GB/T 35507-2017 生化用试剂测定通则

　　ICS 7 1 . 040 . 30 G 60

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35507—2017

　　生化用试剂测定通则

　　Generalruleforbiochemicalreagents

　　2017-12-29 发布 2018-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35507—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中国石油和化学工业联合会提出。

　　本标准由全国化学标准化技术委员会化学试剂分会(SAC/TC 63/SC 3)归口 。

　　本标准起草单位：中国计量科学研究院、中国科学院过程工程研究所、北京化学试剂研究所、广西分析测试研究中心、江苏省计量科学研究院、广州康昕瑞基因健康科技有限公司、中国测试技术研究院。

　　本标准主要起草人：全灿、罗坚、李红梅、刘守廷、韩宝英、孟蓉、王玉华、欧阳广娜、盛司潼、周李华、石莲花、郝媛、杨菡、宋德伟、黄挺、隋志伟、金有训、肖鹏。

　　GB/T 35507—20 17

　　生化用试剂测定通则

　　1 范围

　　本标准规定了生化用试剂的通用事项及通用方法。

　　本标准适用于生化缓冲剂、糖类、脂类、核酸、氨基酸、酶、蛋白质等生化用试剂的检验。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 9721 化学试剂 分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分)

　　GB/T 9724 化学试剂 pH 值测定通则

　　GB/T 11446 . 9 电子级水中微粒的仪器测试方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 23977 染料 含盐量的测定 电导率法

　　GB/T 30301 高纯试剂试验方法通则

　　GB/T 33087 仪器分析用高纯水规格及试验方法

　　QJ 2214 洁净室(区)内洁净度级别及评定

　　YY 0569 Ⅱ级生物安全柜

　　中华人民共和国药典(2015 版 )

　　3 术语和定义

　　GB/T 9721、GB/T 30301、GB/T 33087 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　生化用试剂 biochemicalreagents

　　生物领域中的生物化学或化学检测、合成用的化学试剂，如应用于基因操作、细胞融合、组织细胞培养等过程。

　　3.2

　　灭菌 sterilization

　　杀灭对象中存在的微生物。 常用的灭菌方法有加热法、过滤法、辐照法、气体法以及医用液体法等。

　　3.3

　　除菌 removalofbacteria

　　通过过滤或者清洗方法除去对象中的微生物。

　　3.4

　　指标菌 indexbacteria

　　用来选择灭菌条件或者确认灭菌效果的细菌。

　　3.5

　　无菌条件 asepticcondition

　　环境与对象中不存在任何微生物生长的条件。 灭菌操作可形成无菌条件，且该条件应通过无菌方

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　　法等进行测试。

　　3.6

　　超滤 ultrafiltration

　　采用反渗透膜、超滤膜或两者组合等膜过滤装置进行的滤过除去 目标对象中包括病毒、支原体、细菌、真菌和毒素等微生物。

　　3.7

　　酶单位 enzymeunit

　　在特定的时间、条件下，将单位数量的底物转化为产物所需要的酶量。

　　3.8

　　酶活力 enzymeactivity

　　酶的催化活性程度，即酶的反应速率。 酶活力用酶单位表示。

　　3.9

　　比活力 specificactivity

　　单位量的酶表现出来的活力。

　　3 . 10

　　酶失活 deactivationofenzyme

　　使酶的活性降低或消失，或酶自身活性的降低或消失。 酶失活包括热失活、酸失活等，也可由添加酶抑制剂以及去除辅助因子等因素造成。

　　4 通用事项

　　4 . 1 试验环境

　　4 . 1 . 1 总则

　　除特殊说明外，生物安全部分按照 GB 19489 的规定执行。

　　4 . 1 . 2 实验室

　　按 QJ 2214 规定，测定实验室中悬浮粒子数。生物洁净室中的 0. 5 μm 粒径以上的粒子数宜在

　　3 . 5 × 10 3 个/m3 以下 。

　　4 . 1 . 3 洁净工作台

　　按照 GB/T 30301 的标准执行。 可根据需要配备空气幕。

　　4 . 1 . 4 生物安全柜

　　按 YY 0569 的规定执行。

　　4 . 1 . 5 防辐射设施

　　设计防辐射设施是为了预防在进行放射性同位素操作及发生污染时，可能造成的辐射损伤。

　　4 . 2 实验用水

　　实验用水符合 GB/T 33087 规定。

　　4 . 3 试剂

　　除另有说明，本标准仅使用最高级别的试剂。 应确认空白测定值不影响样品的测定。 需要避光的

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　　试剂应存放于含有锰、铁等元素的有色玻璃器皿内。 特殊情况下，可使用石英玻璃或硼硅酸盐低碱玻璃(热阻玻璃)。

　　4 . 4 标准物质

　　标准物质和标准溶液应附有不确定度证书。

　　4 . 5 器具

　　4 . 5 . 1 玻璃器具

　　应使用一级硬玻璃或经过钝化处理的玻璃器具。 对于玻璃中的某些组分，如钠、钾、硼、硅、铝等，应留意其可能发生的溶解现象。 带有磨口部分的器具，磨口部分易附着污染物，应使用带有透明磨口的玻璃器具。

　　4 . 5 . 2 石英器具

　　应使用透明石英玻璃制作的石英器具。 带有磨口部分的器具，磨口部分易附着污染物，应使用带有透明磨口的石英器具。

　　4 . 5 . 3 合成树脂器具

　　应使用聚四氟乙烯树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、丙烯酸树脂等制作的合成树脂器具。 不添加染料、填充物以及阻燃剂。

　　4 . 5 . 4 铂器具

　　应使用纯度 99.9%以上铂制成的铂器具。

　　4 . 6 器具的清洗和保存

　　4 . 6 . 1 玻璃器具和石英器具

　　先用 自来水充分清洗，再用 50 ℃ ~60 ℃的硝酸溶液(1+1)浸泡，最后以实验用水冲洗。

　　4 . 6 . 2 合成树脂器具

　　将被清洗器具置入盛有硝酸溶液(1+3)的聚丙烯树脂容器中浸泡 2 h 以上，再超声清洗 1 h 以上，

　　最后以实验用水充分冲洗。

　　4 . 6 . 3 铂器具

　　将被清洗器具置入 80 ℃以上的硝酸溶液(1+3)中浸泡超过 1 h,然后用实验用水充分洗净。如以

　　前试验造成器具交叉污染，可先用熔化的焦硫酸钾或硫酸氢钾溶液去除污染物后，再进行清洗。

　　4 . 6 . 4 器具的保存

　　器具清洗后应进行干燥，塞紧瓶塞，存放于无污染的环境中。

　　4 . 7 灭菌

　　在灭菌操作前，应先确认工作环境。 根据操作条件和 目标物属性，参照表 1 选择一种或多种灭菌方法进行灭菌。

　　应对水、试剂、容器、器械以及工作服等灭菌，对内毒素进行灭活和去除。 在检查工作环境的适应性

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　　时，可利用指标菌。 根据灭菌方法按表 2 选择合适的常用指标菌。

　　表 1 灭菌方法

　　表 2 常用指标菌

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　　表 2(续)

　　4 . 8 取样

　　4 . 8 . 1 常规取样

　　在洁净环境下，使用洁净、干燥器具取样。 样品应具有代表性，样品用量尽可能少。

　　4 . 8 . 2 不稳定样品取样

　　对于空间结构易变换的酶、核酸氨基酸、易氧化酶解等容易分解或变质的不稳定样品，宜在低于 10 ℃

　　的低温下尽快完成取样。

　　4 . 8 . 3 无菌取样

　　应在生物洁净室或清洁程度等同或优于此条件的清洁环境内进行，使用已消毒的器具尽快完成取样。

　　4 . 8 . 4 放射性同位素样品

　　应在防辐射防护设施内进行取样。 注意防护，避免辐照损伤。

　　4 . 9 样品处理和试验操作注意事项

　　4 . 9 . 1 一般要求

　　应尽快完成取样、制备样品溶液和工作标准曲线以及储存样品，以减少水、试剂蒸发、容器、工具、环境等因素对样品浓度的影响。 工作人员应穿戴无纤维飞散的洁净服装以免污染样品。

　　溶液使用前应摇匀。 当进行等分试样取液时，禁止把吸管直接插入存储容器内，溶液一旦取出，严禁放回。

　　4 . 9 . 2 无菌处理

　　特定情况外，无菌处理方法如下：

　　a) 每次取样应在生物洁净室或清洁程度等同或优于此条件的清洁环境内进行，取样速度应尽可能快，以防外界污染;

　　b) 使用已灭菌的器具。进行内毒素试验时，应使用已灭活内毒素的器具;

　　c) 工作服应进行消毒灭菌;

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　　d) 实验操作人员应佩戴消毒手套，穿工作服，用消毒液清洗手部。裸露在外的胳膊需用消毒液充

　　分洗净。

　　4 . 9 . 3 放射性同位素样品的处理

　　样品中含有放射性同位素时，操作人员应在防辐射设施保护下进行。

　　4 . 10 废弃样品、试剂和容器的处理

　　废弃样品、试剂和容器的处理应遵循以下原则：

　　a) 在处理废弃样品、试剂和容器之前，应保证操作人员和周围环境的安全。对于毒性极强的物质，应进行适当的无害化处理。

　　b) 为了降低污染物的毒性，防止有毒物质的泄漏，应根据废弃物质的性质，对其进行无害化处理。

　　c) 当处理内毒素试验中的样品、试剂和容器时，在废弃前，需采用高压蒸汽灭菌器或小型高压蒸汽灭菌器在 121 ℃处理 1 h 或更长时间灭菌。

　　d) 对于辐射危害废弃物，需具有资质的专业机构处理。

　　5 空白测定

　　需要确认实验用水、试剂、器具、容器、试验环境的空白测定值不影响测定结果。

　　6 通用试验方法

　　6 . 1 气相色谱法

　　按 GB/T 30301 的规定测定。

　　6 . 2 液相色谱法

　　按 GB/T 30301 的规定测定。

　　6 . 3 液相色谱质谱联用法

　　按 GB/T 30301 的规定测定。

　　6 . 4 分光光度法

　　按 GB/T 9721 的规定测定。

　　6 . 5 考马斯亮蓝法

　　按《中华人民共和国药典》2015 版中通则 51 第五法的规定测定。

　　6 . 6 电导率

　　根据产品标准规定制备样品溶液，按 GB/T 23977 的规定测定。

　　6.7 PH值

　　根据产品标准规定制备样品溶液，按 GB/T 9724 的规定测定。

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　　6 . 8 微粒

　　按 GB/T 11446 . 9 的规定测定。

　　6 . 9 等电聚焦电泳法

　　6 . 9 . 1 一般规定

　　除按《中华人民共和国药典》2015 版中通则 0541 第六法的规定测定外，还应符合下列事项。

　　6 . 9 . 2 仪器

　　6 . 9 . 2 . 1 恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽(或水平板电泳槽)。

　　6 . 9 . 2 . 2 制胶模具 。

　　6 . 9 . 2 . 3 摇床(用于电泳胶脱色)。

　　6 . 9 . 2 . 4 凝胶成像仪。

　　6 . 9 . 3 仪器分析条件的选择

　　按下列规定的内容选择最佳条件：

　　a ) 最大电压;

　　b ) 最大电流;

　　c ) 温度 ;

　　d ) 迁移时间;

　　e) 电极液的组成、浓度和 pH 值;

　　f) 样品量、组成和浓度。

　　6 . 9 . 4 操作方法

　　6.9.4. 1 制胶：准备电泳槽和电极液，采用两性电解质制备 pH 梯度凝胶。

　　6.9.4.2 电泳：将样品加入 pH 梯度凝胶，在设定温度和适当的电压或电流条件下进行电泳。

　　6 .9 .4 .3 固定与染色：电泳完成后，将凝胶放入固定液中固定 20 min 以上，然后进行染色，再采用脱色液浸洗至背景无色。

　　6 . 9 . 4 . 4 记录电泳结果：采用凝胶成像扫描仪或其他方式记录凝胶图像。

　　6 . 9 . 5 试验结果的表示

　　6 . 9 . 5 . 1 鉴别样品主成分迁移距离与标准品的一致性。

　　6 . 9 . 5 . 2 以标准品的等电点对其相应的迁移距离作线性回归，将样品的迁移距离代入线性回归方程，求出样品的等电点。

　　6 . 10 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)

　　6 . 10 . 1 一般规定

　　除按照《中华人民共和国药典》2015 版中通则 0541 第五法的规定测定外，还应符合下列事项。

　　6 . 10 . 2 仪器

　　6 . 10 . 2 . 1 电泳仪 。

　　6 . 10 . 2 . 2 凝胶成像仪 。

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　　6 . 10 . 2 . 3 微量进样器 。

　　6 . 10 . 3 操作方法

　　6 . 10 . 3 . 1 准备仪器：将玻璃板正确安装到电泳仪上，根据梳子的深度在玻璃板上标记分离胶的位置。

　　6 . 10 . 3 . 2 制备分离胶：依次加入各试剂制备分离胶，轻摇混匀后用滴管吸取适量混合液加于两玻璃板之间，然后在玻璃板间混合液中均匀加入约 1 mL水，约 30 min后，胶凝固成形，倒去上层水，用滤纸小心吸掉剩余水分。

　　6. 10.3.3 样品制备：取 10 μL 蛋白样品(1 μg/mL~5 μg/mL) ,加 10 μL 的缓冲溶液，于 100 ℃煮沸5 min(已知相对分子质量标准蛋白按同法处理)。

　　6. 10.3.4 制备浓缩胶：依次加入各试剂制备浓缩胶(4.5%) ,轻摇混匀后加到分离胶之上，加上分离梳，待胶凝固后去梳，用水小心冲洗加样道 2 次~3 次，甩干水分。

　　6 . 10 . 3 . 5 上样：用微量进样器吸取样品小心加到各泳道中。

　　6 . 10 . 3 . 6 电泳：加入缓冲液，恒压 100 V 至溴酚蓝到达分离胶前沿，改恒压为 200 V,直至溴酚蓝到达分离胶下沿。

　　6 . 10 . 3 . 7 染色：剥下凝胶，依次染色、脱色和终止。

　　6 . 10 . 4 试验结果的表示

　　用凝胶成像仪对凝胶进行数据处理。 将测定的系列已知相对分子质量的标准蛋白的电泳距离(或

　　迁移率)对各自相对分子质量的对数(logMr )作图得到标准工作曲线，由标准工作曲线确定样品中蛋白

　　质的相对分子质量。

　　6 . 1 1 荧光光谱法

　　按照 GB/T 30301 的规定测定。

　　6 . 12 圆二色谱法

　　6 . 12 . 1 仪器

　　圆二色谱仪。

　　6 . 12 . 2 仪器分析条件的选择

　　根据待测组分的特征，按照下列规定的内容选择最佳条件：

　　a) 扫描波长范围;

　　b ) 扫描速度;

　　c) 响应时间;

　　d) 灵敏度;

　　e) 谱带宽度;

　　f) 分辨率;

　　g) 样品浓度;

　　h ) 溶剂 ;

　　i) 缓冲剂;

　　j) 环境温度;

　　k ) 样品池光径;

　　l) 氮气流量。

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　　6 . 12 . 3 操作方法

　　连接氮气管路，使圆二色谱仪处于工作状态。 按照 6 . 12 . 2 设置试验参数，确认溶剂和缓冲剂对圆二色光谱信号不产生干扰。 将样品注入样品池，记录圆二色谱图，对谱图进行分析。

　　6 . 12 . 4 试验结果的表示

　　根据分子中各不对称结构的圆二色标准谱按其含量加权平均获得拟合曲线，对比试验测得的圆二

　　色谱图，最佳拟合条件下的加权平均系数即为蛋白质不同二级结构(α 螺旋、β 折叠和 丫转角)的相对

　　含量。

　　6 . 13 酶活力

　　6 . 13 . 1 原理

　　测量酶反应进行中产物的生成量或底物的减少量，计算其反应速率，进而测定酶的相对消耗量，得到酶活力。

　　6 . 13 . 2 试剂

　　6 . 13 . 2 . 1 缓冲溶液

　　测定酶活力时，通常选择在目标酶最适 pH 值条件下缓冲作用最强的溶液。缓冲溶液会抑制 目标

　　酶活力，为此，应对缓冲溶液的类型和浓度进行遴选。

　　如果所测酶需要辅因子(辅酶、活化剂)，应提前向缓冲溶液中加入足量辅因子，确保酶的活化。 对于某些易溶于有机溶剂、不溶于或难溶于水的底物，可向缓冲溶液中加入对反应无干扰的有机溶剂，增

　　大底物的溶解度。通常，加入的有机溶剂会改变缓冲溶液 pH 值，需按 6.7 的规定，重新测定缓冲溶液的 pH 值。

　　6 . 13 . 2 . 2 底物溶液

　　底物液应能将最适合于目标酶的高纯底物溶解于对酶活力测定无干扰的缓冲溶液至适宜浓度。 底物液通常为水、缓冲溶液及有机溶剂等。 在应用天然物质，尤其是人工合成的高分子材料作为底物时，不同批次的底物可能引起酶活力测定结果的波动，因此最好使用同一批次的底物进行实验。 当改变批次时，应首先检查前后批次间酶活力的变化。 建议底物溶液为新鲜配制，一旦配好宜尽快使用。

　　6 . 13 . 3 仪器

　　6 . 13 . 3 . 1 恒温器 。

　　6 . 13 . 3 . 2 涡旋混合器 。

　　6 . 13 . 3 . 3 移液器 。

　　6 . 13 . 3 . 4 氧电极、氧电极反应器及氧电极电路。

　　6. 13.3.5 pH 控制器。

　　6 . 13 . 3 . 6 旋光仪 。

　　6 . 13 . 3 . 7 黏度计 。

　　6 . 13 . 3 . 8 离子选择性电极。

　　6 . 13 . 3 . 9 磁力搅拌器 。

　　6. 13.3. 10 pH 计。

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　　6 . 13 . 4 样品溶液的制备

　　将样品溶于水或其他适宜缓冲溶液至适于酶活力测定的浓度。 当样品中含有干扰酶活力的杂质时，应尽可能降低杂质含量。 如需要添加辅酶、活化剂等，则应在活性测定前加入足量辅因子。 对于不稳定样品，则需加入合适的不妨碍活性测定的稳定剂。

　　通常情况下，样品在受热和稀释状态下不稳定，稀溶液在室温下会逐渐失去活性，在使用前新鲜配制高浓度的样品溶液亦冷藏保存以备测定。 如果样品热稳定，应将样品溶液保存在设定的反应温度下。

　　6 . 13 . 5 试验方法

　　6 . 13 . 5 . 1 氧电极法

　　通过氧电极电流测定酶反应前后反应液中溶解氧含量的变化，换算出底物消耗量或产物生成量。

　　6 . 13 . 5 . 2 测压法

　　利用压力表测定酶反应前后反应器中气体压力变化，换算出底物的消耗量或产物的生成量。

　　6. 13.5.3 PH控制器法

　　利用 pH 计测定酶反应前后反应液中 pH 值的变化，记录恢复 pH 计至设定值所滴定的酸、碱的体

　　积，换算出底物消耗量或产物生成量。

　　6 . 13 . 5 . 4 离子选择电极法

　　利用离子选择电极测定酶反应前后反应液中离子浓度变化，计算出底物消耗量或产物生成量。

　　6 . 13 . 5 . 5 旋转角度法

　　利用旋光仪测定酶反应前后反应液旋转角的变化，计算出底物消耗量或产物生成量。

　　6 . 13 . 5 . 6 黏度法

　　利用黏度计测定反应液黏度的变化，计算出高分子底物消耗量或产物生成量。

　　6 . 13 . 5 . 7 酶法

　　利用与底物或产物发生特定反应的酶，测定底物消耗量或产物生成量。 对于直接连续的酶反应，测

　　定方法可包括吸光测定法、荧光测定法、pH 控制器法、氧电极法等。对于非连续的酶反应，测定方法可

　　包括高效液相色谱法、气相色谱法、液体闪烁计数器法、滴定分析法(如酸碱滴定法、络合滴定法)等。

　　6 . 13 . 6 仪器操作条件的选择

　　操作条件的选择应考虑如下方面：

　　a) 缓冲溶液的类型、浓度和 pH 值;

　　b ) 反应温度;

　　c ) 反应时间;

　　d ) 底物类型(批次)和浓度。

　　6 . 13 . 7 操作方法

　　6 . 13 . 7 . 1 准备缓冲溶液、底物溶液和样品溶液。

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　　6. 13.7.2 开启恒温器电源，使其升温至设定的温度。酶活力测定一般在 25 ℃ ~30 ℃进行。

　　6 . 13 . 7 . 3 在反应容器中加入缓冲溶液和底物溶液后，充分搅拌使其均匀，放置在温控器预热。

　　6 . 13 . 7 . 4 加入样品溶液，立即搅拌，开始反应。 添加的酶量应尽可能少。

　　6 . 13 . 7 . 5 直接连续的酶反应，可自动记录实验进程;非连续的酶反应，需在特定时间间隔内取出特定量的反应液，终止反应。当反应停止后，进行着色、离心分离、滤网过滤、萃取、调节 pH 值等处理，以测量底物或产物的变化量。

　　6 . 13 . 7 . 6 同一样品溶液至少测定两次。

　　6 . 13 . 8 空白试验

　　空白试验根据实验情况选择如下之一进行：

　　a) 将底物液加入缓冲溶液中，然后加入反应终止液、样品溶液;

　　b) 将样品溶液加入缓冲溶液中，用适当的方法将酶灭活，然后加入底物液;

　　c) 将底物液加入缓冲溶液中，然后加入与样品溶液等量的缓冲溶液或水。

　　6 . 13 . 9 结果表示

　　6 . 13 . 9 . 1 酶活力 A，按式(1)计算：

　　A …………………………( 1 )

　　式中：

　　c — 底物减少量或产物增加量，单位为摩尔每毫升(mol/mL)或微摩尔每毫升(μmol/mL) ;

　　c0 — 空白试验底物减少量或产物增加量，单位为摩尔每毫升(mol/mL)或微摩尔每毫升(μmol/mL); d — 样品溶液稀释倍数;

　　t — 反应时间，单位为秒(s )或分(min)。

　　6 . 13 . 9 . 2 比活力 B，按式(2)计算：

　　B …………………………( 2 )

　　式中：

　　A — 酶活力，单位为开特每毫升(kat/mL)或活性单位每毫升(U/mL) ;

　　c — 样品浓度，单位为千克每毫升(kg/mL)或毫克每毫升(mg/mL)。