GB/T 35514-2017 化学品 线蚓繁殖试验

　　ICS 13 . 300 ; 13 . 020 A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35514—2017

　　化学品 线蚓繁殖试验

　　Chemicals—Enchytraeidreproductiontest

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35514—20 17

　　GB/T 35514—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准与经济合作与发展组织(OECD) 化学品测试导则 No. 220(2004 年)《线蚓繁殖试验》(英文版)技术性内容一致。

　　本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC 251)提出并归口 。

　　本标准起草单位：广东省微生物研究所、环境保护部固体废物与化学品管理技术中心、沈阳化工研究院、中国检验检疫科学研究院、广东中科英海科技有限公司。

　　本标准主要起草 人：梅 承 芳、柳 燕 贞、曾 国 驱、刘 纯 新、林 健 辉、陈 会 明、郭 琳 琳、张 静、张 宝 兰、李雪君。

　　GB/T 35514—20 17

　　化学品 线蚓繁殖试验

　　1 范围

　　本标准规定了化学品线蚓繁殖试验的术语和定义、受试物所需信息、原理、参比物、仪器设备、试验系统、试验程序、试验有效性、数据处理与结果报告。

　　本标准适用于评价受试物对土壤中线蚓繁殖量的影响。

　　本标准不适用于挥发性物质，如亨利常数或气/水分配系数大于 1、或蒸气压超过 0 . 013 3 Pa (25 ℃) 的物质。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 21809 化学品 蚯蚓急性毒性试验

　　GB/T 21851 化学品 批平衡法检测 吸附/解吸附试验

　　GB/T 27860 化学品 高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数

　　ISO 11268-2 : 2012 土壤质量 污染物对蚯蚓的影响 对赤子爱胜蚓/安德爱胜蚓繁殖影响的测

　　定 (Soil quality—Effects of pollutants on earthworms—Determination of effects on reproduction of Eiseniafetida/Eiseniaandrei)

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　产生 x%效应的浓度 effectconcentrationforx% effect

　　ECx

　　与对照组相比，在给定的暴露时间内对受试生物产生 x%效应的受试物浓度。 以每单位试验土壤干重所含的受试物量表示。

　　3.2

　　非致死浓度 nolethalconcentration

　　LC0

　　在给定的时间内不会造成任何受试生物死亡的最高受试物浓度。 以每单位试验土壤干重所含的受试物量表示。

　　3.3

　　半数致死浓度 medianlethalconcentration

　　LC50

　　在给定的时间内造成 50%受试生物死亡的受试物浓度。 以每单位试验土壤干重所含的受试物量表示。

　　GB/T 35514—20 17

　　3.4

　　全部致死浓度 totallylethalconcentration

　　LC100

　　在给定的时间内造成 100%受试生物死亡的最低受试物浓度。 以每单位试验土壤干重所含的受试物量表示。

　　3.5

　　最低可观察效应浓度 lowestobservedeffectconcentration;LOEC

　　能对受试生物产生统计学意义上的显著效应(p<0 . 05) 的最低受试物浓度。 以每单位试验土壤干重所含的受试物量表示。 通常所有高于 LOEC 的试验浓度都应产生与对照组相比具有统计学意义差异的毒性效应。 确定 LOEC 时，与上述要求偏离的任何情况都应在报告中进行解释说明。

　　3.6

　　无可观察效应浓度 noobservedeffectconcentration;NOEC

　　直接低于 LOEC,且未观察到任何毒性效应的最高受试物浓度。 与对照组相比，NOEC 对应的受试物浓度在给定的暴露时间内对受试生物不产生统计学意义上的显著效应(p<0 . 05) 。

　　3.7

　　繁殖率 reproductionrate

　　在试验期间内每条成蚓所产幼虫的平均数。

　　4 受试物所需信息

　　受试物所需信息包括：

　　a) 水中溶解度;

　　b) lgkow(土壤/水分配系数)，试验方法按 GB/T 21851、GB/T 27860 ;

　　c) 蒸气压;

　　d) 挥发性;

　　e) 在土壤中的其他环境行为，如光解和水解速率等。

　　5 原理

　　将成蚓暴露于混合有不同浓度受试物的人工土壤中，试验可分为两步：当缺乏充分的信息时应首先开展预试验，暴露两周以致死率作为主要的评价终点。 在正式的繁殖试验中，应同时评估亲本繁殖的幼体量和存活亲本的数量。 正式试验的时间为 6 周 。试验开始 3 周后，应移去成蚓并记录其形态上的变化 。6 周后，计算成蚓产茧后孵化得到的子代数量。 通过比较含受试物的试验组与空白对照组中线蚓的繁殖量，确定 NOEC 和/或 ECx(如 EC10、EC50)：即采用回归模型估算导致繁殖率下降 x%时的受试物浓度。 应使得 ECx(如 EC10、EC50)包括在试验浓度范围内，以便通过内插法而非外推法得出 ECx 。

　　6 参比物

　　可定期开展参比物试验，也可在每批试验中同时开展以验证不同时期试验生物的反应未发生显著变化。 苯咪氨甲酯可作为参比物，已知该物质可对线蚓的存活和繁殖产生影响[1-2] 。 已充分获知毒性数据的其他化学品也可用作参比物。

　　苯咪氨甲酯制剂，活性成分含量为 360 g/L(32 . 18%), 已通过比对试验得到验证[3] 。 比对试验中，苯咪氨甲酯对线蚓繁殖的 EC50 为 1 . 2 mg±0 . 8 mg 活性成分/kg 干重[3] 。若试验组别中包括了阳性参

　　GB/T 35514—20 17

　　比物，可采用一个浓度进行试验且该浓度组的平行数应与空白对照组一致。 对于苯咪氨甲酯，试验浓度宜为 1 . 2 mg活性成分/kg 干重(受试物为液态制剂)。

　　7 仪器设备

　　试验容器由玻璃或其他化学惰性材料制成，如体积为 200 mL~250 mL,直径 ≈6 cm 的玻璃瓶。 试验容器应带有透明的瓶盖(如玻璃或聚乙烯盖)，以便光线透过。 瓶盖在减少水分蒸发的同时可允许土壤和空气之间存在气体交换。

　　除了常规设备外还应包括的仪器设备：

　　a) 干燥箱;

　　b ) 体视显微镜;

　　c) pH 计和光度计;

　　d) 精密天平;

　　e) 控温装置;

　　f) 控湿装置(若暴露容器有盖子则不必);

　　g) 培养箱或者装有空调的小房间;

　　h) 镊子、弯钩、小环;

　　i ) 光照池。

　　8 试验系统

　　8 . 1 人工土壤的制备

　　8 . 1 . 1 人工土壤的配方

　　本试验所需的人工土壤配方如下所示，配制方法按 GB/T 21809、ISO 11268-2(基于干重，105 ℃烘干至恒重)：

　　a) 10%的泥炭土，风干后磨碎至所需粒径(粒径范围= 2 mm±1 mm);试验前，宜检查新配制的泥炭土是否适用于线蚓的培养;

　　b ) 20%的高岭土(其中高岭石的含量宜在 30%以上);

　　c) 约 0 . 3%~1 . 0%的碳酸钙(CaCO 3 粉末，分析纯)，用来调节初始 pH 至 6 . 0±0 . 5,人工土壤中碳酸钙的添加量主要依据泥炭土的质地/性质而定;

　　d) 约 70%风干的石英砂(根据 CaCO 3 的添加量而定)，粒径在 50 μm~200 μm 范围内的石英砂的含量应大于 50%。

　　8 . 1 . 2 人工土壤的适用性及制备方法

　　在使用所配制的人工土壤进行正式试验之前，应确定其适合用于线蚓的培养，并且确保能够达到试验有效性的标准。 宜在试验前开展以下方式的检查以确保试验不会因为人工土壤中有机碳含量的降低而受到影响，例如，将泥炭土的含量降至 4%~5%,并相应地增加石英砂的含量。 若采用该方式降低有机碳含量，则可能使土壤(有机碳)对受试物的吸附性下降从而导致线蚓对该受试物的可利用性增大。经证实，当采用有机碳含量(如 2 . 7%) [4] 低于上述标准的田间土壤开展试验时，能够满足试验有效性中关于白线蚓繁殖量的要求。 采用泥炭土含量为 5%的人工土壤也可满足上述要求。

　　若使用天然土壤进行其他试验(如高级试验)，该土壤的适用性以及试验结果的有效性仍然需要确认。

　　GB/T 35514—20 17

　　组成人工土壤的各干燥组分应至少在试验开始前一周充分混合(如采用实验室用的大型搅拌器)。混匀的土壤应存放至少 2 d 以确保土壤的酸度达到平衡。 测定 pH 时，将土壤与 1 mol/ L KCl 或 0 . 01 mol/ L CaCl2 按照 1 ∶ 5 的比例混合(参见附录 A) [5] 。若试验土壤偏酸并超出了规定的酸碱范围，可通过添加适量 CaCO 3 进行调整;若试验土壤偏碱，则可通过添加除 CaCO 3 之外的其他组分进行调整。

　　参照附录 B测定人工土壤的最大持水量。 在试验开始前 1 d~2 d,对干燥的土壤进行预湿润处理，向土壤中加入足量的去离子水使得土壤含水量约至最终含水量的一半，最终含水量为土壤最大持水量的 40%~60%。 试验开始时根据试验设置的处理组(如需要，以及参比物试验组)和对照组的数量将经过预湿处理的土壤分成若干份。 通过添加受试物溶液或去离子水调节土壤的含水量至最大持水量的 40%~60%。 试验开始和结束时测定土壤含水量(105 ℃烘干至恒重)。含水量应处于线蚓生长的最适范围内。 可通过手指轻轻挤压土壤的方法来粗略地检查其含水量。 若土壤含水量适中，则经过挤压后手指间余有少量水分(小水滴)。

　　8 . 2 受试生物

　　8 . 2 . 1 受试生物的选择

　　受试生物种宜为白线蚓(Enchytraeusalbidus)，属于环节动物门，寡毛 目，线蚓科。 白线蚓是线蚓科中体型最大的种之一，体长最长可达 3 . 5 cm[6-7] 。 白线蚓是世界广布种，常见于海洋、淡水以及陆地，主要生活在腐烂的有机质(海藻、堆肥)当中，鲜见于草地[8] 。其广泛的生态耐受性和某些形态上的变化表明其存在不同的类群。

　　其他的线蚓种也可用于试验，例如 E.buchholzi或 E.crypticus(参见附录 C) 。若试验中使用了其他线蚓种，应对这些种进行准确鉴定，并在报告中提供选择该受试物种的理论依据。

　　8 . 2 . 2 受试生物的准备

　　白线蚓通常作为鱼饵出售。 获得白线蚓后应检查其是否受到其他物种(通常是更小的物种)污染[9,10] 。若存在污染，应将所有的白线蚓置于培养皿中用水清洗。 将体型大的成蚓挑选出来(通过体视显微镜镜检)作为重新培养用的亲本，其他的蚓虫弃之不用。 白线蚓(E.albidus)在多种有机质中均易于培养(参见附录 D) 。在 33 d ( 18 ℃ ) ~74 d ( 12 ℃) 内可发育成熟[9] ,生命周期较短。 只有当白线蚓在实验室内培养至少 5 周(一代)未出现任何问题后，方可将其用于试验。

　　试验应选用成蚓，其环带区具有卵(白点)，体长相近(约 1 cm) 。不要求选择同一时期培养的线蚓。

　　若线蚓未在同一类型的土壤中，或未在与最终试验相同的条件下(包括饲喂条件)繁殖培养，则应先驯养 1 d~3 d。 选取超过试验所需的大量成蚓对其进行驯养，以发现并弃除受损或其他不适用的个体。在驯养末期，挑选出怀卵和无异常行为表现(如试图逃离驯养土壤)的蚓虫用于试验。 用精密的镊子、小钩或小环将蚓虫轻轻移入装有少量淡水的培养皿中。 由于去离子水、去矿物质水或 自来水均有可能对蚓虫造成伤害，因此可参考 GB/T 21828[11] 中的方法配制淡水。 采用体视显微镜对蚓虫进行镜检，弃除未怀卵的个体。 仔细去除可能影响线蚓驯养的螨虫或跳虫。 未用于试验的健康蚓虫可重新放回原基质中继续驯养。

　　8 . 3 受试物的添加

　　8 . 3 . 1 水溶性受试物

　　采用去离子水配制受试物溶液，配制量应满足一个试验浓度组中所有平行的使用。 应采用合适的水量配制以达到试验含水量的要求，即土壤最大持水量( WHC) 的 40%~60%。 分别将每个浓度的试验溶液与经过预湿处理的同一批土壤充分混匀，再将混合好的土壤分装入试验容器。

　　GB/T 35514—20 17

　　8 . 3 . 2 难溶于水的受试物

　　对于难溶于水但易溶于有机溶剂的化学品，可将受试物溶解于尽可能少量的溶剂中(如丙酮)。 只可使用挥发性溶剂。 将溶剂喷洒在少量石英砂上(如 2 . 5 g 石英砂)或与石英砂混合，再将石英砂放置在通风橱中至少 1 h,通过挥发去除有机溶剂。 向土壤中添加适量的去离子水达到所需的含水量后，将石英砂与受试物混合物加入并充分混匀。 将最终的土壤混合物分装至试验容器。

　　通常情况下受试物的浓度不应高于 1 000 mg/kg 干重土壤。 但若为了达到某些特殊的试验 目 的 ，也可采用更高的浓度进行试验。

　　8 . 3 . 3 难溶于有机溶剂的受试物

　　对于难溶于水和有机溶剂的化学品，在每个试验器皿中将等量的 2 . 5 g 精细研磨的石英砂与一定量的受试物混合以达到试验所需的浓度。 添加适量的去离子水达到所需的含水量后，将混合有受试物的石英砂加入到预湿润的土壤中充分混匀。 将混合好后的土壤分装到试验容器中。 每个浓度的重复组和空白对照组采用上述同样的方式处理。

　　9 试验程序

　　9 . 1 试验组和对照组的处理

　　对于每个浓度组，在试验容器中装入相当于 20 g 干重的土壤。 不含受试物的空白对照组也同样操作 。 向每个试验容器添加食物。 将线蚓随机分配，每个容器放入 10 条 。使用精密的镊子、小钩或小环，小心地将蚓虫移入试验容器并放置于土壤表面。 试验浓度组和对照组的平行数取决于试验设计。 将试验容器随机放入培养箱，且每周随机调换一次容器的摆放位置。

　　若受试物添加过程中使用了溶剂等载体，则应增设一个对照组与各试验组同时进行。 该对照组中石英砂也应喷洒或混合溶剂，且溶剂或者分散剂的浓度应与含受试物试验容器中的溶剂浓度相同。 对于难溶于水和有机溶剂的受试物，其空白对照组也应先分出 2 . 5 g石英砂按照同样的程序操作。

　　9 . 2 试验条件

　　试验条件具体如下：

　　a) 试验温度：20 ℃ ±2 ℃。

　　b ) 光照：为了防止蚓虫从土壤中逃逸，试验应在受控的光-暗周期下进行(最适光周期为 16 h 光照 ∶ 8 h黑暗)，试验容器放置区域的光照强度应为 400 lx~800 lx。

　　c) 湿度：为了检查土壤湿度，应在试验开始时以及此后的每周对试验容器进行称重。 质量损失可通过添加适量的去离子水补充。 可在试验培养箱中保持较高的空气湿度( > 80%)从而减少水分的损失。

　　d) 在预试验和正式试验开始及结束时分别测定土壤含水量和 pH 值 。 除试验用土壤外，应用同样的方法额外制备土壤样品用于空白对照及受试物处理组的土壤含水量和 pH 值测定，但该土壤样品中不含有蚓虫。 仅在试验开始时向上述土壤样品中添加食物以提高微生物的活性，试验过程中不额外添加食物。

　　9 . 3 饲喂

　　试验用的食物应满足线蚓种群生长繁殖的需要。 燕麦片适于作为饲喂食物，使用前应进行高压或高温灭菌以防止微生物污染。

　　应在放入蚓虫之前向容器内添加食物，将 50 mg 经过研磨的燕麦片与土壤混合。 此后，每周添加

　　GB/T 35514—20 17

　　一次食物直至 21 d。第 28 天不再添加食物，因为这个阶段成虫已被移出，而幼虫几乎无需再额外供给食物。 试验期间饲喂时，每个容器加入 25 mg 研磨后的燕麦片，将燕麦小心地放置于土壤表面以避免触伤线蚓。 为了减少真菌滋生，应用少量的土壤掩盖燕麦片。 若观察到食物有剩余，应减少饲喂量。

　　9 . 4 预试验

　　必要时，可采用 5 个试验浓度进行预试验，如：0. 1 mg/kg、1. 0 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg 和1 000 mg/kg(干重土壤)。每个受试物处理组和对照组各设置一个平行。

　　预试验时间为 2 周 。试验结束时以线蚓的死亡率作为评价终点。 通过机械刺激蚓虫的前端，若蚓虫无反应则可判定其死亡并进行记录。 除了死亡率，预试验中获得的其他信息也有助于确定正式试验的浓度范围。 因此，对于成虫行为(如钻入土壤的能力受到抑制、静止不动地贴在试验容器的玻璃内壁上)和形态(如出现明显的伤口)上的变化也应与幼虫的出现一并记录在案。 后者的测定可参照附录 E中描述的方法进行。

　　通过计算受试生物死亡的几何平均值确定 LC50 。设置正式试验的浓度范围时，可假设对线蚓繁殖产生影响的浓度低于 LC50 的 1/10。 但该假设仅依据经验而定，在特殊的情况下可能有差异。 预试验中观测到的其他指标如幼虫出现的数量有助于准确确定正式试验中受试物的浓度范围。

　　为了准确计算 LC50 值，预试验中每个浓度宜至少设置 4 个平行，同时包括足够数量的试验浓度组，以便在其中尽量获得至少 4 个具有统计学意义的显著性差异的平均浓度。 试验浓度的数量和对照组的平行数应尽量接近。

　　9 . 5 正式试验

　　9 . 5 . 1 方案

　　有以下 3 个正式试验方案可供选择：

　　a) 为了测定 NOEC,应至少设置 5 个呈等比数列的浓度。 每个浓度宜设定 4 个平行，以及 8 个空白对照。 相邻浓度之间的等比系数不应超过 1 . 8 。

　　b) 为了测定 EC狓 值(如 EC10、EC50) ,应至少设置 5 个浓度，并确保 EC狓 值包括在这 5 个浓度的范围内，以便通过内插法而非外推法得到 EC狓 。每个浓度至少设置 4 个平行，空白对照也至少设置 4 个平行。 浓度等比系数可变，例如，在预期的效应浓度范围内该系数可小于或等于 1 . 8,在较高和较低浓度范围可大于 1 . 8 。

　　c) 可采用联合法同时测定 NOEC 和 EC狓 。8 个处理浓度以等比数列设置，每个处理浓度包括4 个平行，空白对照包括 8 个平行。 相邻浓度间的等比系数不应超过 1 . 8 。

　　9 . 5 . 2 方法

　　每个试验容器放入 10 条线蚓。 在试验开始时添加食物，此后每周添加一次直至 21 d(包括 21 d)。第 21 天以人工的方法仔细地检查土壤样品，观察并记录存活的线蚓数，同时记录受试生物的行为(如钻入土壤的能力受到抑制、静止不动地贴在试验容器的玻璃内壁上)和形态上的变化(如出现明显的伤口)。从试验容器和土壤中移除所有的成蚓。 将含有蚓茧的试验土壤在相同的试验条件下继续培养 3 周，仅在第 35 天饲喂一次(如每个试验容器加入 25 mg经研磨的燕麦片)。

　　6 周后，统计新孵化的幼虫数。 尽管可采用湿法提取(不加热)和浮选技术[12-15] ,但由于土壤沥出液中悬浮的黏土颗粒可引起浑浊，妨碍测定，因此宜使用孟加拉红法检测新孵化的线蚓(参见附录 E) 。

　　9 . 6 限度试验

　　若预试验中最高浓度(如 1 000 mg/kg)下未观察到任何抑制效应，则可采用 1 000 mg/kg 进行限

　　GB/T 35514—20 17

　　度试验。

　　9 . 7 试验方案

　　试验方案如下(见表 1) :

　　表 1 试验操作步骤

　　10 试验有效性

　　对于一个有效的试验，其对照组应满足下列条件：

　　a) 预试验结束时及繁殖试验开始 3 周后，成蚓的死亡率不应超过 20%。

　　b) 假定开始试验时每个容器装入 10 条成蚓，则试验结束时，平均每个容器应至少产出 25 条幼虫。

　　GB/T 35514—20 17

　　c) 繁殖试验结束时，幼虫产出平均值的变异系数不应高于 50%。

　　若试验不能符合上述有效性标准，除非能够提供继续试验的正当理由，否则应终止试验。 继续试验的理由应在试验报告中阐述。

　　1 1 数据处理

　　1 1 . 1 结果处理

　　本标准在附录 F 中给出了相关概述。

　　预试验中，主要的试验终点是死亡率。 成蚓行为(如钻入土壤的能力受到抑制、静止不动地贴在试验容器的玻璃内壁上)或形态(如出现明显的伤口)上的变化也应与幼虫的出现一并记录在案。 通常采用概率分析[16] 或逻辑回归计算 LC50 。但若上述分析方法不适用(如少于 3 个浓度组出现部分死亡)，可使用其他替代方法，包括移动平均法[17] 、修正的 Spearman-Karber法[18] 或简单内插法(如 LC0 和 LC100的几何平均值，通过 LC0 与 LC100 乘积的平方根计算获得)。

　　正式试验的试验终点是繁殖力(即幼虫繁殖数量)。 与预试验相同，所有其他的损害效应也应反映在最终报告中。 繁殖试验中对数据进行统计分析时，应计算每个处理组和对照组的平行的算术平均值和标准偏差。

　　若进行方差分析，假设方差不依赖于浓度，可用单因素方差分析(ANOVA)中得到的合并方差及其自 由度分别替代标准偏差 s 和自由度 df。此时，可使用对照组和处理组的单一方差。 这些数据可采用每个试验容器的结果作为平行，通过相关商业统计软件计算。 将空白对照和溶剂对照的数据进行合并比单独针对其一进行分析更具合理性，前提是应对这两个对照组的数据进行检验并确认其无显著性差异(检验方法可参考附录 F) 。

　　进一步的统计分析和推断依赖于各个平行的数据是否为正态分布以及平行数据的方差是否齐性。

　　1 1 .2 NOEC的估算

　　应优先使用有效的试验数据，例如，比对试验中获得的经验信息，或其他关于数据是否近拟正态分布的历史数据。 方差的齐次性(即方差齐性)尤为关键。 经验表明方差通常随着平均值的升高而升高，此时进行数据转换可获得方差齐性。 但是，这些转化应基于历史数据相关的经验，而非调查数据。 对于具有方差齐性的数据，应采用多重 t 检验如 Williams′s 检验(α= 0.05,单边检验)[19-20] ,特定情况下可采用 Dunnett s检验[21-22] 。需要注意的是当平行数不等时，应按照 Dunnett 和 Williams 方法所建议的对表中的 t值进行校正。 方差较大时，毒性效应未表现出规律性地升高或降低，此时由于与单调性产生了显著偏差，Dunnett检验更为适用。 若存在方差齐性的偏离，则应更严密地检查其对方差可能造成的影响，以便决定是否采用 t 检验，而不会导致有效性的显著降低[23] 。也可选用以下统计方法，如多重U检验或根据 Holm 的 Bonferroni-U检验[24] ;对于存在异方差性但符合单调浓度-效应关系的数据，可采用非参数检验，如Jonckheere-Terpstra[25-26] 或 Shirley检验[27-28] ,通常优先采用方差非齐性 t检验(参见附录 F) 。

　　若进行限度试验，且已具备进行参数检验的前提条件(如正态分布、方差齐性)，则可采用配对的

　　t检验或 Mann-Whitney-U检验[24] 。

　　1 1 .3 ECx 的估算

　　在获得适当的浓度-效应关系后，对每个处理的平均值应用回归分析(线性或非线性)，计算 ECx值 。将蚓虫生长作为一个连续效应，采用合适的回归模型估算 ECx[29] 。对于量化数据(死亡/存活及繁殖的幼虫数)宜采用的函数包括：含有 2 个 ~4 个参数的正态 S型曲线函数、logistic或 Weibull 函数，其

　　GB/T 35514—20 17

　　中部分函数能够模拟兴奋效应。 若采用线性回归分析拟合浓度-效应关系，在将对照组平均值的 狓%代入回归分析获得的公式中估算 EC狓 之前，应先通过回归分析找到重要的参数 r2(决定系数)和斜率。 根据 Fieller或其他适用的现代统计方法计算 95%置信限[16] 。

　　此外，毒性效应也可按照模型参数的一定比例进行建模，模型参数即为对照组的平均效应。 上述情况下，通常可根据概率回归的程序采用正态(logistic、Weibull) S 型曲线拟合数据[16] ,同时对权重函数的度量效应进行校正[30] 。但若观察到兴奋效应，应采用四参数 logistic 或 Weibull 函数代替概率分析，按照非线性回归的步骤进行拟合[31] 。若无合适的剂量-效应函数用于拟合试验数据，也可采用其他替代的方法估算 EC狓 及其置信限，例如移动平均法[17] 和 Trimmed Spearman-Karber法[18] 。

　　12 结果报告

　　试验报告应至少包括以下内容：

　　a) 受试物

　　— 物理性质，以及相关的物理-化学特性(例如，水溶性、蒸气压);

　　— 根据 IUPAC命名法、CAS号、批次、标签、结构式和纯度确定受试物的化学识别信息;

　　— 样品有效期。

　　b ) 受试生物

　　— 所用的受试生物：种、学名、生物来源以及饲喂条件。

　　c) 试验条件

　　— 人工土壤的组分和制备;

　　— 受试物的添加方法;

　　— 试验条件的描述，包括温度、含水量、pH 值等;

　　— 试验方案和操作步骤的详细描述。

　　d) 试验结果

　　— 2 周后成蚓的死亡率以及预试验结束时幼虫出现的数量;

　　— 暴露 3 周后成蚓的死亡率，并在正式试验结束时完整记录幼虫的各项指标;

　　— 任何可观察到的受试生物生理病变及其行为变化;

　　—LC50、繁殖效应的 NOEC 和/或 EC狓(如 EC50、EC10) 及其置信限(如适用)，用于计算所有数据的拟合模型图谱，以及有助于解释试验结果的观察现象。

　　e) 对于本标准的任何偏离以及试验过程中的特殊现象。

　　GB/T 35514—20 17

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　土壤 PH值的测定

　　用于测定土壤样品 pH 值的方法主要基于 ISO 10390 [5] 。

　　将一定量的土壤在室温条件下持续干燥至少 12 h,用 1 mol/L 分析纯 KCl 溶液或 0 . 01 mo1/L 分析纯 CaC12 溶液配制成 5 倍于土壤体积的土壤悬浮液(至少含有 5 g 土壤)。将悬浮液充分震荡 5 min。振荡后，将悬浮液静置至少 2 h但最长不超过 24 h。然后用 pH 计测定水相的 pH,每次测定前应采用适当的缓冲溶液(如 pH 4.0 和 pH 7.0)对 pH 计进行校准。

　　GB/T 35514—20 17

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　最大持水量的测定

　　已证实以下方法适用于本标准，详见 ISO DIS 11268-2 的附录 C 。

　　使用适当的工具(如螺旋钻采样管等)取一定量(如 5 g) 的试验土壤基质。 用一张滤纸覆盖该管底部，往管中注满水后将其置于水浴的支架上。 将该管逐渐没入水中，直至水位没过土壤的顶部。 将该管置于水中约 3 h。 由于土壤毛细作用无法保持住全部被其孔隙所吸收的水分，因此将该管置于一个底部铺满潮湿且精细石英砂的密闭容器(防止水分蒸发)中约 2 h,使土壤样品沥干水分。 然后对样品称重，105 ℃烘干至恒重。 持水量(WHC)通过式(B. 1)计算：

　　……………………( B.1 )

　　式中：

　　犛 —水饱和基质的质量 + 采样管质量 + 滤纸质量;

　　犜 —皮重(采样管质量 + 滤纸质量);

　　犇 — 基质干重。

　　GB/T 35514—20 17

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　其他种类线蚓的试验操作

　　C.1 物种的选择

　　除白线蚓(E.albidus)外 ，其他线蚓种也可用于试验，但是对试验程序和有效性标准都应做出相应的调整。 由 于 许 多 线 蚓 种 都 可 轻 易 获 得，并 且 能 在 实 验 室 较 好 地 培 养，因 此 选 择 白 线 蚓( E. albidus)之外的其他线蚓种最重要的标准是其生态相关性以及接近的敏感性。 更换受试生物种还需提供正当的理由。 例如，有些国家没有白线蚓或由于检疫限制等原因无法进 口 白线蚓，则有必要使用其他的线蚓种。

　　C.2 适用的替代性线蚓种

　　适用的替代性线蚓种包括：

　　a) Enchytraeuscrypticus：近年来，因其驯养和试验简便，该物种常用于生态毒理学研究。 然而与白线蚓相比，Enchytraeuscrypticus体型小，操作起来较为困难(特别是在使用染色法的前期阶段)。到 目前为止，尚未有发现 E.crypticus存在于田间的确定信息，只有来 自蚯蚓驯养中的描述，因此它的生态学方面的要求仍然未知。

　　b) Enchytraeusbuchholzi：此名称可能涵盖了一组在形态上难以区分的近缘物种。 试验时不宜使用该物种，除非用于试验的个体能够鉴定到种。 E.buchholzi经常出现在草地和受到干扰的场所，如路边。

　　c) Enchytraeusluxuriosus：该种最初被称为 E.“minutus”，最近才对它有了进一步描述[32] 。它由 U. Graefe在一个靠近 St. Peter-Ording(德国，Schleswig-Holstein) 的草地上首次发现。E. luxuriosus体长约为白线蚓的一半，但是均大于本附录中提及的其他线蚓种，这使得它成为白线蚓的一个较好的替代物种。

　　d) Enchytraeusbulbosus：迄今为止，有报道表明该物种来源于德国和西班牙的矿质土壤，比较常见，但通常情况下数量并不十分丰富。 相对于该属的其他体型较小的种来说，它比较容易辨别 。该物种在室内试验中的行为及对化学品的敏感性等方面的信息尚不清楚，但已发现该物种较为容易培养。

　　C.3 饲喂条件

　　上面提及的所有线蚓种均可使用与白线蚓(E.albidus)相同的基质进行培养。 它们较小的体型意味着可使用体积较小的培养容器，且当饲喂相同食物时，应调整饲喂量。 上述物种的生命周期均短于白线蚓，因此应增加饲喂的频率。

　　C.4 试验条件

　　一般情况下，上述各线蚓种的试验条件与白线蚓(E.albidus)的相同，以下除外：

　　a) 可使用更小的容器，但并非必需;

　　GB/T 35514—20 17

　　b) 可缩短繁殖试验的时间，如将 6 周改为 4 周，但并非必需，不应改变预试验的时间;

　　c) 考虑到幼虫的体型更小，宜使用染色法进行计数;

　　d) 关于“在对照组中每个试验容器的幼虫数”有效性的指标，应改为“50 ”。

　　GB/T 35514—20 17

　　附 录 D

　　(资料性附录)线蚓的驯养条件

　　线蚓中的白线蚓种及其他线蚓种可用大塑料箱(如 30 cm× 60 cm× 10 cm)进行培养，箱里装有由人工土壤和自然无污染的菜园土按照 1 ∶ 1 比例混合的土壤。 由于堆肥可能含有毒物质，如重金属，应避免使用。 土壤使用前应去除其中的生物，可采用低温冷冻的方式。 可使用仅含有人工土壤的基质，但其繁殖率可能低于用混合土壤基质培养得到的繁殖率。 用于线蚓培养的基质 pH 值应为 6 . 0±0 . 5 。

　　受试生物应在温度为(15±2) ℃~(20±2) ℃的黑暗环境中进行培养，温度不高于 23 ℃ 。土壤保持潮湿状态，但不能过于湿润。 当用手指轻轻挤压土壤时，若指间出现小水滴则表明土壤的含水量适中。确保培养容器的盖子可允许与大气进行充分的气体交换，以避免缺氧。 每周应小心地给土壤松土以利于通气。

　　线蚓可用燕麦片进行饲喂。 燕麦片应贮存在密封的容器中，并且在使用之前进行高压或高温灭菌

　　处理，以避免感染粉尘螨(如 Glyzyphagus sp. , Astigmata，Acarina)或捕食性螨类[如 Hypoaspis (cosmolaelaps)miles，Gamasida，Acarina]。经过加热处理后，食物变得酥脆，可较为容易地撒落在

　　土壤表面。 有时，可通过添加维生素、牛奶和鱼肝油来对燕麦片进行补充。 其他适用的食物包括面包酵母和鱼食。

　　一周约饲喂两次。 可将适量的燕麦片撒在土壤表面，或在给土壤松土进行通气时，小心地将食物混入土壤基质。 食物的供应量取决于土壤基质中培养的线蚓数量。 若添加的食物在一天之内全部消耗完全，则应增加食物的供应量。 相反，若在第二次饲喂时(即一周后)发现仍有食物残留在土壤表面，则应减少食物的供应量。 应当移走和替换受到真菌污染的食物。 培养 3 个月后，应将线蚓转移至新制备的基质中。

　　若线蚓满足以下条件，则可认为培养条件是合适的：

　　a) 无逃离土壤基质的意图;

　　b ) 可在土壤中快速移动;

　　c) 体表光亮且未黏附土壤颗粒;

　　d) 出现或多或少的白色斑点;

　　e) 培养过程中出现多个生长阶段的蚓虫;

　　f) 能够持续繁殖。

　　GB/T 35514—20 17

　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　受试生物的计数方法

　　E.1 孟加拉红染色法

　　该方法源于湖泊生态学[15] ,由 W. de Coen(比利时，根特大学)首次将其应用于线蚓繁殖试验中的幼虫计数。 RIVM(Bilthoven)开发了一个改良版方法，用甲醛替代乙醇与孟加拉红混合[12 , 33] 。

　　正式试验结束时(如 6 周后)，将试验容器中的土壤转移至一个较浅的容器中。 Bellaplast 容器或带有棱纹底部的光照池均适用，后者的底部棱纹可限制线蚓移动，使其一直处于观察视野范围内。 用乙醇(每个平行 约 5 mL) 将 幼 虫 固 定。 然 后 往 试 验 容 器 中 注 水 至 水 层 高 约 1 cm~ 2 cm。 加 入 几 滴 (200 μL ~300 μL)孟加拉红(1%的乙醇溶液)，也可用 0 . 5%的曙红代替，将水与染料仔细混合。 12 h后，线蚓将被染成微红并且平铺在基质表面，从而易于计数。 在进行线蚓计数前，也可用筛网(筛孔

　　0 . 250 mm)将基质/酒精混合物洗去。 通过该处理，高岭土、泥炭块以及部分石英砂将被洗去，更易于对染成微红色的线蚓进行观察和计数。 使用照明镜头(镜头尺寸至少为 100 mm × 75 mm, 放大倍数为2×~3×)有助于计数。

　　上述染色技术可将每个容器的计数时间减少至几分钟，使得能在最多两天时间内完成一个试验中所有容器的计数。

　　E.2 湿法提取

　　湿法提取应在试验结束后立即进行。 将每个容器中的土壤放入筛孔约为 1 mm 的塑料筛中，然后将筛网悬空放置在塑料盆中，盆不能触碰到筛网底部。 小心地往塑料盆中注水，直至筛网中的样品完全没入水中。 为了确保线蚓的回收率超过 90%,应在 20 ℃ ±2 ℃的条件下提取 3 d。 提取结束时，将筛网从水中取出，同时将盆中的水(水量较少的除外)慢慢倒出，注意不能干扰盆底部的沉积物。 然后轻微晃动塑料盆使沉积物悬浮于上覆水中。 将盆中的水倒入培养皿中，待土壤颗粒沉降后，线蚓即可被识别，然后用软钢镊子将线蚓移至体视显微镜下进行计数。

　　E.3 浮选法

　　R. Kuperman在其记录中描述过浮选法[34] 。将试验容器中的物质用乙醇固定后，往土壤中注入硅溶胶(AM-30 硅胶，质量分数为 30%的水悬浮液)直至液面高于土壤表面 10 mm~ 15 mm。 将土壤和浮选剂充分混合 2 min ~3 min后，幼虫将浮在表面并易于被计数。

　　GB/T 35514—20 17

　　附 录 F

　　(资料性附录)

　　数据统计评估的概括(NOEC的确定)

　　数据统计评估流程见图 F. 1 。

　　图 F.1 数据统计评估流程图

　　GB/T 35514—20 17

　　参 考 文 献

　　[1] Becker, H. (1991) . Bodenorganismen-Prüfungskategorien der Forschung. UWSF-Z. Um- weltchem . ?kotox. 3 , 19-24 .

　　[2] Rmbke, J. and Federschmidt, A. (1995) . Effects of the fungicide Carbendazim on En- chytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4 , 79-96.

　　[3] Rmbke, J. and Moser, T. (1999) . Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99 , 150 -223 pp.

　　[4] Rmbke, J. , Riepert, F. & Achazi R. (2000) : Enchytraeen als Testorganismen. In: Tox- ikologische Beurteilung von Bden. Heiden, S. , Erb , R. , Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.) . Spek- trum Verl. , Heidelberg. 59-81.

　　[5] ISO (International Organization for Standardization) (1994) . Soil Quality—Determination of pH , No. 10390. ISO , Geneve.

　　[6] Bell, A.W. (1958) . The anatomy of Enchytraeusalbidus，with a key to the species of the genus Enchytraeus.Ann. Mus. Novitat. 1902 , 1-13.

　　[7] Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959) . The Enchytraeidae, critical revision and taxono- my of European species. Natura Jutlandica 8-9 , 1-160.

　　[8] Kasprzak, K. (1982) . Review of enchytraeid community structure and function in agricul- tural ecosystems. Pedobiologia 23 , 217-232.

　　[9] Rmbke, J. (1989) . Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen—En- chytraeen. Abschluβbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin) , FEVorhaben 106 03 051/01 .

　　[10] Bouguenec, V. and Giani, N. ( 1987 ) . Deux nouvelles especes d ′ Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d ′E bigeminus.Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23 , 9-22 .

　　[11] GB/T 21828—2008 化学品 大型搔繁殖试验

　　[12] Dirven-Van Breemen , E. , Baerselmann , R. and Notenboom , J . (1994) . Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeusalbidusen Enchytraeuscrypticus(Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp.

　　[13] Rmbke, J. (1995) . Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF-Z. Umweltchem. ?kotox. 7 , 246-249 .

　　[14] Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997) . Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York.

　　[15] Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968) . The colouring of bottom-fauna samples before sor- ting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32 , 300-305.

　　[16] Finney, D.J. (1971) . Probit Analysis (3rd ed.) , pp. 19-76. Cambridge Univ. Press.

　　[17] Finney, D.J. (1978) . Statistical Method in Biological Assay.-Charles Griffin & Company Ltd , London.

　　[18] Hamilton, M. A. , R. C. Russo and R. V. Thurston. (1977) . Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays . Environ. Sci. Technol. 11

　　(7) , 714-719 ; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998) , 417 .

　　[19] Williams , D. A. , (1971) . A test for differences between treatment means when several

　　GB/T 35514—20 17

　　dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27 , 103-117.

　　[20] Williams, D.A. , (1972) . The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28 , 519-531 .

　　[21] Dunnett, C. W. , (1955) . A multiple comparison procedure for comparing several treat- ments with a control. Amer. Statist. Ass . J . 50 , 1096-1121 .

　　[22] Dunnett, C. W. , (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20 , 482-491 .

　　[23] Hoeven, N. van der, (1998) . Power analysis for the NOEC: What is the probability of de- tecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7 : 355-361.

　　[24] Holm, S. , (1979) : A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Stat- ist. 6 , 65-70 .

　　[25] Jonckheere, A. R. (1954) ; A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alterna- tives , Biometrika 41 , 133-145 .

　　[26] Terpstra, T. J. (1952) ; The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall’s Test A- gainst Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14 , 327-333.

　　[27] Shirley, E. A. (1979) ; The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28 , 144-151.

　　[28] Williams, D.A. (1986) ; A Note on Shirley’s Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control , Biometrics 42 , 183-186 .

　　[29] Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981) . Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York.

　　[30] Christensen, E. R. , (1984) . Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18 , 213-221 .

　　[31] Van Ewijk, P. H. and J.A. Hoekstra. (1993) . Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25 , 25-32.

　　[32] Schmelz, R.M. and Collado, R. (1999) . Enchytraeusluxuriosussp.nov. , a new terrestrial oligochaete species(Enchytraeidae，clitellata，Annelida).Carolinea 57 , 93-100.

　　[33] Posthuma , L. , Baerselmann. R. , Van Veen , R. P. M. and Dirven-Van Breemen , E. M. (1997) . Single and joint toxic effects of copper and zinc on reproduction of Enchytraeuscrypticus in relation to sorption of metals in soils. Ecotox. Envir. Safety 38 , 108-121.

　　[34] Phillips, C.T. , Checkai, R.T. and Kuperman, R.G. (1998) . An alternative to the O′Con- nor Method for Extracting Enchytraeids from Soil. SETAC 19th Annual Meeting, Charlotte, USA. Abstract Book No. PMP069 , p. 157.