GB/T 36191-2018 真鲷虹彩病毒病诊断规程

　　ICS 65 . 020 . 30 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36191—2018

　　真鲷虹彩病毒病诊断规程

　　protocolofdiagnosticmethodsforredseabreamiridovirusdisease(RSIVD)

　　2018-05-14 发布 2018-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36191—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC 156)归口 。

　　本标准起草单位：深圳出入境检验检疫局、中山大学、深圳市检验检疫科学研究院。

　　本标准主要起草人：兰文升、刘莹、于力、王津津、史秀杰、董传福、刘荭、贾鹏、郑晓聪、何俊强、叶奕优、王红英。

　　GB/T 36191—2018

　　真鲷虹彩病毒病诊断规程

　　1 范围

　　本标准规定了真鲷虹彩病毒病(Red sea bream iridovirus disease, RSIVD) 临床诊断、采样和病毒

　　分离鉴定和综合判定的方法。

　　本标准适用于水生动物真鲷虹彩病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法

　　GB/T 18088 出入境动物检疫采样

　　SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BLAST：局部序列比对检索工具(basic local alignment search tool)

　　bp：碱基对(base pair)

　　CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)

　　CPE：细胞病变效应(cytopathic effect)

　　DMEM: Dulbeco Eagle’s minimum essential medium

　　EB：溴化乙锭(ethidium bromide)

　　FITC：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)

　　IFAT：间接荧光抗体实验(indirect fluorescent antibody test)

　　ISKNV：传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus)

　　MFF-1：鳜鱼鱼苗细胞系(mandarin fish fry cell line)

　　PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)

　　PBST：含 0.05%吐温-20 的 pH7.4 的磷酸盐缓冲液(0.05% tween+phosphate buffered saline)

　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　RSIV：真鲷虹彩病毒(red sea bream iridoviral virus)

　　RSIVD：真鲷虹彩病毒病(red sea bream iridoviral disease)

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。

　　4 . 2 RSIV参考株。

　　注 ：由农业部相关部门指定提供。

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　　4.3 PCR反应试剂(dNTPs, Taq酶等)，保存 -20 ℃。

　　4.4 引物：引物浓度为 20 umol/L。

　　引物序列：

　　1-F: 5′-CTC AAA CAC TCT GGC TCA TC-3′;

　　1-R: 5′-GCA CCA ACA CAT CTC CTA TC-3′;

　　4 . 5 MFF-1 细胞系。

　　注 ：由农业部相关部门指定提供。

　　4 . 6 细胞培养液：含 10%胎牛血清的 DMEM 细胞培养液。

　　4 . 7 胎牛血清(FBS) 。

　　4 . 8 抗 RSIV 的单克隆抗体(鼠源)。

　　注 ：由农业部相关部门指定提供。

　　4 . 9 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠抗体。

　　5 器材和设备

　　器材和设备包括如下：

　　a) 超净工作台。

　　b ) 冷冻离心机。

　　c) 生化培养箱。

　　d) 普通冰箱和低温冰箱。

　　e) 荧光显微镜。

　　f) 倒置显微镜。

　　g) PCR仪。

　　h) 核酸电泳系统。

　　i ) 凝胶成像仪。

　　6 临床诊断

　　6 . 1 临床症状

　　该病主要症状为鱼体色变黑，游动缓慢，呼吸加快，外表症状不明显，个别眼球突出、出血，体表出血 。 内脏诸器官褪色，脾脏肿大。

　　6 . 2 组织病理检测

　　制备脾脏的印片或组织切片，经吉姆萨(Giemsa)染色，见附录 A 中 A. 1,患病样品镜检可见异常肿大的细胞。

　　6 . 3 结果判定

　　6 . 3 . 1 符合 6 . 1 的临床症状典型特征，并且经组织病理检测可见异常肿大的细胞，临床诊断结果阳性。

　　6 . 3 . 2 不符合 6 . 1 的临床症状典型特征，并且经组织病理检测未见异常肿大的细胞，临床诊断结果阴性。

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　　7 采样

　　7 . 1 采样对象

　　牙鲆、美国红鱼、真鲷、鯽鱼和鳜鱼等易感鱼类。

　　7 . 2 采样数量

　　采样数量应符合 SC/T 7103 的要求。

　　7 . 3 样品采集

　　按 GB/T 18088 的规定执行，且体长 ≤4 cm 的鱼苗取整条，体长 4 cm~ 6 cm 的鱼取内脏;体长大于 6 cm 的鱼则取脾、肾、心脏、肠和鳃。

　　8 病毒分离和鉴定

　　8 . 1 病毒分离

　　8 . 1 . 1 样品处理

　　每 5 尾鱼为 1 个样品，若有症状成鱼每 1 尾为 1 个样品。 采集的组织样品(最少不低于 5 g)立刻研磨匀浆，用细胞培养液将研磨后的组织稀释 10 倍，置于 25 ℃ ~27 ℃培养箱中孵育 24 h,待用。

　　8 . 1 . 2 病毒分离培养

　　8 . 1 . 2 . 1 将 MFF-1 细胞经细胞消化液(见 A. 2) 消化后，加细胞培养液转接至 96 孔板，培养 24 h,制备单层细胞，待用。

　　8. 1 .2.2 将孵育的组织样品 8 000g 离心 15 min, 收集组织匀浆上清液。

　　8 . 1 . 2 . 3 组织匀浆上清液做 10 倍稀释，在无菌条件下，分别接种到 MFF-1 细胞的 96 孔板，每孔中加入的组织上清液的量与细胞培养液的比例为 1 ∶ 10 。 同时设立阳性对照(接种 RSIV参考株)和阴性对照(未接种病毒的细胞)，置于 25 ℃ ~27 ℃培养。

　　8 . 1 . 3 细胞病变效应的观察

　　8 . 1 . 3 . 1 倒置显微镜下观察细胞变化。

　　8 . 1 . 3 . 2 被检样品接种 7 d后没有观察到 CPE(阳性对照已出现 CPE),需盲传一次。 传代程序：将接种细胞反复冻融，收集细胞培养液，8 000g 离心 15 min,上清液分别接种到新制 96 孔板的单层细胞中，继续培养 7 d并观察。

　　8 . 1 . 3 . 3 如果细胞培养板的孔中出现 CPE,细胞培养液进行 IFAT试验或 PCR鉴定。

　　8 . 1 . 4 结果判定

　　8 . 1 . 4 . 1 以感染 RSIV参考株的细胞培养物为阳性对照，以未感染 RSIV 的细胞为阴性对照。 如果阳性对照出现 CPE,阴性对照无 CPE,则实验成立，否则，重新实验。

　　8 . 1 . 4 . 2 如果病毒分离培养中出现 CPE,则判定病毒分离结果阳性。

　　8 . 1 . 4 . 3 如果病毒分离培养和盲传培养没有出现 CPE,则判定病毒分离结果阴性。

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　　8 . 2 聚合酶链式反应

　　8 . 2 . 1 对照设置

　　以已知感染 RSIV或 ISKNV 的鱼采集的组织样品作为阳性对照，以已知未感染 RSIV 或 ISKNV的健康鱼采集的组织样品作为阴性对照。

　　8 . 2 . 2 DNA抽提

　　样品组织加约 10 倍体积灭菌生理盐水匀浆，取 100 μL组织匀浆，或者直接取出现 CPE 的细胞培养液 100 μL,加入到有 500 μLCTAB溶液(见 A.3)的 1.5 mL 离心管中，65 ℃作用 30 min。然后加入20 μL蛋白酶 K(20 mg/mL) , 55 ℃孵育 30 min。继续向离心管中加入 600 μL抽提液 1(见 A.4),震荡混匀 30 s。12 000g离心 5 min,取上层水相(约 600 μL)。加入 600 μL抽提液 2(见 A.5),震荡混匀 30 s。12 000g离心 5 min,小心取上层水相(约 600 μL) 。加入 1 . 5 倍体积的预冷无水乙醇(900 μL) , 上下颠倒混匀后，放置 -20 ℃冰箱 8 h 以上。 然后，12 000g 离心 30 min,弃上清液。 将离心管倒置于吸水纸上吸干残液，37 ℃干燥 20 min。加 11 μL~12 μL水溶解后，作为 PCR模板。

　　可使用等效的商业化试剂盒代替以上方法，操作步骤按照试剂盒操作手册进行。

　　8 . 2 . 3 DNA扩增

　　8 . 2 . 3 . 1 引物的选用

　　在 PCR扩增中，选用引物 1-F 和 1-R,该对引物对 RSIV 和 ISKNV基因组中的部分基因片段均可有效扩增，产物大小为 570 bp(见附录 B) 。

　　8 . 2 . 3 . 2 反应体系

　　反应体系见表 1 。

　　表 1 PCR反应体系(50 μL体系)

　　8 . 2 . 3 . 3 PCR反应条件

　　95 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 60 s, 72 ℃ 60 s, 30 个循环;72 ℃ 延伸 5 min, 4 ℃保存。

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　　8 . 2 . 3 . 4 电泳和基因测序

　　PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像仪观察结果。 如果观察到结果阳性，对 PCR 扩增产物进行基因测序，并将测序结果与参考序列(见附录 B)进行比对，或在 GenBank进行 BLAST 比对分析。

　　8 . 2 . 4 结果判定

　　8 . 2 . 4 . 1 阳性对照样品能够扩增 570 bp 片段，而阴性对照不能扩增出 目 的大小的核酸片段，表明实验成立，否则实验不成立。

　　8 . 2 . 4 . 2 扩增出大小为 570 bp 片段，结合测序结果，判定 PCR结果阳性。

　　8 . 2 . 4 . 3 无扩增或扩增条带大小不是 570 bp,或测序结果不符，则判定 PCR结果阴性。

　　8 . 3 间接荧光抗体实验

　　8 . 3 . 1 对照设置

　　用感染 RSIV参考株的单层细胞作为阳性对照，用未接种任何病毒的单层细胞作为阴性对照。

　　8 . 3 . 2 玻片的制备

　　8 . 3 . 2 . 1 在 8 孔板中置入飞片并加入新鲜 MFF-1 细胞，25 ℃ ~27 ℃培养 24 h制备玻片。

　　8 . 3 . 2 . 2 无菌条件下，将 10 倍稀释的出现 CPE 的细胞培养液接种到 MFF-1 细胞培养孔;同时设立阳性对照和阴性对照;25 ℃ ~27 ℃培养 24 h~72 h。

　　8 . 3 . 2 . 3 吸出细胞培养液，用 PBS(见 A. 6) 漂洗 3 次，然后用预冷固定液(见 A. 7) 漂洗 3 次，取出玻片，空气中干燥 20 min,预冷丙酮固定 10 min。

　　8 . 3 . 2 . 4 待检组织玻片的制备。 放尽鱼血，取脾脏，横切，将组织压抹于载玻片上，制备成玻片。 将玻片在空气中干燥 20 min,预冷丙酮固定 10 min。

　　8 . 3 . 3 玻片的处理和显色

　　8.3.3. 1 用 0.01 mol/L、pH 7.2 的 PBST(见 A.8)将抗 RSIV单克隆抗体稀释到工作浓度。加入稀释后的抗 RSIV 的单克隆抗体，每 2 cm2 细胞加 250 μL。 37 ℃湿盒中孵育 30 min。 用 PBST 清洗玻片3 次 。

　　8.3.3.2 加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠的荧光抗体，每 2 cm2 细胞加 250 μL。 37 ℃湿盒中孵育 30 min。 用 PBST清洗玻片 3 次，然后甘油封片。

　　8 . 3 . 4 观察结果

　　荧光显微镜观察。

　　8 . 3 . 5 结果判定

　　8 . 3 . 5 . 1 阳性对照显示黄绿色荧光，阴性对照无荧光或显示微弱绿色背景荧光，实验成立。

　　8 . 3 . 5 . 2 细胞层或组织样品有特异的黄绿色荧光，整个细胞质充满弥散性的荧光，判定 IFAT 结果阳性。

　　8 . 3 . 5 . 3 细胞层或组织样品只有微弱的绿色背景，判定 IFAT结果阴性。

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　　9 综合判定

　　9 . 1 当被检样品的检测结果符合如下之一时，判定为 RSIVD疑似病例：

　　a) 临床诊断结果阳性。

　　b ) 病毒分离结果阳性。

　　9 . 2 疑似病例，符合下列条件两项时，确诊 RSIVD 阳性：

　　a) 组织样直接 PCR结果阳性。

　　b ) 病毒分离出现 CPE 的细胞培养液 PCR结果阳性。

　　c) 组织样 IFAT试验结果阳性。

　　d) 病毒分离出现 CPE 的细胞培养液 IFAT结果阳性。

　　9 . 3 临床诊断结果阴性的被检样品，检测结果符合下列条件两项时，判定为 RSIV携带者：

　　a) 组织样直接 PCR结果阳性。

　　b ) 病毒分离出现 CPE 的细胞培养液 PCR结果阳性。

　　c) 组织样 IFAT试验结果阳性。

　　d) 病毒分离出现 CPE 的细胞培养液 IFAT结果阳性。

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　　附 录 A (规范性附录)试剂及其配制

　　A.1 吉姆萨染色液及染色方法

　　A.1 . 1 贮备液

　　先将 1 g Giemsa粉置于研钵中，取 66 g甘油并且将少量加入研钵，充分研磨成无颗粒的糊状后，再将剩余甘油加入，搅拌均匀后，放入 56 ℃温箱中 2 h,然后加入 66 mL 甲醇，保存于茶色瓶中，一般两周后使用为好。

　　A.1 . 2 工作液

　　临用时将贮备液与 pH 6 . 8 的磷酸缓冲液按 1 ∶ 20 混合。

　　A.1 . 3 染色方法

　　切片用甲醇固定 5 min, pH 6 . 8 的磷酸缓冲液漂洗，吉姆萨工作液染色 20 min~30 min,染色后的标本在 pH 6 . 8 缓冲液中洗涤后，晾干，然后用显微镜观察。

　　A.2 细胞消化液

　　在 10 L双蒸水中按顺序加入以下试剂：NaCl 80 g; KCl 2 g; KH2 PO4 1 g; Na2 HPO4 · 12H2 O 23 g; EDTA 2 g;胰酶 6 g;NaHCO3 大约 4 g~6 g,调 pH 7.4~8.0, 正压过滤除菌，分装，-20 ℃保存。

　　A.3 CTAB溶液

　　CTAB(hexadecyl trimethy ammonium bromide) ,按 2% CTAB, 1.4 mol/L NaCl, 20.0 mmol/L EDTA, 20.0 mol/L Tris-HCl 缓冲液 pH 7.5 配制，用前加巯基乙醇到终浓度为 0.25%。

　　A.4 抽提液 1

　　酚/三氯甲烷/异戊醇，用 1.0 mol/L pH (7.9±0.2) Tris 饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶异戊醇按 25 ∶ 24 ∶ 1 的

　　比例混合，密闭避光保存。

　　A.5 抽提液 2

　　三氯甲烷/异戊醇，将三氯甲烷和异戊醇按 24 ∶ 1 的比例混合，密闭避光保存。

　　A.6 0.0 1 moL/L PBS(PH 7.2~7.4)

　　取 Na2 HPO4(1.19 g)、NaH2 PO4(0.22 g) 和 NaCl(8.50 g)加入 800 mL去离子水中，充分搅拌溶解

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　　后，定容至 1 000 mL, 4 ℃保存。

　　A.7 固定液

　　30%丙酮/70%乙醇(体积比)的混合物。

　　A.8 PBST

　　含 0.05% 吐温 80 的 PBS溶液。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　引物 1-F和 1-R 扩增 RSIV基因组的 unknown基因部分序列

　　其中带下划线的基因片段为扩增引物。