GB/T 28071-2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28071—2011

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofcucumbergreen mottlemosaicvirus

　　2011-12-30发布 2012-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28071—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271) 提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、中华人民共和国广东出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 : 陈青 、陈红运 、廖富荣 、林石明 、吴冰冰 、冯黎霞 、张永江 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28071—2011

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 。

　　本标准适用于可能携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子 、苗木及其产品的检疫鉴定 。

　　2 黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息

　　中文名 :黄瓜绿斑驳花叶病毒 。

　　学名 :cucumber green mottle mosaic virus。

　　缩写 :CGMMV。

　　属烟草花叶病毒属 Tobamovirus成员 。

　　CGMMV可通过 接 触 传 播 , 也 可 通 过 种 子 传 播 。 蚜 虫 等 常 见 瓜 类 病 毒 的 传 播 介 体 不 能 传 播CGMMV。嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一 。植株一旦发病 ,如果未进行杀灭处理 ,土壤也可带毒 ,带毒土壤也可成为病害发生的侵染源 。

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录 A。

　　3 方法原理

　　通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 、体外反转录和体外 DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) ,并根据生物学特性进行检测鉴定 。

　　4 仪器设备、用具及试剂

　　4. 1 仪器设备

　　洗板机 、酶联检测仪 、高 速 冷 冻 离 心 机 、电 子 天 平(感 量 0. 001 g) 、超 净 工 作 台 、旋 涡 混 合 仪 、PCR仪 、实时荧光 PCR仪 、电泳仪 、电泳槽 、紫外透射仪 、隔离温室 、榨汁机 、水浴锅 。

　　4. 2 用具

　　微 量移液器(0. 5 μL,2 μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL) 、化学 PGR反应管和(或)96孔光化学 PCR反应板 、酶联板 、研钵 。

　　4. 3 试剂

　　4. 3. 1 酶联测定试剂(见附录 B) 。

　　4. 3. 2 RT-PCR检测试剂(见附录 C) 。

　　4. 3. 3 实时荧光 RT-PCR检测试剂(见附录 D) 。

　　4. 3. 4 生物学测定(参见附录 E) 。

　　1

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　　5 样品制备

　　5. 1 种子样品制备及检疫鉴定

　　挑取 500粒种子(重点挑取畸形 、不成熟的种子) 播于灭菌土中 ,待长出 3 片 ~ 4 片叶后将表现症状的植株编号 ,未表现症状的植株分组(10株为 1 组) 并编号 。采集的叶片分成两份 ,分别用于酶联测定和分子生物学检测 。

　　也可以挑取畸形 、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测 。

　　5. 2 苗木检验鉴定

　　有症状的苗木单独检测 。没有症状的分组检测 ,分组方法和检测方法同 5. 1。

　　5. 3 植物产品的检验鉴定

　　植物产品有症状的部分(如 :果实上的畸形 、斑驳等) 单独检测 。没有症状或无法观察症状的植物产品,应按比例取样 ,检测方法为酶联测定和分子生物学检测 。

　　6 检测方法

　　6. 1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　把制备的样品上清液加入已包被 CGMMV 抗体的 96孔酶联板中 ,进行 DAS-ELISA 检测 。 每个样品平行加到两个孔中 。健康的植物组织作阴性对照 ,感染 CGMMV 的植物组织作阳性对照 ,样品提取缓冲液作空白对照 ,其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片) 应尽量与检测样品一致 。

　　具体操作见附录 B。

　　6. 2 RT-PCR检测

　　分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成 cDNA后 ,进行 PCR扩增 。健康的植物组织作阴性对照 ,感染 CGMMV 的植物组织作阳性对照 ,用超纯水作空白对照 。

　　具体操作见附录 C。

　　6. 3 实时荧光 RT-PCR检测

　　分别提取样品和对照的总 RNA,进行实时荧光 RT-PCR检测 。健康的植物组织作阴性对照 ,感染CGMMV 的植物组织作阳性对照 ,超纯水作空白对照 。

　　具体操作见附录 D。

　　6. 4 生物学接种试验

　　参见附录 E。

　　7 结果判定

　　6. 1、6. 2、6. 3、6. 4 中如果两种方法的检测结果为阳性 , 即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳花叶病毒 。— 般是酶联测定为阳性后 ,RT-PCR 或实时荧光 RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带黄瓜绿斑驳花叶病毒 。必要时可进行生物接种试验 。

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　　GB/T 28071—2011

　　8 样品保存

　　经检验确定携带黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 的 样 品 应 在 合 适 的 条 件 下 保 存 , 种 子 保 存 在 4 ℃ , 病 株 在-20 ℃或者 -80℃冰箱中保存 ,做好标记和登记工作 。

　　9 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、检测时间 、地点 、方法和结果等 ,并要有经手人和检测人员的签字 。酶联测定应有酶联板反应原始数据 ,RT-PCR 检测应有扩增结果图片 ,生物学接种应有症状照片 。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒简介

　　A. 1 寄主范围

　　黄瓜绿斑驳 花 叶 病 毒 在 自 然 界 主 要 侵 染 西 瓜 (Citrulluslanatus) 、甜 瓜 (Cucumismelo) 、黄 瓜 (Cucumissativus) 、南瓜(Cucurbitamoschata) 、瓠 子(Iagenariasiceraria) 、丝 瓜(Lufa cylindrica) 、苦瓜 (Momordicacharantia) 等 葫 芦 科 植 物 。 一 些 杂 草 也 是 CGMMV 的 寄 主 , 主 要 包 括 北 美 苋 (Amaranthusblitoides) 、反枝 苋(Amaranthusretroflexus) 、天 芥 菜(Heliotropium europaeum) 、马 齿苋(Portulacaoleracea) 、龙葵(Solanum nigrum) 等 。

　　A. 2 病害症状

　　黄瓜 : 叶片斑驳并凸起 , 畸形 ,植株矮化 ,果实上可产生黄或银色条斑 ,果实严重受损 。

　　西瓜 :受侵染叶片轻型叶斑驳 ,严重时出现疱斑 ,植株矮化 ,成熟期果实表面出现浓绿色圆斑 ,果肉变色和腐烂 。

　　甜瓜 :茎端新叶出现黄斑 , 随叶片老化症状减轻 。

　　瓠子 : 叶片出现花叶 ,有绿色突起 ,脉间黄化 , 叶脉呈绿带状 。

　　A. 3 分布地区

　　CGMMV于 1935年在英国首次发现和报道 。 目前在英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯、丹麦 、德国 、俄罗 斯 、保 加 利 亚 、捷 克 、巴 西 、爱 尔 兰 、摩 尔 多 瓦 、瑞 典 、芬 兰 、韩 国 、朝 鲜 、以 色 列 、波 兰 、日本 、巴基斯坦和我国的大陆和台湾均有分布 。

　　A. 4 血清学特性

　　CGMMV具有很强的免疫原性 。

　　A. 5 粒体形态

　　黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体为直杆状 ,长度为 300 nm ,直径为 18 nm。

　　A. 6 基因组

　　病毒基因组为正单链 RNA,全长约 6. 4 kb,编码 4个蛋白 ;病毒基因组 5’和 3’端分别含有一段非编码区 。

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　　GB/T 28071—2011

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 包被抗体

　　特异性的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体 。

　　B. 1. 2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体 。

　　B. 1. 3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(ρNPP) 。

　　B. 1. 4 PBST缓冲液(洗涤缓冲液 pH7. 4)

　　NaCl 8. 0 g

　　Na2 HPO4 1. 15 g

　　KH2PO4 0. 2 g

　　KCl 0. 2 g

　　Tween-20 0. 5 mL

　　加入 900 mL蒸馏水溶解 ,用 NaOH 或 HCl调节 pH值到 7. 4,蒸馏水定容至 1 L。每升 PBS中加入 0. 5 mL 的 Tween-20。

　　B. 1. 5 样品抽提缓冲液(pH7. 4)

　　PBST

　　1 L

　　Na2SO3

　　1. 3 g

　　PVP(MW24000~40000)

　　20 g

　　NaN3

　　0 2 g

　　用 NaOH 或 HCl调节 pH值到 7. 4。4 ℃储存 。

　　B. 1. 6 包被缓冲液(pH9. 6)

　　Na2CO3 1. 59 g

　　NaHCO3 2. 93 g

　　NaN3 0. 2 g

　　加入 900 mL蒸馏水溶解 ,用 HCl调节 pH值到 9. 6,蒸馏定容至 1 L。4 ℃储存 。

　　B. 1. 7 酶标抗体稀释缓冲液(pH7. 4)

　　PBST

　　1 L

　　BSA(牛血清白蛋白) 或脱脂奶粉

　　2. 0

　　g

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　　PVP(MW24000~40000) 20. 0 g

　　NaN3 0. 2 g

　　用 NaOH 或 HCl调节 pH值到 7. 4。4 ℃储存 。

　　B. 1. 8 底物(ρNPP) 缓冲液(pH9. 8)

　　MgCl2 0. 1 g

　　NaN3 0. 2 g

　　二乙醇胺 97 mL

　　溶于 800 mL蒸馏水中 ,用 HCl调 pH值至 9. 8,蒸馏水定容至 1 L。4 ℃储存 。

　　B. 2 程序

　　B. 2. 1 包被抗体

　　用包被缓冲液将抗体按说明稀释 ,加入酶联板的孔中 , 100 μL/孔 ,加盖 ,室温避光孵育 4 h 或 4 ℃冰箱孵育过夜 ,清空酶联板孔中溶液 ,PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B. 2. 2 样品制备

　　待测样品按 1 ∶ 10(质量 ∶ 体积) 加入抽提缓冲液 ,用研钵研磨成浆 ,2000 r/min,离心 10min,上清液即为制备好的检测样品 。样品提取缓冲液作空白对照 , 阴性对照 、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 。

　　B. 2. 3 加样

　　加入制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照 ,100μL/孔 ,加盖 ,室温避光孵育 2 h或 4 ℃冰箱孵育过夜 ,清空酶联板孔中溶液 ,PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B. 2. 4 加酶标抗体

　　用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度 ,并加入到酶联板中 , 100 μL/孔 ,加盖 ,室温避光孵育 2 h,清空酶联板孔中溶液 ,PBST洗涤 4次 ~ 6次 。

　　B. 2. 5 加底物

　　将底物 ρNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL(现配现用) ,按 100μL/孔 ,加入到酶联板中 ,室温避光孵育 。

　　B. 2. 6 读数

　　用酶联检测仪在 30 min、1 h 和 2 h 于 405 nm 处读 OD值 。

　　B. 3 结果判断

　　B. 3. 1 对照孔的 OD405值(缓冲液孔 、阴性对照及阳性对照孔) ,应该在质量控制范围内 , 即 :

　　缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值<0. 15, 当阴性对照孔的 OD405值<0. 05时 ,按 0. 05计算 。

　　阳性对照有明显的颜色反应 ; 阳性对照 OD405值/阴性对照 OD405值 >2;孔的重复性基本一致 。

　　B. 3. 2 在满足了 B. 3. 1 质量要求后 ,结果原则上可判断如下 :

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显 >2,判为阳性 。

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　　GB/T 28071—2011

　　样品 OD405值/阴 性 对 照 OD405 值 在 阈 值 附 近 , 判 为 可 疑 样 品,需 重 新 做 一 次 , 或 用 其 他 方 法 加 以验证 。

　　样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显<2,判为阴性 。

　　若满足不了 B. 3. 1 质量要求 ,则不能进行结果判断 。

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　　附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 RNA提取试剂

　　TRIzolreagent、三氯甲烷 、异丙醇 、75%乙醇 。

　　C. 1. 2 反转录试剂

　　M-MLV RT(200U/μL) 、5×RT缓冲液 、dNTP(10 mmol/L) 、RNase Inhibitor(40U/μL) 。

　　C. 2 PCR试剂

　　10× PCR 缓 冲 液 ( 含 15 mmol/L 的 Mg2+ ) 、TaqDNA 聚 合 酶 ( 5 U/μL) 、dNTP 混 合 液 ( 各10 mmol/L) 。

　　C. 3 实验步骤

　　C. 3. 1 总 RNA提取

　　称取 0. 1 g植物组织加液氮研磨成粉末状 ,迅速将其移入灭菌的 1. 5 mL离心管中 ,加入 1 mL 的TrizoL试剂 ,剧烈振荡摇匀 ,室温静置 3 min;4 ℃ , 12 000 g 离心 10 min,取上清液 ;加入 200 μL三氯甲烷 ,上下颠倒混匀 ,室温静止 3 min;4℃ ,12 000g离心 10 min,取上层水相 ;加等体积的异丙醇 ,颠倒混匀;4 ℃ ,12000g离心 10min,弃上清 ;加 1 mL75%的乙醇洗涤沉淀 ,4 ℃ ,7500g离心 5 min,弃乙醇 ;沉淀于室温下充分干燥后 ,溶于 30 μL经 DEPC(焦碳酸二乙酯) 处理的 ddH2 O, -20 ℃保存备用 。

　　C. 3. 2 RT-PCR反应

　　C. 3. 2. 1 引物序列

　　上游引物 CGMMV1:5’-CgTggTAAgCggCATTCTAAACCTC-3’

　　下游引物 CGMMV2:5’-CCgCAAACCAATgAgCAAACCg-3’

　　RT-PCR产物大小 654bp。

　　C. 3. 2. 2 cDNA合成

　　反转录总体系为 12. 5 μL。在 PCR管中依次加入 3 μL总 RNA,1 μLCGMMV2引物 ,在 65 ℃温浴 7 min,然后 ,冰浴 5 min,瞬离 ,再向 PCR 管中加入下列试剂 : M-MLV RT(200 U/μL)0. 5 μL、5× RT缓冲 液 2. 5 μL、dNTP(10 mmol/L) 0. 5 μL、RNasin(40 U/μL) 0. 5 μL、DEPC 处 理 的 ddH2 O 4. 5 μL。反应参数 :37 ℃ 60 min,95 ℃ 10 min。合成的 cDNA 于 -20℃冰箱保存备用 。

　　C. 3. 2. 3 PCR扩增

　　PCR反应体系见表 C. 1。 反应参数 : 95 ℃ 4 min; 95 ℃ 60 s, 60 ℃ 50 s, 72 ℃ 60 s, 30个 循 环 ; 72 ℃ 10 min。也可采用一步法 RT-PCR试剂盒进行扩增 。

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　　GB/T 28071—2011

　　表 C. 1 PCR反应体系

　　10×PCR 缓冲液

　　2. 5

　　dNTP(10 mmol/L)

　　1. 0

　　CGMMV1(20 pmol/μL)

　　0. 5

　　CGMMV2(20 pmol/μL)

　　0. 5

　　Taq酶(5U/μL)

　　0. 2

　　cDNA模板

　　3. 0

　　ddH2 O

　　补足反应总体积至 25 μL

　　C. 3. 3 琼脂糖电泳

　　C. 3. 3. 1 制备凝胶

　　配制 1. 0%(质量浓度) 的琼脂糖凝胶 。溴化乙铵可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为 0. 5 μg/mL) ,也可在电泳完成后用溴化乙锭染色 。

　　C. 3. 3. 2 电泳

　　用 1 μL6×加样缓冲液与 5 μL样品混合 ,然后将其和适合的 DNA相对分子质量标准物分别加入到琼脂糖凝胶孔中 。接通电源 , 以 3 V/cm~ 5 V/cm 电场强度进行电泳 ,约 0. 5 h后观察结果 。

　　C. 3. 3. 3 结果观察

　　电泳结束后 ,将琼脂糖凝胶放入装有 0. 5 μg/μL的溴化乙锭(EB) 溶液的容器中染色 ,然后在清水中清洗后 ,置于紫外透射仪上观察 ,拍照并保留结果 。

　　C. 4 结果判断

　　阳性对照在 654bp左右处有扩增片段 , 阴性对照和空白对照无特异性扩增 ,样品出现与阳性对照一致的扩增条带 ,可判定为阳性 。

　　阳性对照 、阴性对照和空白对照正确 ,样品未出现与阳性对照一致的扩增条带 ,判定结果为阴性 。

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　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR检测

　　D. 1 主要试剂

　　RNA提取试剂见 C. 1. 1。

　　TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents。

　　D. 2 实时荧光 RT-PCR检测

　　D. 2. 1 引物与探针

　　引物和探针序列见表 D. 1。

　　表 D. 1 引物和探针序列及其在基因组中的位置

　　名 称

　　引物和探针序列

　　位 置

　　CGMMV-F

　　5’-gCATAgTgCTTTCCCgTTCAC-3’

　　6 284 nt~ 6 304 nt

　　CGMMV-R

　　5’-TgCAgAATTACTgCCCATAgAAAC-3’

　　6 361 nt~ 6 384 nt

　　CGMMV-P

　　CggTTTgCTCATTggTTTgCggA

　　6 315 nt~ 6 337 nt

　　D. 2. 2 RNA提取

　　操作方法见 C. 3. 1。

　　D. 2. 3 反应体系

　　实时荧光 PCR反应体系见表 D. 2。

　　表 D. 2 实时荧光 RT-PCR反应体系

　　试 剂 名 称

　　加样量μL

　　2× Master Mix withoutUNG

　　25. 0

　　40× MultiScribe and RNase Inhibitor Mix

　　1. 25

　　CGGMV模板(RNA)

　　3. 0

　　CGMMV-F(20 μmol/L)

　　1. 0

　　CGMMV-R(20 μmol/L)

　　1. 0

　　CGMMV-P(20 μmol/L)

　　0. 5

　　DEPC处理水

　　补足反应总体积至 50 μL

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　　GB/T 28071—2011

　　D. 2. 4 实时荧光 RT-PCR反应参数

　　检测 CGMMV反应参数见表 D. 3。

　　表 D. 3 实时荧光 RT-PCR反应参数

　　作 用

　　温 度

　　时 间

　　反转录

　　48 ℃

　　30 min

　　活化 DNA合成酶和预变性

　　95 ℃

　　10 min

　　PCR(40个循环)

　　变性

　　95 ℃

　　15 s

　　延伸

　　60 ℃

　　1 min

　　D. 3 结果判定

　　检测样品的 Ct值大于或等于 40时 ,则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性 。

　　检测样品的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性 。

　　检测样品的 Ct值小于 40而大于 35时 ,应重新进行测试 ,如果重新测试的 Ct值大于或等于 40时 ,则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性 ;如果重新测试的 Ct值小于 40,则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性 。

　　GB/T 28071—2011

　　GB T 28071 2011

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　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　生物学接种

　　E. 1 接种

　　病叶加 1 ∶ 3(质量 ∶ 体积) 的磷酸盐缓冲液(0. 01 mol/L,pH 7. 2) 于研钵中充分研碎 ,在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土 ,用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面 。

　　E. 2 寄主及症状

　　E. 2. 1 鉴别寄主

　　黄瓜(Cucumissativus) :系统侵染 ;褪绿斑 ;花叶 。

　　西瓜(Citrulluslanatus) :系统花叶 。

　　E. 2. 2 枯斑寄主

　　苋色藜(Chenopodium amaranticolour) :局部侵染 ;枯斑 。

　　曼陀罗(Daturastramonium) :局部侵染 ;枯斑 。

　　碧冬茄(Petuniahybrida) :局部侵染 ;枯斑 。