GB/T 35543-2017 核糖核酸酶A

　　ICS 07 . 080 C 27

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35543—2017

　　核 糖 核 酸 酶 A

　　RibonucleaseA

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35543—20 17

　　GB/T 35543—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG 11)归口 。

　　本标准起草单位：福建南生科技有限公司、福建华灿制药有限公司、山东大学、北京化工大学、华灿南生(厦门)生物技术有限公司、复旦大学、海狸纳米科技(苏州)有限公司、安琪酵母股份有限公司、上海博仕生物科技有限公司、中国农业大学、福建农林大学、苏州大学、上海百赛生物科技有限公司。

　　本标准主要起草 人：黄 发 灿、郑 登 忠、徐 宁 龙、詹 学 雄、陈 秀 兰、曾 令 坤、陈 劲 春、赵 晶、章 丽 丽、黄发喜、王光煌、钟江、姚娟、刘斌、任辉、张熙颖、邢志刚、朱力、李全宏、邓丽君。

　　GB/T 35543—20 17

　　引 言

　　核糖核酸酶 A来源于牛胰腺，是核酸内切酶，能催化 RNA 降解，能改变宿主细胞新陈代谢，抑制病毒合成，但对 DNA不起作用，可以用来去除 DNA制品中的污染 RNA。 制订核糖核酸酶 A 国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于核糖核酸酶 A 的生产和使用具有重要的意义。

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　　核 糖 核 酸 酶 A

　　1 范围

　　本标准规定了核糖核酸酶 A 的技术要求、检验方法、包装、运输、贮存和保质期。

　　本标准适用于从牛胰腺中提取的核糖核酸酶 A。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 191 包装储运图示标志

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　核糖核酸酶 A ribonucleaseA

　　一种核酸内切酶，能切开 RNA分子内嘧啶碱基(U 和 C)处的 3′,5′-磷酸二酯键，形成具有 2′,3′-环磷酸衍生物寡聚核苷酸。

　　3.2

　　核糖核酸酶 A活力单位 activityunitofribonucleaseA

　　以过量的酵母 tRNA 为底物，在 37 ℃ , pH5 . 0 条件下，每毫升反应液里每分钟 260 nm 处吸光度值增加 1 . 0 所需的酶量为 1 活力单位，即 1 Facan unit。

　　注：50 Facan unit≈1 kunitz unit。

　　4 技术要求

　　4 . 1 外观

　　白色或类白色粉末。

　　4 . 2 酶活(比活力)

　　≥3 500 Facan unit/mg蛋白。

　　4 . 3 杂质

　　不应含有其他核酸内切酶和核酸外切酶。

　　5 检验方法

　　5 . 1 外观

　　直接或将样品倒入无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。

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　　5 . 2 酶活

　　依据附录 A 的方法进行检测。

　　5 . 3 杂质

　　5 . 3 . 1 其他核酸内切酶

　　依据附录 B 的方法进行检测。

　　5 . 3 . 2 核酸外切酶

　　依据附录 C 的方法进行检测。

　　6 包装、运输及贮存

　　6 . 1 包装

　　内包装材料应洁净无污染，封口应严密，无泄漏。 外包装箱储运图示标志应符合 GB/T 191 的规定。

　　6 . 2 运输

　　产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防护措施避免倒置及破损。 不宜与有毒、有害、有异味物品混运。

　　6 . 3 贮存

　　应在温度低于 -20 ℃的条件下储存。

　　7 保质期

　　在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为三年;超过保质期，使用前应检测酶活。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　核糖核酸酶 A 酶活检测

　　A.1 仪器

　　紫外分光光度计。

　　A.2 溶液和样品配制

　　A.2. 1 0.1 mol/L醋酸钠(pH5.0)溶液配制：称取 8.203 g 醋酸钠，加适量纯化水溶解，用 0.5 mol/L 的醋酸调节 pH 至 5 . 0,定容至 1 000 mL, 即得。

　　A.2 . 2 25%高氯酸 +0 . 75%醋酸铀溶液配制：量取 25 mL 高氯酸，称取 0 . 75 g 醋酸铀，用纯化水溶解，并定容至 100 mL, 即得。

　　A.2.3 5%酵母 tRNA溶液配制：称取 0.5 g 酵母 RNA,用 0.1 mol/L醋酸钠(pH5.0)溶液溶解，并定容至 10 mL, 即得。

　　A.2 . 4 核糖核酸酶 A溶液配制：精密取称 10 mg核糖核酸酶 A,用 0 . 1 mol/L醋酸钠(pH5 . 0)溶液，并定容至 10 mL,检测前再用 0 . 1 mol/L醋酸钠(pH5 . 0)溶液稀释成每毫升含 4 μg蛋白的待测定溶液。

　　A.3 试验步骤

　　A.3. 1 取 3 支 2 mL 离心管，分别加入 500 μL 的 5%酵母 tRNA 溶液，置 37 ℃ ± 0. 5 ℃水浴，温孵 5 min~8 min后，再分别加入 500 μL 的 4 μg/mL 的核糖核酸酶 A,立即摇匀，计时，5 min后再分别加入500 μL 的 25%高氯酸 +0 . 75%醋酸铀溶液，立即摇匀，终止反应，将离心管置冰浴中，5 min 后取出，置离心机 12 000 r/min离心 10 min,取上清液用纯化水稀释 60 倍，作为样品测定液。

　　A.3.2 另取 1 支 2 mL 离心管，依次加入 500 μL 的 5%酵母 tRNA 溶液、500 μL 的 25%高氯酸+

　　0 . 75%醋酸铀溶液，摇匀，再加入 500 μL 的 4 μg/mL 的核糖核酸酶 A,再摇匀，“将离心管置冰浴中至用纯化水稀释 60 倍”同 A. 3 . 1 的“将离心管置冰浴中”至“用纯化水稀释 60 倍”操作，稀释液作为阴性对照液。

　　A.3 . 3 以阴性对照液作为对照，测定样品测定液 260 nm 的吸光值。

　　A.4 酶活计算

　　以每毫克样品(蛋白)所含的 Facan unit 数 S 表示，数值以 Facan unit/mg 蛋白表示，按式(A. 1)

　　计算：

　　S …………………………( A.1 )

　　式中：

　　A260nm —上清液在波长 260 nm下测得的吸光值;

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　　D — 酶液的稀释倍数，90 ;

　　c —核糖核酸酶 A 的浓度，单位为微克蛋白每毫升(μg蛋白/mL) ,c=4 μg蛋白/mL; V —核糖核酸酶 A酶体积，单位为微升(μL) ,V= 500 μL;

　　t —反应时间，单位为分(min) ,t= 5 min。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)核酸内切酶检测

　　B.1 原理

　　pUC19 质粒为环状结构，核酸内切酶能破坏环状结构，两者电泳谱带不一致。

　　B.2 仪器

　　B.2 . 1 电泳仪，备电泳槽。

　　B.2 . 2 分析天平(万分之一)。

　　B.2 . 3 紫外透光分析仪。

　　B.3 实验步骤

　　B.3. 1 pUC19 质粒反应

　　B.3. 1 . 1 在测试管里先后加入 4 μL pUC19 质粒 DNA(1 μg/μL)、14 μL纯化水、2 μL酶，振荡器混匀，水浴 1 h ;

　　B.3. 1 .2 在对照管里先后加入 4 μL pUC19 质粒 DNA(1 μg/μL)、16 μL 纯化水，振荡器混匀，水浴1 h 。

　　B.3 . 2 电泳

　　1%~1 . 5%琼脂糖凝胶，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　B.4 结果判断

　　在电泳板上，肉眼观察。 若测试管和对照管的谱带一致，则判定样品中不含内切酶;若不一致，则判定样品中含有内切酶。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)核酸外切酶检测

　　C.1 原理

　　cccpUC19 所含经 BamH Ⅰ 位点居于编码 LacZ 的 α互补肽上，cccpUC19 经 BamH Ⅰ 酶切后，由环

　　形 DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链 DNA,其末端突出部分由五个碱基形成单链，极易受核酸外切酶作用。 若样品存在核酸外切酶时，黏性末端易受外切酶切割，再经 T4 DNA 连接酶连接，其电泳条带位置不一致。

　　C.2 仪器和设备

　　C.2. 1 恒温水浴槽。

　　C.2.2 台式离心机。

　　C.2.3 超净工作台。

　　C.2.4 电泳仪。

　　C.3 材料

　　C.3. 1 高纯 cccpUC19 DNA。

　　C.3.2 T4 DNA连接酶。

　　C.3.3 氯仿-异戊醇(24 ∶ 1,体积比)。

　　C.3.4 琼脂糖。

　　C.4 实验步骤

　　C.4 . 1 长时程过量酶切

　　各取 5 μg 高纯 cccpUC19 DNA置于两支 eppondorf管，分别标记阴性对照和测试管，在阴性对照管里加入 10 μL 10 × BamH Ⅰ 缓冲液，2 μL 限制性内切酶 BamH Ⅰ ( 10 U~ 20 U), 加入纯化水至100 μL;在测试管里加入 10 μL 10 × BamH Ⅰ 缓冲液，2 μL 限制性内切酶 BamH Ⅰ (10 U~20U) , 5 μL核糖核酸酶 A样品(50 U~100 U),加入纯化水至 100 μL。 混匀，37 ℃水浴 10 h,各取出 20 μL,分别标记 1 号、2 号，待电泳检测;再各取 20 μL,分别标记 3 号、4 号 。

　　C.4 . 2 电泳

　　C.4.2. 1 取出 1 号和 2 号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。

　　C.4.2.2 1%~1.5%琼脂糖，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取

　　出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　C.4 . 3 连接

　　C.4 . 3 . 1 回收 DNA

　　取出 3 号、4 号管，各加入 20 μL氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出 DNA,并真空干燥样品。

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　　C.4 . 3 . 2 连接反应

　　每管加入 2 μL 10×T4DNA连接酶缓冲液，2 U T4DNA连接酶，加入纯化水至 20 μL,混匀，15 ℃水浴 8 h。

　　C.4 . 3 . 3 电泳

　　C.4.3.3. 1 取出 3 号和 4 号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。

　　C.4.3.3.2 1%~1.5%琼脂糖，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，

　　取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　C.5 结果判定

　　在电泳板上，肉眼观察。 若 1 号和 2 号的谱带一致，3 号和 4 号的谱带一致，则判定样品中不含核酸外切酶;若 1 号和 2 号的谱带不一致或(和)3 号和 4 号的谱带不一致，则判定样品中含核酸外切酶。