GB/T 35541-2017 pfu DNA聚合酶

　　ICS 07 . 080 C 27

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35541—2017

　　pfuDNA聚合酶

　　pfuDNA polymerase

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35541—20 17

　　GB/T 35541—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG 11)归口 。

　　本标准起草单位：厦门致善生物科技股份有限公司、福建华灿制药有限公司、福建南生科技有限公司、深圳华因康基因科技有限公司、华灿南生(厦门)生物技术有限公司、中国科学院微生物研究所、厦门大学、北京化工大学、山东大学、复旦大学、海狸纳米科技(苏州)有限公司、上海博仕生物科技有限公司、安琪酵母股份有限公司、中国农业大学、福建农林大学、上海百赛生物科技有限公司。

　　本标准主要起草人：宋娜杰、黄发灿、郑登忠、何 昌 华、詹 学 雄、李 庆 阁、赵 晶、李 全 宏、盛 司 潼、陈劲春、陈秀兰、钟江、刘斌、姚娟、任辉、邢志刚、黄发喜、张熙颖、邓丽君、章丽丽。

　　GB/T 35541—20 17

　　引

　　言

　　pfu DNA聚合酶来源于耐热球菌(pyrococcusfariosus)，具有极高的热稳定性和保真性，被广泛应用于常规分子生物学实验。 制定 pfu DNA 聚合酶国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于 pfu DNA 聚合酶的生产和使用具有重要的意义。

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　　pfuDNA聚合酶

　　1 范围

　　本标准规定了 pfu DNA 聚合酶的技术要求、检验方法、包装、运输、贮存和保质期。

　　本标准适用于以基因工程菌制成的 pfu DNA 聚合酶。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 191 包装储运图示标志。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　pfuDNA聚合酶 pfuDNA polymerase

　　一种来源于耐热球菌 pyrococcusfuriosus，分子质量为 90 ku, 具有极高的热稳定性和保真性的DNA 聚合酶。 该酶能催化脱氧核糖核苷酸从模板的 5′-3′方向聚合到引物上，具有 3 -5′外切酶活性，无5 -3′外切酶活性。

　　3.2

　　pfuDNA聚合酶活性单位 activityunitofpfuDNA polymerase

　　以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板/引物，在 74 ℃ , 6 min 内，将 0 . 14 nmol脱氧核苷酸聚合成双链 DNA 中所需的酶量为 1 活力单位(U) 。

　　4 技术要求

　　4 . 1 外观

　　澄清透明液体，无沉淀。

　　4 . 2 酶活

　　≥5 000 U/mL。

　　4 . 3 杂质

　　不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。

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　　5 检验方法

　　5 . 1 外观

　　直接或将样品倒入无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。

　　5 . 2 酶活

　　依据附录 A 的方法进行检测。

　　5 . 3 杂质

　　5 . 3 . 1 核酸外切酶检测

　　依据附录 B 的方法进行检测。

　　5 . 3 . 2 核酸内切酶检测

　　依据附录 C 的方法进行检测。

　　6 包装、运输和贮存

　　6 . 1 包装

　　内包装材料应洁净无污染，封口应严密，无泄漏。 外包装箱储运图示标志应符合 GB/T 191 的规定。

　　6 . 2 运输

　　产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防护措施避免倒置及破损。 不宜与有毒、有害、有异味物品混运。

　　6 . 3 贮存

　　应在温度低于 -20 ℃的条件下储存。

　　7 保质期

　　在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为 3 年;超过保质期，使用前应检测酶活。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　pfuDNA聚合酶酶活检测

　　A.1 仪器

　　全自动医用 PCR分析系统。

　　A.2 试剂

　　A.2 . 1 发夹型寡核苷酸序列(T2),序列为：

　　5′-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3′

　　A.2 . 2 dNTP。

　　注：包括 dATP、dCTP、dTTP、dGTP,其中 dGTP经热启动修饰。

　　A.2.3 PicoGreen染料。

　　A.2.4 Lamda DNA标准品。

　　A.3 试剂溶液配制

　　A.3. 1 1×TE溶液：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA ·2Na, pH 8.5 (25 ℃ )。

　　A.3.2 PCR buffer: 200 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L (NH4)2 · SO4 , 100 mmol/L KCl,1%(体积分数)Tritonx-100 , 1 mg/mL BSA, 20 mmol/L MgSO4 , pH8.7 (25 ℃ )。

　　A.3.3 Lambda DNA 预染液：以 8. 5 μL: 1 μL: 0. 5 μL 的比例分别量取纯化水、10 × PCR buffer 和PicoGreen染料加入 EP 管，在漩涡混匀器上振荡混匀1 min后在微型离心机上离心数秒，储存于 2 ℃ ~ 8 ℃ 。

　　A.3.4 MgCl2 溶液：25 mmol/L MgCl2 ·6H2 O。

　　A.3.5 酶稀释缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mmol/L EDTA ·2Na, 1 mmol/L DTT, 50 %(体积分数)甘油，pH8.0(25 ℃ )。

　　A.3.6 T2 溶液：将发夹型寡核苷酸序列(T2) 干粉按照合成单上的说明稀释到 100 μmol/L, 储存于

　　-20 ℃。使用时从 -20 ℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀 10 s,在微型离心机上离心数秒。

　　A.3.7 dNTP混合液：将 dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP等体积进行混合，于漩涡混匀器上混匀 10 s,在微型离心机上离心数秒，配制成浓度为 12 . 5 mmol/ L 的 dNTP混合液。

　　A.3.8 Lamda DNA 标准品：使用 1 × TE 溶液将 Lamda DNA 标准品进行 4 倍连续梯度稀释，得到

　　100 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3. 125 μg/mL、1. 562 5 μg/mL 和 0. 781 25 μg/mL 8 个浓度梯度溶液，以相同体积的 1×TE溶液作为背景对照。 各梯度溶液和背景对照分别加入等体积的预染液，于漩涡混匀器上混匀 10 s,在微型离心机上离心数秒，以 20 μL/管分装于 PCR八联管内，每个梯度 3 个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。

　　A.3 . 9 pfu DNA 聚合酶梯度稀释溶液：根据标定的酶比活力，使用酶稀释缓冲液对 pfu DNA 聚合酶进行适当稀释(如标定浓度为 5 000 U/mL, 即 5 U/μL, 可稀释至 4 U/μL、3 U/μL、2 U/μL。)该步骤应在冰上进行。

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　　A.4 实验步骤

　　A.4 . 1 聚合反应液的配制与分装

　　A.4 . 1 . 1 在 EP 管中按照表 A. 1 的比例配制聚合反应液(冰上配制)聚合反应液配制完成后，在漩涡混匀器涡旋混匀 10 s,微型离心机离心数秒。

　　注：配制总体积计算见式(A. 1) :

　　总体积 = [3 ×(狀+ 1) + 1] ×犞1 ……………………( A.1 )

　　式中：

　　3 — 重复次数;

　　狀 —pfu DNA 的稀释梯度;

　　1 — 前一个 1 表示空白对照数，后一个 1 表示预留损失数量;

　　犞1 — 1 个反应用量，见表 A. 1 。

　　表 A.1 聚合反应配比

　　A.4 . 1 . 2 将 A. 4 . 1 . 1 中的聚合反应液平均分装到狀 个(狀为 pfu DNA 的稀释梯度数)EP管中，分别加入

　　1 . 3 μL 的各浓度梯度的 pfu DNA 聚合酶梯度稀释溶液和空白对照(酶稀释缓冲液)，在漩涡混匀器涡旋混匀 10 s,微型离心机离心数秒。 各管混合液以 20 μL/管，分装于 PCR八联管内，每管混合液 3 个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。

　　A.4 . 2 运行程序

　　在全自动医用 PCR分析系统上设置如下温度程序：

　　95 ℃ 5 min

　　74 ℃ 16 s

　　荧光采集通道：SYBR

　　120 cycles

　　将装有 Lambda DNA标准品和聚合反应液的 PCR八联管置于全自动 PCR分析系统中，启动温度程序，开始聚合反应。

　　A.5 数据分析

　　A.5 . 1 LambdaDNA标准曲线的制作

　　使用全自动医用 PCR分析系统软件打开数据，导出 Excel 文件。

　　选取 Excel 文件中 Lambda DNA标准品和背景对照的第 21cycles 的荧光值。 计算背景对照 3 个

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　　重复的平均荧光值，将各梯度 Lambda DNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值，得到净荧光值 。计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差 SD。 以 Lambda DNA标准品 DNA量(ng)为 犡 轴，以各梯度净荧光值的平均值为 犢 轴，标准偏差 SD 为 Error值进行多项式拟合分析，制作工作曲线，从中获得净荧光值与双链 DNA浓度的关系曲线如下，犚2 ≥0 . 98 :

　　狔=犃+犅狓 ……………………( A.2 )

　　式中：

　　狔 —荧光值;

　　狓 —双链 DNA 的量，单位为纳克(ng) 。

　　A.5 . 2 聚合反应新生成的双链 DNA量的计算

　　选取 Excel文件中待检 pfu DNA 聚合酶的第 21cycles 的荧光数据。 首先计算空白对照 3 个重复的平均荧光值，将各梯度 pfu DNA 聚合酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值，得到净荧光值，计算各梯度净荧光值的平均值(狔1) 。将各净荧光值代入式(A. 1)计算聚合反应新生成的双链 DNA量(狓1) 。

　　A.5 . 3 各 pfuDNA聚合酶梯度条件下的 dNTP消耗量计算

　　各 pfu DNA 聚合酶梯度条件下的 dNTP 消耗量以 狔2 表示，单位为纳摩尔 ( nmol) , 按式 (A. 3)计算：

　　狔 ……………………( A.3 )

　　式中：

　　狓1 —新生成的双链 DNA量，单位为纳克(ng) ;

　　2 — 双链 DNA 由 2 条单链 DNA组成;

　　324.5 —dNTP 的相对平均分子质量。

　　A.5.4 pfuDNA聚合酶活计算

　　pfu DNA 聚合酶酶活以 犛表示，单位为 U/mL。选择在 0.023 nmol~0.142 nmol 范围内的 dNTP

　　消耗量按照式(A. 4)计算：

　　犛 ……………………( A.4 )

　　式中：

　　狔2 —dNTP 消耗量，单位为纳摩尔(nmol) ;

　　犇 — 酶的稀释倍数。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)核酸外切酶检测

　　B.1 原理

　　cccpUC19 所含经 BamH Ⅰ 位点居于编码 LacZ 的 α互补肽上，cccpUC19 经 BamH Ⅰ 酶切后，由环

　　形 DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链 DNA,其末端突出部分由五个碱基形成单链，极易受核酸外切酶作用。 若样品存在核酸外切酶时，黏性末端易受外切酶切割，再经 T4 DNA 连接酶连接，其电泳条带位置不一致。

　　B.2 仪器和设备

　　B.2 . 1 恒温水浴槽。

　　B.2 . 2 台式离心机。

　　B.2 . 3 超净工作台。

　　B.2 . 4 电泳仪。

　　B.3 材料

　　B.3. 1 高纯 ccc pUC19 DNA。

　　B.3 . 2 T4 DNA连接酶。

　　B.3 . 3 氯仿-异戊醇(24 ∶ 1,体积比)。

　　B.3 . 4 琼脂糖。

　　B.4 实验步骤

　　B.4 . 1 长时程过量酶切

　　各取 5 μg 高纯 ccc pUC19 DNA置于两支 eppondorf 管，分别标记阴性对照和测试管，在阴性对照管里加入 10 μL 10 × BamH Ⅰ 缓冲液，2 μL 限制性内切酶 BamH Ⅰ (10 U~20 U) , 加入纯化水至

　　100 μL;在测试管里加入 10 μL 10 × BamH Ⅰ 缓冲液，2 μL 限制性内切酶 BamH Ⅰ (10 U~20U) , 5 μL pfuDNA 聚合酶样品 (50 U~ 100 U) , 加入纯化水至 100 μL。混匀，37 ℃水浴 10 h, 各取出

　　20 μL,分别标记 1 , 2 号，待电泳检测;再各取 20 μL,分别标记 3 , 4 号 。

　　B.4 . 2 电泳

　　B.4 . 2 . 1 取出 1 号和 2 号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。

　　B.4.2.2 1%~1.5%琼脂糖，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

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　　B.4 . 3 连接

　　B.4 . 3 . 1 回收 DNA

　　取出 3、4 号管，各加入 20 μL氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出 DNA,并真空干燥样品。

　　B.4 . 3 . 2 连接反应

　　每管加入 2 μL 10 × T4 DNA 连接酶缓冲液，2 U T4DNA 连接酶，加入纯化水至 20 μL, 混匀， 15 ℃水浴 8 h。

　　B.4 . 3 . 3 电泳

　　B.4 . 3 . 3 . 1 取出 3 号和 4 号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。

　　B.4.3.3.2 1%~1.5%琼脂糖，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　B.5 结果判定

　　在电泳板上，肉眼观察。 若 1 号和 2 号的谱带一致，3 号和 4 号的谱带一致，则判定样品中不含核酸外切酶;若 1 号和 2 号的谱带不一致或(和)3 号和 4 号的谱带不一致，则判定样品中含核酸外切酶。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)核酸内切酶检测

　　C.1 原理

　　pUC19 质粒为环状结构，核酸内切酶能破坏环状结构，两者电泳谱带不一致。

　　C.2 仪器

　　C.2. 1 电泳仪 。

　　C.2.2 分析天平(万分之一)。

　　C.2.3 紫外透光分析仪。

　　C.3 实验步骤

　　C.3. 1 pUC19 质粒反应

　　C.3. 1 . 1 在测试管里先后加入 4 μL pUC19 质粒 DNA(1 μg/μL)、14 μL纯化水、2 μL酶，振荡器混匀，水浴 1 h ;

　　C.3. 1 .2 在对照管里先后加入 4 μL pUC19 质粒 DNA( 1 μg/μL)、16 μL 纯化水，振荡器混匀，水浴1 h 。

　　C.3 . 2 电泳

　　1%~1 . 5%琼脂糖凝胶，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　C.4 结果判断

　　在电泳板上，肉眼观察。 若测试管和对照管的谱带一致，则判定样品中不含核酸内切酶;若不一致，则判定样品中含有核酸内切酶。