GB/T 36190-2018 草鱼出血病诊断规程

　　ICS 65 . 020 . 30 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 36190—2018

　　草鱼出血病诊断规程

　　protocolofdiagnosticmethodsforhemorrhagicdiseaseofgrasscarp

　　2018-05-14 发布 2018-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 36190—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

　　本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC 156)归口 。

　　本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所、中国检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：沈锦玉、潘晓艺、郝贵杰、徐洋、江育林、陈爱平、高隆英、袁雪梅、尹文林、姚嘉赞、蔺凌云。

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　　草鱼出血病诊断规程

　　1 范围

　　本标准规定了草鱼出血病诊断的临床症状、采样、病毒分离和鉴定以及综合判定。

　　本标准适用于草鱼出血病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 18088 出入境动物检疫采样

　　SC/T 7016 . 3 鱼类细胞系 第 3 部分：草鱼卵巢细胞系(CO)

　　SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　AMV：鸟类成髓细胞性白血病病毒(avian myeloblastosis virus)

　　bp：碱基对(base pair)

　　cDNA：互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid)

　　CO：草鱼卵巢细胞系(grass carp ovary cell line)

　　CPE：细胞病变效应(cytopathic effect)

　　CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)

　　dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)

　　dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)

　　dCTP：脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)

　　dGTP：脱氧鸟苷三磷酸三钠(deoxyaguanosine triphosphate)

　　dTTP：脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)

　　EB：溴化乙啶(ethidium bromide)

　　EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)

　　ELISA：酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay)

　　FBS：胎牛血清(fetal bovine serum)

　　GCRV：草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus)

　　HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸 [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid]

　　HRP：辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)

　　MCP：主要衣壳蛋白(major capsid protein)

　　PBST：磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffer solution-tween-20)

　　RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction)

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　　RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)

　　SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel e- lectrophoresis)

　　TBE：三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液(Tris-Borate-EDTA)

　　4 试剂和材料

　　4 . 1 琼脂糖：电泳级。

　　4 . 2 邻苯二胺：分析纯。

　　4.3 AMV逆转录酶：10 U/μL,-20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

　　4.4 RNA 酶抑制剂(RNase Inhibitor) : -20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。

　　4 . 5 dNTP：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/ L, -20 ℃保存。

　　4.6 Taq酶：10 U/μL,保存温度为-20 ℃ ,同时应避免反复冻融或温度剧烈变化。

　　4.7 无水乙醇：分析纯，使用前预冷到-20 ℃。

　　4 . 8 DNA分子量标准：DNA Marker 2000 , 4 ℃保存。

　　4.9 辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠抗体：-20 ℃保存。

　　4 . 10 过氧化氢：分析纯。

　　4. 1 1 GCRV 参考株：GCRV 873 株(GCRV Ⅰ 型)、GCRV 9014 株(GCRV Ⅱ 型)、GCRV HB1007 株(GCRV Ⅲ型)。

　　注 ：由农业部相关部门指定机构提供。

　　4 . 12 羊抗 GCRV免疫球蛋白：-20 ℃保存。

　　注 ：由动物防疫管理部门指定单位提供。

　　4. 13 鼠抗 GCRV单克隆抗体：-20 ℃保存。

　　注 ：由动物防疫管理部门指定单位提供。

　　4 . 14 鱼类细胞系：CO 应符合 SC/T 7016 . 3 的规定。

　　4 . 15 水：GB/T 6682 中一级水，核酸抽提和 RT-PCR须使用无 RNA 酶的去离子水。

　　4 . 16 鱼类细胞培养液：用含厄尔平衡盐(Earle’s balanced salts) 的 M 199 培养基配制(见附录 A 中A.1) ,或其他商品化的细胞培养基，另加 10%胎牛血清(FBS)。

　　4 . 17 鱼类细胞维持液：用含厄尔平衡盐(Earle’s balanced salts)的 M 199 培养基配制，另加 2%胎牛血清(FBS) 。

　　4 . 18 细胞消化液：见 A. 2 。

　　4. 19 AMV逆转录酶缓冲液和 Taq酶缓冲液：分别见 A.6、A.7。

　　4 . 20 电泳缓冲液：TBE 电泳缓冲液(5 倍浓缩液，见 A. 8) 。

　　4.2 1 MgCl2 : 25 mmol/L,保存温度为-20 ℃。

　　4.22 包被稀释液：为 0.05 mol/L、pH= 9.6 的碳酸盐缓冲液(见 A.11)。

　　4 .23 封闭液：1%明胶(用包被稀释液配制)。

　　4 . 24 终止液：2 mol/ L 的硫酸。

　　4.25 依据 GCRV I 型中 S 10 片段序列设计引物，扩增 S 10 中的 698 bp 片段(见附录 B 中 B.1) :

　　10 μmol/L 正向引物：5 -CCCCG-ATCAT-CACCA-CGAT-3′;

　　10 μmol/L 反向引物：5 -CGCGT-TCGCT-GATGA-AAGG-3′。

　　4.26 依据 GCRV II 型的 M 6 片段序列设计引物，扩增 M 6 中的 320 bp 片段(见 B.2) :

　　10 μmol/L 正向引物：5′-AGTTC-TCAAA-GCTGA-GACAG-3′;

　　10 μmol/L 反向引物：5 -ACGTG-CGATT-GGAAG-AGCTT-3′。

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　　4.27 依据 GCRV III 型的 L 2 片段序列设计引物，扩增 L 2 中的 474 bp 片段(见 B.3) :

　　10 μmol/L 正向引物：5 ′-GTAAG-CCCAC-AGGTC-CCACT-3′;

　　10 μmol/L 反向引物：5 ′-AGATG-ACCCA-AGGAA-TAGCA-GT-3′。

　　5 器材和设备

　　5 . 1 倒置显微镜。

　　5 . 2 生化培养箱。

　　5 . 3 普通冰箱和超低温冰箱。

　　5 . 4 组织研磨器。

　　5 . 5 冷冻离心机。

　　5 . 6 生物安全柜或超净工作台。

　　5 . 7 PCR仪 。

　　5 . 8 电泳仪、水平电泳槽和垂直电泳槽。

　　5 . 9 微量移液器。

　　5 . 10 凝胶成像仪或紫外透射仪。

　　5 . 1 1 高压灭菌锅。

　　5 . 12 微波炉。

　　5 . 13 水浴锅 。

　　5 . 14 制冰机 。

　　5 . 15 磁力搅拌器。

　　5 . 16 过滤系统。

　　5 . 17 酶标仪和洗板机。

　　6 临床症状

　　病鱼眼球突出、体色发黑，口腔、鳃盖和鳍条基部出血。 撕开表皮，可见肌肉出现点状或块状出血。剖检腹腔，可见肠道充血，肝、脾充血或因失血而发白。 根据出血部位可将此病分为“红肌肉”“红肠子” “红鳍红鳃盖”三类。 病鱼可以有其中一种或几种临床症状。

　　7 采样

　　7 . 1 采样对象

　　草鱼、青鱼等易感鱼类。

　　7 . 2 采样数量

　　采样数量应符合 SC/T 7103 的要求。

　　7 . 3 样品采集

　　按 GB/T 18088 的规定执行，体长 ≤4 cm 的鱼去尾后取整条(尾)鱼;体长为 4 cm~6 cm(含)的鱼，取脑、内脏(包括肾);体长>6 cm 的鱼则取脑、肝、肾和脾。

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　　8 病毒分离和鉴定

　　8 . 1 病毒分离培养

　　8 . 1 . 1 样品处理

　　最多每 5 尾鱼设为 1 个合并样，将样品匀浆成糊状，用含 1 000 IU/mL 青霉素和 1 000 μg/mL 链霉素的鱼类细胞培养液按 1 ∶ 10 稀释。置于 25 ℃下孵育 2 h~4 h 或 4 ℃下孵育过夜后 8 000 × g离心20 min,收集上清液。

　　8 . 1 . 2 病毒分离

　　对 1 ∶ 10 的组织匀浆上清液再作两次 10 倍稀释。然后将 1 ∶ 10、1 ∶ 100 和 1 ∶ 1 000 三个稀释度的上清液各 100 μL分别接种到生长约 24 h 的 CO(见图 B.1)单层细胞的 96 孔板中，25 ℃吸附 1 h 后，加入细胞维持液，置于 25 ℃ ±2 ℃培养 7 d。试验中设 2 孔阳性对照即接种 GCRV 873 株和 2 孔空白

　　对照即未接种病毒的细胞。

　　7 d 内每天用 40 倍和 100 倍倒置显微镜检查。空白对照细胞形态应保持正常，阳性对照细胞应出

　　现 CPE。 若接种了被检匀浆上清稀释液的 CO 细胞出现 CPE(见图 B. 2)时，应立即进行 GCRV 鉴定;若无 CPE 出现，则需盲传 1 次 。盲传时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融 1 次，以

　　8 000 × g，4 ℃离心 20 min,收集上清液。将 100 μL上清液接种到新鲜单层细胞的 96 孔板中，25 ℃ ± 2 ℃培养 7 d。期间每天用 40 倍和 100 倍倒置显微镜检查。盲传后仍无 CPE 出现，则仍然需要做进一步鉴定。不同基因型 GCRV感染敏感细胞后表现出的 CPE 特征为：GCRV 873(GCRV Ⅰ 型代表株)能在 CO 等草鱼敏感细胞系中大量增殖并出现 CPE; GCRV 9014(GCRV Ⅱ 型代表株)能在 CO 等草鱼敏感细胞 系 中大量增殖，但不产生 CPE; GCRV HB1007 株 (GCRV Ⅲ 型代表株)很少存在，也不产

　　生 CPE。

　　8 . 1 . 3 病毒分离结果判定

　　有临床症状的鱼，检测样品上清液接种细胞后，若出现 CPE,可判断为疑似携带 GCRV Ⅰ 型或GCRV Ⅲ型。

　　8 . 2 RT-PCR

　　8 . 2 . 1 RNA提取

　　8 . 2 . 1 . 1 对照设置

　　在样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。

　　— 取含有 GCRV 873 参考株和 GCRV HB1007 参考株细胞悬液，同时取含有 GCRV 9014 参考株细胞悬液或含有病毒 目 的片段的非感染性体外转录 RNA作为阳性对照;

　　— 取正常的细胞悬液作为阴性对照;

　　— 取等体积的水代替模板作为空白对照。

　　8 . 2 . 1 . 2 样品处理

　　将 450 μL 细胞悬液或组织匀浆上清液放入 1.5 mL 的离心管，再加入 450 μL CTAB溶液(见 A.3)并混匀，25 ℃作用 2 h~2.5 h。

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　　8 . 2 . 1 . 3 RNA抽提

　　在含有 900 μL样品处理液的离心管中加入 600 μL 抽提液 Ⅱ(见 A. 5) , 用力混合至少 30 s。 12 000 r/min、4 ℃离心 5 min,小心吸取上层水相(约 800 μL)于新离心管中。再加入 700 μL抽提液 Ⅰ (见 A.4) , 用力混合至少 30 s。12 000 r/min、4 ℃离心 5 min,小心吸取上层水相(约 600 μL)于新离心管中。再加入-20 ℃预冷的 1.5 倍体积的无水乙醇(约 900 μL) ,倒置数次混匀后，- 20 ℃ 8 h 以上沉淀核酸。12 000 r/min、4 ℃离心 30 min,小心弃去上清。沉淀干燥后加 11 μL 无 RNA 酶的去离子水

　　溶解，用作 RT-PCR模板。

　　也可以采用商品试剂盒抽提病毒核酸，其方法按商品说明书进行。

　　提取的 RNA应在 2 h 内进行 RT-PCR扩增;若需长期保存应置于-80 ℃冰箱中。

　　8 . 2 . 2 RT-PCR扩增

　　8 . 2 . 2 . 1 CDNA合成

　　根据样品数量 N，在离心管中分别加入 4.17、4.18 和 4.19 中的每条引物各 N × 1 μL,混匀制成N× 6 μL 的引物预混液。在另一只离心管中，分别加入 N × 5 μL 5 倍逆转录酶缓冲液(见 A.6)、N × 2 μL dNTP、N × 0.5 μL 40 U/μL 的 RNA 酶抑制剂、N× 1 μL 10 U/μL 的 AMV逆转录酶和 N × 0.5 μL无RNA 酶的去离子水，混匀制成 N × 9 μL 的反转录预混液。

　　在 PCR 反应管中加入 10 μL 模板，再加入上述引物预混液 6μL, 至总体积 16 μL。94 ℃ 变性5 min。立即冰浴，低速离心约 5 s,使液体集中在底部。在上述 PCR 反应管中，再加入 9 μL 的反转录预混液，至总体积 25 μL。45 ℃反应 60 min 以合成 cDNA。

　　8 . 2 . 2 . 2 DNA扩增

　　根据样品数量 N，在离心管中分别加入 N × 2.5 μL 10 倍 Taq酶用浓缩缓冲液(见 A.7)、N × 2 μL 25 mmol/L 的 MgCl2 、N× 2 μL dNTP、三对引物每种各 N × 1 μL、N× 0.5 μL 10 U/μL 的 Taq酶、N × 7 μL无 RNA 酶的去离子水，混匀后按每 PCR 反应管 20 μL分装，最后在各 PCR反应管中分别加入8.2.2.1 合成的 cDNA 5 μL,使得各管总体积 25 μL。如果 PCR仪没有热盖，每管还需加入 50 μL 矿物油。低速离心 5 s,以使试剂集中在底部。再将反应管置于 PCR扩增仪中。94 ℃预变性 4 min,再按以下程序进行扩增反应：94 ℃ 40 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 min, 35 个循环;72 ℃延伸 8 min, 4 ℃保温。

　　8 . 2 . 3 琼脂糖电泳

　　用 1×TBE缓冲液(见 A.8)制备 2%的琼脂糖(含 0.5 μg/mL EB,见 A.9)凝胶平板。将其放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面，将 6 μL PCR 扩增产物和 2 μL 样品缓冲液(见 A.10)混匀后加入样品孔。在电泳时设立 DNA分子量标准。5 V/cm 电泳约 0.5 h,当溴酚蓝到达底部时停止，在紫外

　　透射仪或凝胶成像仪下观察。

　　8 . 2 . 4 结果判定

　　电泳后经观察 GCRV 873 参考株阳性对照应出现 698 bp(见图 B.3 1-3 泳道)，或 GCRV 9014 参考株阳性对照应出现 320 bp(见图 B.3 4-6 泳道)，或 GCRV HB1007 参考株阳性对照应出现 474 bp(见图

　　B. 3 7-9 泳道)的 DNA 片段，阴性对照和空白对照均无该核酸带。

　　待测样品 RT-PCR 扩增后能在相应 698 bp DNA位置上有带，或者能在相应 320 bp 位置上有带，或者能在相应 474 bp 位置上有带，均可判为 PCR 阳性。无带或带的大小不是 698 bp、320 bp 和 474 bp

　　的均判为 PCR 阴性。

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　　阳性对照无特定条带出现或阴性对照或空白对照有条带出现都表明 PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。

　　8 . 3 直接电泳检测病毒核酸

　　8 . 3 . 1 RNA抽提

　　采用 8 . 2 . 1 的方法抽提获得病毒 RNA。

　　8 . 3 . 2 核酸电泳

　　按常规方法配制 5%~9%的 SDS-PAGE 胶做垂直电泳，电泳结束后用常规方法银染或者 EB 染

　　色，观察电泳结果。

　　8 . 3 . 3 结果判定

　　GCRV 基因组 RNA 电泳后能看到 11 条核酸带，根据片断长度大小，11 个片段可分为 3 组，即 3 条

　　大片段(L1~L3,大小分别约为 4. 0 kb~ 3. 5 kb)、3 条中等片段( M4~M6,大小分别约为 2. 5 kb~ 2.0 kb)和 5 条小片段(S7~S11,大小分别约为 1.5 kb~0.7 kb) ,当样品 RNA SDS-PAGE 胶做垂直电

　　泳能看到明显的 11 个核酸带时可判定为阳性(见图 B. 4) 。

　　8 . 4 ELISA检测

　　8 . 4 . 1 包被

　　用 pH 9.6 的包被稀释液(见 A.11)按照说明书指示适量稀释纯化的羊抗 GCRV免疫球蛋白(Ig)包被 ELISA 板，每孔 100 μL。4 ℃孵育过夜。次 日用含 0. 05% 表面活性剂 吐温-20 ( Tween-20) 的

　　0 . 01 mol/ L PBS(PBST,见 A. 13)洗 3 次 。

　　8 . 4 . 2 封闭

　　用 1%明胶(溶于 PBST 中)封闭，每孔 200 μL。37 ℃反应 1.5 h 后，PBST洗 1 次。

　　8 . 4 . 3 加样

　　加入待测的样品，GCRV 阳性对照和阴性对照，每孔 100 μL, 37 ℃反应 2 h。PBST洗 3 次。

　　8 . 4 . 4 加单抗

　　按照说明书要求加稀释到一定浓度的鼠抗 GCRV 单克隆抗体到小孔中，每孔 100 μL, 37 ℃反应1 . 5 h。PBST洗 2 次 。

　　8 . 4 . 5 去除非特异性

　　加入 0.1% H2 O2(用蒸馏水稀释)，去除非特异性过氧化物酶。每孔 150 μL, 37 ℃反应 15 min。

　　PBST洗 2 次 。

　　8 . 4 . 6 加酶标抗抗体

　　加入标记辣根过氧化物酶的抗鼠 IgG 抗体(酶标二抗)，每孔 100 μL, 37 ℃反应 1. 5 h。PBST 洗

　　3 次 。

　　8 . 4 . 7 加底物显色

　　加入底物(见 A.16) ,每孔 100 μL, 37 ℃反应。当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照无色时加入终

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　　止液，在 450 nm 波长下读取结果。底物改用邻苯二胺(OPD)或其他底物，应改用 490 nm 或相应波长

　　测量。

　　8 . 4 . 8 结果判定

　　测量各孔的光吸收值后，计算 P/N值。如果阳性对照孔 P/N≥2.1,表明对照成立。再计算待测样品孔的 P/N值。当 P/N≥2.1 时判为 GCRV 阳性。当 P/N<2.1 时判为 GCRV 阴性。

　　注：按公式 P/N=(待检测孔-空白对照)/(阴性对照-空白对照)。

　　9 综合判定

　　9 . 1 确诊病例的判定

　　易感鱼类在发病条件下出现典型临床症状，且经过细胞分离病毒后，无论是否出现 CPE,用 RT- PCR、ELISA、直接电泳检测病毒核酸方法中的一种，其结果为阳性即可确诊为草鱼出血病;如果直接将病鱼组织匀浆上清液用 RT-PCR、ELISA、直接电泳检测病毒核酸方法中的一种，其结果为阳性即可确诊为草鱼出血病。

　　9 . 2 疑似携带或携带草鱼呼肠孤病毒的判定

　　9 . 2 . 1 疑似携带草鱼呼肠孤病毒的判定

　　无临床症状或临床症状不典型的鱼类，但能直接从鱼组织匀浆上清液中用 RT-PCR、ELISA 或者RNA直接电泳观察核酸带中任何一项结果为阳性，即可判断为疑似携带草鱼呼肠孤病毒。

　　9 . 2 . 2 携带草鱼呼肠孤病毒的判定

　　无临床症状或临床症状不典型的鱼类，但能直接从鱼组织匀浆上清液中用 RT-PCR、ELISA 或者RNA直接电泳观察核酸带中其中二项为阳性，或者经过细胞分离病毒后，用 PCR、ELISA 或 RNA 直接电泳观察 11 条核酸带中任何一项结果为阳性，即可判断为携带草鱼呼肠孤病毒。

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　　附 录 A (规范性附录)试剂及其配制

　　A.1 细胞培养液

　　按 M199 培养基(含 Earle’s 盐)说明书的要求，用一级水配制，然后加入 10%经 56 ℃ 30 min灭活的胎牛血清，用碳酸氢钠粉末调节培养液 pH 为 7.2~7.4。过滤除菌，分装后-20 ℃保存。在开放系统使用时，需要加入过滤除菌的 HEPES,使其在培养液中的终浓度为 0.02 mol/L。

　　A.2 细胞消化液

　　在 1 L灭菌去离子水中，顺序加入氯化钠 8 g、氯化钾 0.2 g、磷酸二氢钾 0.1 g、十二水合磷酸氢二钠2.3 g、乙二胺四乙酸 0.2 g、胰酶 0.6 g、碳酸氢钠 0.4 g~0.6 g,使 pH 为 7.4~8.0。完全溶解后过滤除菌，分装，-20 ℃保存。

　　A.3 CTAB溶液

　　含 CTAB 2% ,氯化钠 1.4 mol/L,乙二胺四乙酸 20 mmol/L, Tris-HCl 20 mmol/L, pH 7.5(配制方法为，在 60 mL水中顺序加入氯化钠 8.19 g,乙二胺四乙酸 0.744 g, Tris 1.21 g、浓盐酸 0.25 mL~

　　0.3 mL,使 pH 7.5~8.0,再加入 CTAB 2 g,完全溶解后加水至 100 mL)。CTAB溶液使用之前加巯基

　　乙醇至终浓度为 0 .25% 。

　　A.4 抽提液 Ⅰ

　　三氯甲烷 ∶ 异戊醇按 24 ∶ 1 的比例混合，密闭避光保存。

　　A.5 抽提液 Ⅱ

　　1 mol/L Tris 水溶液饱和的酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇按 25 ∶ 24 ∶ 1 混合，密闭避光保存。

　　A.6 AMV逆转录酶缓冲液(5 倍浓缩液)

　　分别用 Tris-HCl (pH 8.3) 1 000 mmol/L、氯化钾 1 000 mmol/L、氯化镁 250 mmol/L、二硫苏糖醇 250 mmol/L等体积混合，-20 ℃保存。

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　　A.7 Taq酶缓冲液( 10 倍浓缩液)

　　分别用浓度为 1 500 mmol/L 的 Tris-HCl(pH 8.8)、1 500 mmol/L 的氯化钾和 3%的 TritonX-100水溶液等体积混匀配制而成，-20 ℃保存。

　　A.8 TBE 电泳缓冲液(5 倍浓缩液)

　　在 1 000 mL水中，分别加入 Tris 54 g、硼酸 27.5 g、乙二胺四乙酸 2.922 g,用 5 mol/L 的盐酸调pH 至 8.0。

　　A.9 EB浓缩液

　　用水配制成 5 mg/mL 的 EB浓缩液。用时每 10 mL 电泳液或琼脂中加 1 μL。

　　A.10 样品缓冲液

　　每 100 mL水溶液中含溴酚蓝 0.25 g,蔗糖 40 g。

　　A.1 1 包被稀释液(PH=9.6)

　　在 1 000 mL水中，分别加入碳酸钠 1.59 g、碳酸氢钠 2.93 g,充分搅拌完全溶解后，4 ℃保存。

　　A.12 0.0 1 mol/L PBS(PH=7.4)

　　在 1 000 mL水中，分别加入碳酸氢二钠 1.19 g、碳酸二氢钠 0.22 g、氯化钠 8.50 g,充分搅拌完全溶解后，4 ℃保存。

　　A.13 PBST洗涤液(PH=7.4)

　　在 1 000 mL水中，分别加入氯化钠 8.0 g、十二水合磷酸氢二钠 2.9 g、磷酸二氢钾 0.2 g、氯化钾

　　0.2 g、吐温-20 0.5 mL,充分搅拌完全溶解后，4 ℃保存。

　　A.14 四甲基联苯胺储存液

　　在 25 mL N, N-二甲基甲酰胺中加入 3 , 3′, 5 , 5′-四甲基联苯胺(TMB) 250 mg,充分搅拌完全溶解后，4 ℃保存。

　　A.15 底物缓冲液(PH=5.0)

　　在 100 mL蒸馏水中加入一水合柠檬酸 1.02 g、十二水磷酸氢二钠 3.68 g,充分搅拌完全溶解后，

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　　4 ℃保存。

　　A.16 底物

　　在 10 mL底物缓冲液中，分别加入四甲基联苯胺储存液 0. 1 mL、30%H2 O2 5 μL,充分混匀后，现

　　配现用。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　GCRV扩增产物参考序列及其核酸 1 1 条带电泳图和细胞、CPE形态

　　本附录给出了 GCRV扩增产物的参考序列，其中方框处为引物位置。 同时给出了病毒核酸 11 条带的电泳图。 同时给出了细胞 CO 正常图及其接种 GCRV后所出现的 CPE。

　　B.1 GCRV 873 株第 10 条带(S10)的部分序列，PCR扩增其中的 698 bp片段。

　　B.2 GCRV 90 14 株第 6 条带(M6)的部分序列，PCR扩增其中的 320 bp片段。

　　GB/T 36190—2018

　　B.3 GCRV HB1007 株第 2 条带(L2)的部分序列，PCR扩增其中的 474 bp片段。

　　B.4 正常的 CO及其接种 GCRV产生的 CPE形态图(见图 B.1 和图 B.2)。

　　图 B.1 正常的 CO

　　图 B.2 CO接种 GCRV 873 株后出现的 CPE形态

　　GB/T 36190—2018

　　B.5 RT-PCR后的电泳图和 GCRV核酸 1 1 条带的电泳图(见图 B.3 和图 B.4) 。

　　说明：

　　N：阴性对照;1-3 : 873 株;4-6 : 9014 株;7-9 : HB1007 株;NT：空白对照 。

　　图 B.3 GVRV经 PCR后的 2%琼脂糖电泳图谱

　　图 B.4 GCRV三种基因型毒株核酸 7% SDS-PAGE电泳图谱(由水科院珠江所提供)