含有黑麦草腥黑粉菌 ,如没有 PCR扩增条带的则须挑取孢子进行萌发 ,进行分子检测 。

　　9. 2. 2 实时荧光 PCR检测结果判断和表述

　　对单个孢子进行 MGB探针实时荧光 PCR 检测 ,在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,则 :

　　— 检测 Ct值小于或等于 36,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性 ;

　　— 检测 Ct值大于 36,应重做实时荧光 PCR,再次扩增后 ,如 Ct值小于或等于 36,判定同上 ;如再次扩增后 Ct值大于 36,则需要挑取冬孢子进行萌发 ,用孢子培养物进行分子检测 。

　　9. 3 孢子培养物分子检测结果判断和表述

　　9. 3. 1 常规 PCR判断和表述

　　对孢子培养物进行常规 PCR检测 ,在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,如样品的扩增产生 414bp(引物 Tin11/Tin4) 或 473 bp(引物 P14) 的特异性条带 ,则初步判定黑麦草腥黑穗菌检测结果呈阳性 ,但需进一步进行实时荧光 PCR检测或序列测定与比对进行结果验证 ,按照实时荧光PCR检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定 ;如该样品无特异性扩增条带 ,则判定黑麦草腥黑穗菌检测结果呈阴性 。

　　9. 3. 2 实时荧光 PCR 结果判定和表述

　　9. 3. 2. 1 普通探针实时荧光 PCR 结果判定和表述

　　普通探针的实时荧光 PCR检测 ,在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,则 :

　　— 检测 Ct值小于 34,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性 ;

　　— 检测 Ct值大于或等于 34,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性 。

　　9. 3. 2. 2 MGB探针实时荧光 PCR 结果判断和表述

　　MGB探针实时荧光 PCR检测 ,在阳性对照 、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 ,则 :

　　— 检测 Ct值小于或等于 36,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性 ;

　　— 检测 Ct值大于或等于 40,判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性 ;

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　　— 检测 Ct值在 36~40之间 ,应重做实时荧光 PCR,再次扩增后 ,如 Ct值小于或等于 36或者 Ct值大于或等于 40,判定同上 。

　　9. 4 序列测定和比对

　　把测序所得到的核苷酸序列与已知的黑麦草腥黑粉菌序列进行比对 ,如果与已知的黑麦草腥黑粉菌相应序列完全一致则判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性 ,不一致则判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性 。

　　10 样品与原始数据保存

　　10. 1 样品保存

　　存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式 ,妥善保存 6个月 。如发现黑麦草腥黑粉菌 ,该样品应保存 1 年 , 以备复验 ,如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕 。保存期满后 ,需经灭菌处理 。

　　10. 2 原始数据保存

　　样品检测结束后 ,其原始记录单和检验报告或证书应归档 ,妥善保管 , 以备复验 、谈判和仲裁 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　黑麦草腥黑粉菌其他信息

　　A. 1 分布

　　主要分布在美国 、澳大利亚 、新西兰 、加拿大 、丹麦 、荷兰 、日本 、西班牙等国家 。

　　A. 2 形态特征及寄主

　　黑麦草腥黑粉菌局部为害黑麦草穗部 ,感病小穗形成深褐色菌瘿 ,外表由菌丝化的果皮包被 , 与感病子粒果皮本身具有的淡紫色难于区别 ,发病严重时 ,小穗的子房完全被黑粉菌孢子所代替 。黑麦草腥黑粉菌冬孢子直径为 25 μm~ 35 μm(平均 30 μm) ,较 T. indica的直径 25 μm~ 43 μm(35 μm) 略小 ,冬孢子为淡黄褐色 ,或金褐色至暗褐色 ,外孢壁表面纹饰为粗糙的疣状突起 ,呈同心轮纹状排列 ,疣突外观较 T. indica更为粗糙 。 目前已知自然寄主仅为黑麦草 。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　形态学鉴定

　　B. 1 菌瘿查找

　　在体视显微镜下 ,检查黑麦草种子中有无菌瘿 。对于感病较重的种子 ,菌瘿颜色多呈暗紫褐色 ,不同于健康种子 ,感病种子因腥黑粉菌孢子而散发出三甲胺气味 。对于感病轻微的种子 ,可采用将黑麦草种子浸泡在水中检查菌瘿 。

　　B. 2 洗涤检验

　　B. 2. 1 取 50g样品放入 250mL锥形瓶中 ,加入 100mL无菌蒸馏水(含 0. 01% Tween-20) ,放于摇床200 r/min摇动 3 min以便释放孢子 。

　　B. 2. 2 将洗涤液倒在上层的 40μm 的筛网上 ,20μm 筛网在下层 ,进行抽气过滤 ,用 500mL 的锥形瓶接收滤液 。

　　B. 2. 3 用 100 mL无菌蒸馏水冲洗 250 mL锥形瓶中样品 2 次 ,然后将样品洗涤液倒在 40 μm 的筛网上 ,再用 200 mL~ 300 mL无菌蒸馏水冲洗 40 μm 筛网 ,确保孢子从样品上分离 。

　　B. 2. 4 移去 40μm 筛网 ,将 20μm 筛网倾斜成 45°,用无菌蒸馏水将筛网上的孢子都冲洗下来 ,然后将孢子洗涤液倒入离心管中 ,1 000g离心 3 min。

　　B. 2. 5 用移液管将上清缓缓吸出 , 最后加入席尔氏液 ,视沉淀物多少定容至 100 μL~ 500 μL, 混匀 ,镜检 。

　　B. 3 形态学鉴定

　　用解剖针挑起少量孢 子 , 置 于 席 尔 氏 液 中 制 片 , 在 显 微 镜 下 观 察 孢 子 大 小 、颜 色 和 孢 壁 结 构 , 在100×油镜下测量 100个冬孢子 。

　　B. 4 结果判定

　　形态学鉴定的结果判定见 9. 1。

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　黑麦草腥黑粉病菌与近似种的孢子形态图

　　C. 1 黑麦草腥黑粉病菌孢子显微形态图(EPPO,2004) 见图 C. 1。

　　图 C. 1 黑麦草腥黑粉病菌孢子显微形态图

　　C. 2 黑麦草腥黑粉病菌孢子电镜扫描形态图(Jim Plaskowitz,2006) 见图 C. 2。

　　图 C. 2 黑麦草腥黑粉病菌孢子电镜扫描形态图

　　C. 3 小麦印度腥黑穗病菌孢子显微形态图(章桂明等 ,2005) 见图 C. 3。

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　　图 C. 3 小麦印度腥黑穗病菌孢子显微形态图

　　C. 4 小麦印度腥黑穗病菌孢子电镜扫描形态图(章桂明等 ,2005) 见图 C. 4。

　　图 C. 4 小麦印度腥黑穗病菌孢子电镜扫描形态图

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　单个冬孢子直接分子检测

　　D. 1 单个孢子核酸制备

　　菌瘿中冬孢子获取方法 :用针刺破菌瘿 ,挑取其中不带植物组织的少许孢子 ,将这些孢子轻轻展布于载玻片上 ,在低倍镜下观察孢子是否分散开 ,再将单个孢子挑起 ,直接转移到 PCR 管的管盖中 ,在低倍镜下确认孢子是否已被成功放置 。

　　孢子悬浮液中冬孢子的获取方法 :用显微操作系统(或在倒置显微镜下人工操作) 从孢子悬浮液中吸取孢子 ,所用毛细管孔径为 100 μm ,整个操作过程可在检测器上进行监控 ,也可在显微镜下直接进行观察 ,确认孢子已被吸入毛细管内并被转移到 PCR管的管盖内 。

　　用破壁针对放置在 PCR管盖中的孢子实施破壁 :在 10×低倍镜下用破壁针头轻轻挤压孢子 ,促使孢子壁破裂 ,使孢子中的核酸释放出来 ,在显微镜下检测孢子壁是否已经被压破 。快速将 PCR 反应混合液加到 PCR管盖中 ,振荡混匀 ,置于冰上 ,振荡后离心 。

　　D. 2 分子生物学检测

　　D. 2. 1 常规 PCR检测

　　D. 2. 1. 1 常规 PCR 引物序列

　　常规 PCR 引物序列为 :

　　正向引物 P14-1:5’-TGTTTGAGCCACGCTATGACC-3’

　　反向引物 P14-2:5’-AACTTCCAAGGCGACCATTC-3’

　　D. 2. 1. 2 常规 PCR扩增体系及条件

　　反应体系总体积为 25μL,各成分终浓度为 :2. 5 μL10×PCR缓冲液[Tris-HCl(pH8. 0) 10 mmol/L, Mg2+ 1. 5 mmol/L, KCl50 mmol/L] , 2 μL dNTPs(2. 5 mmol/L) , 0. 25 μL 各 引 物 (10 μmol/L) , 0. 3 μLTaq酶(5U/μL) ,2. 5 μL Gelatin[0. 01%(wt/vol) ] ,无菌双蒸水 17. 2 μL。将反应体系混匀 ,离心后置于 PCR仪中进行反应 ,每个 PCR反应检测 1个冬孢子 ,共检测 5个冬孢子 。用无菌双蒸水作空白对照 , 阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的 DNA 作为模板 , 阴性对照以其他腥黑穗病菌 DNA 作为模板 。

　　PCR 的反应条件为 96℃预变性 3 min,然后进入循环反应 :96℃变性 15 s,59℃退火 15 s,72℃延伸 15 s,共 70次循环 ,72 ℃延伸 10 min。

　　D. 2. 1. 3 琼脂糖凝胶电泳

　　每个样品取 5 μL的 PCR产物与 1 μL的 6×上样缓冲液混合均匀 ,并加到含有溴化乙锭(0. 5 μg/mL)的 1. 2%琼脂糖凝胶中 ,在 120V下进行电泳 。 电泳结束后在凝胶成像系统中观察 、拍照 ,并保存照片 。

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　　D. 2. 2 实时荧光 PCR检测

　　D. 2. 2. 1 实时荧光 PCR 引物及探针序列

　　实时荧光 PCR 引物及探针序列为 :

　　正向引物 MP3-1:5’-CTCGAGCCACTCCGTTGG-3’

　　反向引物 MP3-2:5’-GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3’

　　探针序列 MPb3:5’-FAM-TACTCTTCATTGCCCTCA-MGB-3’

　　D. 2. 2. 2 实时荧光 PCR反应体系及条件

　　反应体系总体积为 5 μL,各成分为 :实时荧光反应混合液 2. 5 μLTaqMan Universal PCR Master Mix,0. 45 μL各引物(10 μmol/L) ,0. 1 μL探针(10 μmol/L) ,无菌双蒸水 1. 5 μL。将反应体系混匀 ,离心后置于实时荧光 PCR 仪中进行反应 , 每个实时荧光 PCR 反应检测 1 个冬孢子 ,共检测 5 个冬孢子 。用无菌双蒸水作空白对照 , 阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉病菌的 DNA 作为模板 , 阴性对照以其他腥黑穗病菌 DNA作为模板 。

　　设置扩增反应条件为 50℃预热 2 min,95℃变性 10min,然后进入循环反应 :95℃变性 15 s,60℃延伸 1 min,共 40次循环 。

　　对实时荧光 PCR仪的程序进行设置 , 以使该仪器能进行 FAM 荧光的检测 。

　　D. 3 结果判定

　　结果判定见 9. 2。

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　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　孢子培养物常规 PCR检测

　　E. 1 孢子萌发

　　挑取冬孢子 ,置于 2%水琼脂培养基上 ,18 ℃ ~ 20 ℃ 、每日连续光照 12 h条件下培养 10 d,解剖镜下检查萌发情况 。对萌发的孢子用接种针挑取置于 PDA培养基上 ,20 ℃ ~ 22 ℃培养 20 d。

　　E. 2 孢子培养物的核酸制备

　　E. 2. 1 称取 0. 1 g培养物 ,放在无菌的多层滤纸上 , 吸去水分 ,置于无菌的研钵中 ,用液氮冷冻 ,用研磨棒将它们研成粉末 。

　　E. 2. 2 立即转移到 2 mL 的离心管中 ,加入 65 ℃预热的 SDS提取液 700μL,置于水浴锅中 65 ℃水浴30 min,期间不断混匀 。

　　E. 2. 3 加入 5 μL 10 mg/mL RNA酶 ,充分混匀 ,在 37 ℃放置 30 min。

　　E. 2. 4 加入等体积的 Tris饱和酚 ,充分摇匀 ,在 12 000 r/min下离心 15 min。

　　E. 2. 5 取上清液 ,加入 1 ∶ 1 三氯甲烷/异戊醇(24 ∶ 1) , 在 12 000 r/min下离心 15 min;重复一次该步骤 。

　　E. 2. 6 加入等体积预冷的异丙醇 ,轻轻摇晃 ,置于 -20 ℃冰箱静置 30 min, 在 12 000 r/min下离心15 min。

　　E. 2. 7 弃上清液 ,加入 70%乙醇 500 μL,12 000 r/min下离心 3 min,弃上清液 ,重复 2 次 。

　　E. 2. 8 得到 DNA沉淀 ,用冷冻干燥仪进行干燥 ,加入 30μL~ 50μLTE或水 ,充分溶解后 ,测量 DNA的纯度和浓度后置于 -20℃冰箱中保存 。

　　注 : 孢子培养物的核酸也可采用 DNA提取试剂盒提取 。

　　E. 3 DNA 纯度与浓度的测定

　　用核酸蛋白分析仪测定 DNA 的纯度与浓度 ,分别取得 260 nm 和 280 nm 处的吸收值 ,计算核酸的纯度和浓度 ,计算见式(E. 1) 和式(E. 2) :

　　PCR级 DNA溶液的 OD260/OD(D)28(N)05(/)0(O)2O(80)D260 …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… (( E(E).. 2(1)))

　　E. 4 常规 PCR

　　E. 4. 1 引物序列

　　引物序列为 :

　　正向引物 Tin 11:5’-TAATGTTGGCGTGGCGGCAT-3’

　　反向引物 Tin4:5’-CAACTCCAGTGATGGCTCCG-3’

　　也可以选用 D. 2. 1. 1 中的 P14引物 。

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　　E. 4. 2 扩增体系及条件

　　引物 Tin 11/Tin4 的 反 应 体 系 总 体 积 为 25 μL, 各 成 分 为 : 2. 5 μL 10× PCR 缓 冲 液[Tris-HCl (pH8. 0)10 mmol/L,Mg2+ 1. 5 mmol/L,KCl50 mmol/L] ,1 μLdNTPs(10 mmol/L) ,0. 1 μL各引物(25 μmol/L) ,0. 1 μLAmpliTaq(5U/μL) ,1 μL DNA(10ng/μL) ,无菌双蒸水 20. 2 μL。将反应体系混匀 ,离心后置于 PCR仪中进行反应 ,每个反应重复 2 次 。用无菌双蒸水作空白对照 , 阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的 DNA作为模板 , 阴性对照以其他腥黑穗病菌 DNA作为模板 。

　　PCR 的反应条件为 94℃预变性 1 min,然后进入循环反应 :94℃变性 15 s,65℃退火 15 s,72℃延伸 15 s,共 25次循环 ,72 ℃延伸 6 min。

　　引物 P14的扩增体系和反应条件见 D. 2. 1. 2。

　　E. 5 琼脂糖凝胶电泳

　　琼脂糖凝胶电泳见 D. 2. 1. 3。

　　E. 6 结果判定

　　结果判定见 9. 3. 1。

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　　附 录 F

　　(规范性附录)

　　孢子培养物实时荧光 PCR检测

　　F. 1 孢子的萌发

　　孢子的萌发见 E. 1。

　　F. 2 孢子培养物的核酸制备

　　孢子培养物的核酸制备见 E. 2。

　　F. 3 DNA 纯度与浓度的测定

　　DNA纯度与浓度的测定见 E. 3。

　　F. 4 普通探针实时荧光 PCR检测

　　F. 4. 1 引物及探针序列

　　引物及探针序列为(Frederick R D,2000) :

　　引物序列同 E. 4. 1。

　　探针序列为 :5’-FAM-ATTCCCGGCTTCGGCGTCACT-TAMRA-3’

　　F. 4. 2 反应体系及条件

　　反应体系 总 体 积 为 25 μL, 各 成 分 为 : 实 时 荧 光 反 应 混 合 液 12. 5 μL TaqMan Universal PCR Master Mix,1 μL各引物(10 μmol/L) , 1 μL探针(10 μmol/L) , 1 μL DNA(10 ng /μL) ,无菌双蒸水8. 5 μL。将反应体系混匀 ,离心后置于实时荧光 PCR仪中进行反应 ,每个反应重复 2 次 。用无菌双蒸水作空白对照 , 阳 性 对 照 采 用 含 有 黑 麦 草 腥 黑 粉 菌 的 DNA 作 为 模 板 , 阴 性 对 照 以 其 他 腥 黑 穗 病 菌DNA作为模板 。

　　反应条件为 50 ℃预热 2 min, 95 ℃变性 10 min, 然 后 进 入 循 环 反 应 : 95 ℃变 性 15 s, 60 ℃延 伸1 min,共 34次循环 。

　　对实时荧光 PCR仪的程序进行设置 ,使该仪器能进行 FAM 荧光的检测 。

　　F. 5 MGB探针实时荧光 PCR检测

　　F. 5. 1 引物及探针序列

　　引物及探针序列为 :

　　正向引物 MP2-1序列为 :5’-AGCGCTAGGATCATGCGG-3’

　　反向引物 MP2-2序列为 :5’-CCCGGCTTCGGCGT-3’

　　探针 MPb2序列为 :5’-FAM-TCTGAGGCATCGCTG-MGB-3’

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　　GB/T 28070—2011

　　也可采用 D. 2. 2. 1 中的引物和探针进行检测 。

　　F. 5. 2 反应体系及条件

　　反应体系总 体 积 为 5 μL, 各 成 分 分 别 为 : 实 时 荧 光 反 应 混 合 液 2. 5 μL TaqMan Universal PCR MasterMix,0. 45μL各引物(10μmol/L) ,0. 1 μL探针(10μmol/L) ,1 μL DNA(10ng/μL) ,无菌双蒸水 0. 5 μL。将反应体系混匀 ,离心后置于实时荧光 PCR仪中进行反应 ,每个反应重复 2 次 。用无菌双蒸水作空白对照 , 阳性对照采用含有黑麦草腥黑 粉 菌 的 DNA 作 为 模 板 , 阴 性 对 照 以 其 他 腥 黑 穗 病 菌DNA作为模板 。

　　反应条件为 50 ℃预热 2 min, 95 ℃变性 10 min, 然 后 进 入 循 环 反 应 : 95 ℃变 性 15 s, 60 ℃延 伸1 min,共 40次循环 。

　　对实时荧光 PCR仪的程序进行设置 ,使该仪器能进行 FAM 荧光的检测 。

　　F. 6 结果判定和表述

　　结果判定和表述见 9. 3. 2。

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　　GB/T 28070—2011

　　附 录 G

　　(规范性附录)序列测定与比对

　　G. 1 PCR扩增

　　rDNA ITS 片段 PCR扩增方法如下 :

　　ITS4引物序列 :5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

　　ITS5引物序列 :5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

　　反应体系总 体 积 为 25 μL, 各 成 分 为 : 2. 5 μL 10× PCR 缓 冲 液[Tris-HCl(pH8. 0) 10 mmol/L, Mg2+ 1. 5 mmol/L, KCl50 mmol/L] , 2 μL dNTPs(2. 5 mmol/L) , 1. 25 μL各 引 物 (10 μmol/L) , 0. 3 μLTaq酶(5U/μL) ,1 μL DNA(10ng/μL) ,无菌双蒸水 16. 7 μL。

　　反应条件为 95 ℃预变性 10 min,然后进入循环 反 应 : 95 ℃变 性 30 s, 58 ℃退 火 30 s, 72 ℃延 伸1 min,共 35次循环 ,72 ℃延伸 7 min。

　　电泳检测见 D. 2. 1. 3。对符合条件的 PCR产物进行纯化 ,直接测序 ,具体操作步骤见相关试剂盒说明书 ,也可将 PCR产物送到生物公司进行测序 。

　　也可以用附录 D、附录 E 中的常规 PCR 引物进行 PCR扩增 。

　　G. 2 序列比对

　　把测序所得的核苷酸序列与已知的黑麦草腥黑粉菌的相对应的序列进行比对 。

　　G. 3 结果判定

　　结果判定见 9. 4。

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