GB/T 35540-2017 限制性凝血酶

　　ICS 07 . 080 C 27

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35540—2017

　　限 制 性 凝 血 酶

　　Restrictionthrombin

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35540—20 17

　　GB/T 35540—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG 11)归口 。

　　本标准起草单位：福建华灿制药有限公司、华灿南生(厦门)生物技术有限公司、福建南生科技有限公司、山东大学、安琪酵母股份有限公司、三明市产品质量检验所、福建农林大学、复旦大学、苏州大学、上海百赛生物科技有限公司、海狸纳米科技(苏州)有限公司、上海博仕生物科技有限公司。

　　本标准主要起草人：黄发灿、郑登忠、詹学雄、郭晓觧、陈秀兰、赵晶、章丽丽、庄丽琼、黄发喜、林乐钞、陈劲春、姚娟、刘斌、张熙颖、钟江、朱力、任辉、邢志刚。

　　GB/T 35540—20 17

　　引 言

　　限制性凝血酶是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，能识别 LeuValProArg ↓ GlySer 氨基酸序

　　列，是基因工程中重组融合蛋白的酶切工具。 制定限制性凝血酶国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于限制性凝血酶的生产和使用具有重要意义。

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　　限 制 性 凝 血 酶

　　1 范围

　　本标准规定了限制性凝血酶的技术要求、检验方法、包装、运输、贮存和保质期。

　　本标准适用于从猪血液中提取的限制性凝血酶。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 191 包装储运图示标志

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　限制性凝血酶 restrictionthrombin

　　一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，能识别 LeuValProArg ↓ GlySer 氨基酸序列，用于酶切具有

　　凝血酶酶切位点的重组融合蛋白。

　　3.2

　　限制性凝血酶活力单位 activityunitofrestrictionthrombin

　　20 ℃ , pH 8.4 条件下，在 50 μL含有 20 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、2.5 m mol/L CaCl2的缓冲液里，16 h 内酶切水解 1 μmol融合蛋白所需的限制性凝血酶量为一个活力单位(Facan unit)。

　　4 技术要求

　　4 . 1 外观

　　白色或类白色的冻干块状物或粉末。

　　4 . 2 酶活

　　≥350 Facan unit/mg。

　　4 . 3 纯度

　　20 μg 限制性凝血酶经 SDS-PAGE 电泳结果显示为单条带。

　　5 检验方法

　　5 . 1 外观

　　直接或将样品倒入无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。

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　　5 . 2 酶活

　　依据附录 A 的方法进行检测。

　　5 . 3 纯度

　　依据附录 B 的方法进行检测。

　　6 包装、运输及贮存

　　6 . 1 包装

　　内包装材料应洁净无污染，封 口应严密，无泄漏。 外包装箱储运图示标志应符合 GB/T 191 的规定。

　　6 . 2 运输

　　产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防护措施避免倒置及破损。 不宜与有毒、有害、有异味物品混运。

　　6 . 3 贮存

　　应在温度低于-20 ℃的条件下储存。

　　7 保质期

　　在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为三年;超过保质期，使用前应检测酶活。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　限制性凝血酶酶活检测

　　A.1 仪器和设备

　　A.1 . 1 紫外分光光度计。

　　A.1 . 2 恒温培养箱。

　　A.1 . 3 电泳仪，备电泳槽。

　　A.2 试剂

　　A.2. 1 GST Taq融合蛋白。

　　A.2 . 2 Tris 。

　　A.2 . 3 HCl 。

　　A.2 . 4 NaCl 。

　　A.2 . 5 CaCl2 。

　　A.3 试剂溶液配制

　　A.3. 1 cleavage buffer 配制：20 m mol/L Tris-HCl(pH 8.4) , 0.15 mol/L NaCl, 2.5 m mol/L CaCl2 。

　　A.3.2 融合蛋白溶液配制：精密称取融合蛋白约 25 mg,用 cleavage buffer 溶解并定容至 25 mL,紫外分光光度法检测蛋白浓度后再稀释成每毫升含 0.1 mg蛋白的溶液，即得。

　　A.3.3 限制性凝血酶溶液配制：精密称量限制性凝血酶适量，用 cleavage buffer 溶解制成每毫升含1 mg蛋白的溶液，再稀释成每 mL含 0.02 mg蛋白的溶液，即得。

　　A.3.4 2 倍 SDS样品缓冲液配制：40 mL 纯化水，1.52 g Tris, 20 mL 甘油，2 g SDS, 2 mL β-巯基乙醇， 1 mg 溴酚蓝，用 1 mol/L盐酸调 pH 至 6.8,定容至 100 mL,即得。

　　A.4 试验步骤

　　A.4 . 1 酶切反应

　　取离心管 8 支，各加入融合蛋白溶液 40 μL,再依次分别加入限制性凝血酶溶液 0 μL、2 μL、3 μL、 4 μL、5 μL、6 μL、7 μL、8 μL,再依次分别加入 cleavage buffer 10 μL、8 μL、7 μL、6 μL、5 μL、4 μL、

　　3 μL、2 μL ,置 20 ℃ ±0.5 ℃水浴中，反应 16 h 后，各加入 50 μL 的 2 倍 SDS 样品缓冲液终止酶切反应，分别取各反应液 20 μL,进行 SDS-PAGE凝胶电泳。

　　A.4 . 2 电泳

　　12% SDS-PAGE凝胶电泳，电压 90 V~120 V,当溴酚蓝线到达凝胶板底部时停止电泳，取出凝胶进行染色 30 min,并过夜脱色至无底色。

　　当融合蛋白电泳条带看不见时，表明此时的限制性凝血酶量恰好能将该融合蛋白样品完全酶切，并

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　　以此反应体系作为依据计算酶活。

　　A.5 酶活计算

　　产品的酶活，以每毫克样品含有的限制性凝血酶活力 S表示，数值以 Facan unit/mg表示，按式(A.1)

　　计算：

　　S …………………………( A.1 )

　　式中：

　　c1 — 融合蛋白浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　V1 — 融合蛋白加入量，单位为微升(μL) ;

　　W — 融合蛋白分子质量，W= 120 000 u ;

　　c2 — 限制性凝血酶浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　V2 — 限制性凝血酶加入量，单位为微升(μL)。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　限制性凝血酶纯度检测

　　B.1 仪器设备

　　B.1 . 1 电泳仪，备电泳槽。

　　B.2 试剂

　　B.2 . 1 NaCl 。

　　B.2 . 2 SDS。

　　B.2 . 3 过硫酸铵。

　　B.2 . 4 TEMED。

　　B.2 . 5 丙烯酰胺。

　　B.2 . 6 甲叉双丙烯酰胺。

　　B.2 . 7 Tris 。

　　B.2 . 8 HCl 。

　　B.3 实验步骤

　　B.3 . 1 样品制备

　　B.3. 1 . 1 用 0.9% NaCl溶液溶解限制性凝血酶，稀释成每微升含 1 μg蛋白的浓度。

　　B.3. 1 .2 取 20 μL 限制性凝血酶溶液，加入 20 μL 2 × SDS sample buffer, 100 ℃水浴 3 min,立即置冰上待用。

　　B.3 . 2 12% SDS-PAGE凝胶电泳

　　B.3.2. 1 配制 12%分离胶，体积 15 mL: 5.09 mL 纯化水，6.0 mL 30%凝胶贮备液，3.75 mL 4 × Tris- HCl/SDS, pH 8.8 ,0.15 mL 10%过硫酸铵，0.01 mLTEMED。一旦加入 TEMED,混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙为 1.5 mm 中，为浓缩胶留有足够空间。用纯水覆盖顶层，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

　　B.3 . 2 . 2 聚合完成之后，倒掉覆盖纯化水，用纯化水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。插入齿宽 5 mm,厚度 1.5 mm 梳子，待注浓缩胶。

　　B.3.2.3 配制 5%浓缩胶，体积 5 mL: 3.04 mL H2 O,0.65 mL 30%凝胶贮备液，1.25 mL 4×Tris-HCl/ SDS, pH 6.8 , 0.05 mL 10%过硫酸铵，0.01 mL TEMED。

　　B.3 . 2 . 4 在浓缩胶聚合完成后，用去纯化水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。加入 1 × SDS 电极缓冲液直至漫过浓缩胶面。

　　B.3.2.5 将样品 40 μL全部加样，在直流电压 100 V下电泳，直到染料抵达分离胶底部。

　　B.3.2.6 电泳结束后用固定液固定凝胶 15 min,再用考马斯亮蓝染色液染色 30 min,最后用脱色液脱色至无底色。

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　　B.4 结果判断

　　将凝胶片置于凝胶观察灯上，肉眼观察。 若为单条带，则判断纯度符合要求;若除主带外，还有其他杂带，则判断纯度不符合要求。