GB/T 35539-2017 限制性核酸内切酶BamH I

　　ICS 07 . 080 C 27

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35539—2017

　　限制性核酸内切酶 BamHⅠ

　　RestrictionendonucleaseBamHⅠ

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35539—20 17

　　GB/T 35539—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG 11)归口 。

　　本标准起草单位：北京化工大学、福建南生科技有限公司、福建华灿制药有限公司、中国计量院、山东大学、三明市质量技术监督协会、安琪酵母股份有限公司、福建农林大学。

　　本标准主要起草人：陈劲春、陈刚、王立仁、黄发灿、全灿、郑登忠、詹学雄、庄丽琼、郑巧蓉、黄发喜、赵晶、陈秀兰、姚娟、刘斌。

　　GB/T 35539—20 17

　　引

　　言

　　BamH Ⅰ 是一种限制性核酸内切酶，能特异性识别 DNA链中 G ↓ GATCC碱基序列，产生 5′黏性末端。 制订 BamH Ⅰ 国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于 BamH Ⅰ 的生产和使用具有重要的意义。

　　GB/T 35539—20 17

　　限制性核酸内切酶 BamHⅠ

　　1 范围

　　本标准规定了限制性核酸内切酶 BamH Ⅰ 的技术要求、检验方法、包装、运输、贮存和保质期。

　　本标准适用于由细菌 Bacillus amyloliquefaciens H 发酵制备或以基因工程菌 Escherichia.coli制成的 BamH Ⅰ。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 191 包装储运图示标志

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　BamHⅠ

　　一种限制性核酸内切酶，能特异性识别 DNA链上碱基序列 G ↓ GATCC 产生 5′黏性末端，来源于

　　Bacillus amyloliquefaciens H 或 Bacillus subtilis MT-2(pBamH Ⅰ RM22) 或重组 E. coli 菌株，含有从

　　Bacillus amyloliquefaciens H 菌株克隆的 BamH Ⅰ 基因。

　　3.2

　　BamHⅠ 活力单位 BamHⅠ activityunit

　　在 37 ℃,在 50 μL反应体系中反应 1 h,将 1 μg 的 λDNA完全分解所需的酶量为 1 活力单位(1 U) 。

　　4 技术要求

　　4 . 1 外观

　　澄清透明的液体，无沉淀。

　　4 . 2 酶活

　　≥10 000 U/mL。

　　4 . 3 杂质

　　不应含有其他核酸内切酶和核酸外切酶。

　　5 检验方法

　　5 . 1 外观

　　直接或将样品倒入无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。

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　　5 . 2 酶活

　　依据附录 A 的方法进行检测。

　　5 . 3 杂质

　　5 . 3 . 1 其他核酸内切酶

　　依据附录 B 的方法进行检测。

　　5 . 3 . 2 核酸外切酶

　　依据附录 C 的方法进行检测。

　　6 包装、运输及贮存

　　6 . 1 包装

　　内包装材料应洁净无污染，封口应严密，无泄漏。 外包装箱储运图示标志应符合 GB/T 191 的规定。

　　6 . 2 运输

　　产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防护措施避免倒置及破损。 不宜与有毒、有害、有异味物品混运。

　　6 . 3 贮存

　　应在温度低于 -20 ℃的条件下贮存。

　　7 保质期

　　在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为 3 年;超过保质期，使用前应检测酶活。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　限制性核酸内切酶 BamHⅠ 酶活检测

　　A.1 一般要求

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和 GB/T 6682 中规定的水。 除非另有说明，在分析中涉及分子生物学通用实验方法如离心、层析、电泳、酶切、连接、基因扩增、微生物培养和使用，等等。

　　注：在国内外尚未颁布标准的现状下，可参考 Sambrook、Fritsch、Maniatis 合编《Molecular Cloning—A Laboratory Manual》操作。

　　A.2 方法原理

　　依据酶活力定义，进行定量检测。

　　采用酶解后经多重 PCR 检测酶活性。 即将 BamH Ⅰ 用缓冲液稀释成不同浓度梯度后，分别各取1 μL 稀释后的 BamH Ⅰ 与 1μg λDNA,在 37 ℃中温育 1 h;终止反应后，取少许酶解液作为模板，以 5 对根据 BamH Ⅰ 切点合成的 DNA 片段为引物进行 PCR;随后立即电泳检验。 由电泳结果判断检测样品的酶活性高低。

　　A.3 仪器和设备

　　A.3 . 1 恒温水浴槽。

　　A.3 . 2 电泳仪。

　　A.3 . 3 紫外透光分析仪。

　　A.3 . 4 紫外-可见光光度计。

　　A.3 . 5 PCR仪 。

　　A.4 材料

　　A.4. 1 λ DNA。

　　A.4.2 BamH Ⅰ。

　　A.4.3 Agarose。

　　A.5 溶液配制

　　A.5. 1 底 物 DNA 溶 液：用 分 析 天 平 准 确 称 100 μg λDNA, 置 于 Ep 管 内 并 加 入 100 μL 1 × TE (10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0 , 1 mmol/L EDTA),轻置静处，待彻底溶解且尽可能保持分子不断开。

　　A.5 . 2 浓度梯度的 BamH Ⅰ 酶液：根据样品标示，将酶原液用 BamH Ⅰ 酶解缓冲液(一般随样品购进)稀释成 0.2 或 0.1 U/μL。

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　　A.6 实验步骤

　　A.6 . 1 酶稀释检测

　　A.6 . 1 . 1 酶解反应

　　各取 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 10 μL稀释后的 BamH Ⅰ 与 1 μg λDNA,在 37 ℃酶解 1 h,及时取出样品并立即置于 65 ℃水浴中 2 min终止酶解反应，再将样品放于 4 ℃冰箱待用。

　　A.6 . 1 . 2 电泳

　　1 . 5%琼脂糖凝胶，电泳电压 5 V/ cm~ 10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　A.6 . 2 多重 PCR检测

　　A.6 . 2 . 1 设计合成五对引物

　　多重 PCR使用的引物应符合表 A. 1 的规定。

　　表 A.1 多重 PCR使用的引物

　　A.6 . 2 . 2 多重 PCR反应体系

　　多重 PCR反应体系应符合表 A. 2 的规定。

　　表 A.2 多重 PCR反应体系

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　　表 A.2(续)

　　A.6 . 2 . 3 设定 PCR程序

　　A.6 . 2 . 3 . 1 PCR程序应符合表 A. 3 的规定。

　　表 A.3 PCR程序

　　A.6 . 2 . 3 . 2 按表 A. 3 PCR程序，循环 30 次 。

　　A.6 . 2 . 4 电泳

　　1 . 5%琼脂糖凝胶，电泳电压 5 V/ cm~ 10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　A.7 结果判定

　　A.7 . 1 比较电泳结果

　　二次电泳检测结果互为印证。 酶量不足 1 U 时，1 μg λDNA未被完全切开，能扩增出相应的片段;反之，当酶量达 1 U 时，1 μg λDNA被完全切开，不能扩增出相应的片段。

　　A.7 . 2 结果判定

　　根据 A. 6 . 2 . 4 电泳结果，结合酶稀释倍数，得出样品酶量与其标示是否相符。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　其他核酸内切酶检测

　　B.1 原理

　　Фx174 DNA无 BamH Ⅰ 酶切位点;λDNA有 5 个 BamH Ⅰ 酶切位点，完全酶解后产生 6 条谱带，它

　　们的大小及核苷酸顺序均为已知。 样品中无其他核酸内切酶污染，酶解产物在电泳板上形成的谱带与酶解时间过长、用酶过多无关。

　　B.2 仪器设备

　　B.2 . 1 电泳仪 。

　　B.2 . 2 分析天平(万分之一)。

　　B.2 . 3 紫外透光分析仪。

　　B.3 材料

　　B.3. 1 λDNA。

　　B.3 . 2 Фx174 DNA。

　　B.3 . 3 琼脂糖。

　　B.4 实验步骤

　　B.4 . 1 长时程过量酶切反应

　　取 4 支 eppendorf 管，标号 1、2、3、4;前 2 支各加入 1 μg λDNA,后 2 支各加入 1 μg Фx174 DNA;每管加入 5 μL 10×反应缓冲液，标号 1、2、3 加入 10 U(1 μL)BamH Ⅰ ,标号 4 不加 BamH Ⅰ ,均加入纯化

　　水至 50 μL,混匀，37 ℃酶切，1 h后取出标号 1 管，置冰箱待电泳检测;10 h后取出标号 2、3、4 管，置冰箱待电泳检测。

　　B.4 . 2 电泳

　　1%~1 . 5%琼脂糖凝胶，电泳电压 5 V/cm~10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　B.5 结果判断

　　在电泳板上，肉眼观察。 若 1 号和 2 号的谱带一致，3 号和 4 号的谱带一致，则判定样品中不含其他核酸内切酶;若 1 号和 2 号的谱带不一致或(和)3 号和 4 号的谱带不一致，则判定样品中含其他核酸内切酶。

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　　附 录 C

　　(规范性附录)核酸外切酶检测

　　C.1 原理

　　由于 BamH Ⅰ 切开 DNA双链产生一对黏性末端，其各有五个碱基失去互补碱基形成突出单链，它易受核酸外切酶作用丢失若干个碱基乃至形成平末端;如果将此 DNA 连接后再用 BamH Ⅰ 酶切，结果是无法切开。 如果该位点是在外显子区或编码区，即意味其对应的氨基酸序列发生变化，乃至某些生物性状发生改变。 例如质粒 pBR322 所含 BamH Ⅰ 识别位点是在其抗四环素基因上，如果使用被核酸外切酶污染的样品 BamH Ⅰ 过量长时程切割 pBR322,然后再连接闭环后重新转化受体菌，该菌在含四环素培养基上无法生长，而没有这样酶切的 pBR322 转化菌能够生长。 又如质粒 pUC19 所含 BamH Ⅰ 位点居于编码 Lac Z 的 α互补肽上，若发生前述状况，就会导致该肽链的氨基酸序列变化，最终在含 IPTG和 X-gal 的 LB培养基上由原本是蓝斑变成白斑。 如果白斑数目占到总菌斑数的 10% 以上，就判定该样品已有核酸外切酶污染。

　　C.2 仪器和设备

　　C.2. 1 恒温水浴槽。

　　C.2.2 台式离心机。

　　C.2.3 超净工作台。

　　C.2.4 恒温培养箱。

　　C.3 材料

　　C.3. 1 高纯 cccpUC19 DNA。

　　C.3.2 T4 DNA连接酶。

　　C.3.3 LB培养液。

　　C.3.4 氯仿-异戊醇(24 ∶ 1,体积比)。

　　C.3.5 大肠杆菌 DH5α(感受态)。

　　C.3.6 LB平板(含 X-gal, IPTG, 氨苄青霉素)。

　　C.4 实验步骤

　　C.4 . 1 长时程过量酶切

　　取 5 μg 高纯 cccpUC19 DNA置于一支 eppondorf,加入 10 μL 10 × BamH Ⅰ 缓冲液(一般随样品赠送)，5 μL高浓度样品酶 BamH Ⅰ (50 U~100 U),加入纯化水达总体积 100 μL;混匀后置于 37 ℃水浴槽，1 h后取出 40 μL, 20 μL(标记 1 号)待电泳检测，另 20 μL(标记 2 号)待连接及蓝白斑计数;所剩60 μL继续酶切达 10 h 以上，又将它均分为三管，分别标记 3、4、5 号 。

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　　C.4 . 2 电泳

　　C.4.2. 1 取出 1 号和 3 号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。

　　C.4.2.2 1.5%琼脂糖，电泳电压 5 V/ cm~ 10 V/cm, 当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。

　　C.4 . 3 连接

　　C.4 . 3 . 1 回收 DNA

　　取出 2、4、5 号管，各加入 20 μL氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出 DNA,并真空干燥样品。

　　C.4 . 3 . 2 连接反应

　　每管加入 2 μL 10 × T4 DNA 连接酶缓冲液(商家随样品赠送)，2 U T4DNA 连接酶，加入纯化水达总体积 20 μL,混匀后置于 15 ℃水浴槽 8 h。

　　C.4 . 3 . 3 转化与铺板

　　C.4.3.3. 1 将感受态菌液加入含连接处理过的 DNA 的指管内，轻混，置于 4 ℃冰浴槽 0 . 5 h 以上。 C.4.3.3.2 将上述三支指管移到 42 ℃水浴中热击 2 min,迅即取出再置于 4 ℃冰浴槽 0 . 5 h 以上。 C.4.3.3.3 向上述三支指管各加入 1 mL LB培养液，轻混，置于 37 ℃水浴槽 1 h。

　　C.4.3.3.4 将 15 块固态 LB板，分别标上 2、4、5 号，每号均有 5 块板;在超净工作台铺板，每板加入上述菌液 200 μL;待板上菌液不会流动时，翻转平板，置于 37 ℃恒温培养箱 8 h 以上。

　　C.4.3.3.5 计算每块板蓝白斑数量，再算出每号管对应的每个处理的蓝白斑总数及百分比。

　　C.5 结果判定

　　C.5. 1 在电泳板上，1 号和 3 号的谱带没有明显差异;说明长时程过量酶处理对 DNA 没有造成额外的切割。

　　C.5.2 2、4、5 号的白斑总数与其蓝斑总数相比。 若比值小于 1/9,则判定样品不含核酸外切酶;若比值大于或等于 1/9,则判定样品含有核酸外切酶。