GB/T 33839-2017 基于生物效应含碳基纳米材料生物样品的透射电子显微镜检测方法

　　ICS 7 1 . 040 . 40 G 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33839—2017

　　基于生物效应含碳基纳米材料

　　生物样品的透射电子显微镜检测方法

　　Methodsoftransmissionelectronmicroscopeforbiologicalspecimencontaining

　　carbon-basednanomaterialsinvolvingbiologicaleffect

　　2017-05-31 发布 2018-04-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33839—20 17

　　GB/T 33839—20 17

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC 38)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国人民解放军第二军医大学、中国计量科学研究院、国家纳米科学中心。

　　本标准主要起草人：杨勇骥、汤莹、高思田、任玲玲、王孝平、葛广路。

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　　引 言

　　广泛应用的碳基纳米材料是否会对生物系统造成危害目前还不清楚。 其原因主要有三：一是对各种尺度的碳基纳米材料的生物学效应不明确，包括：是否能进入生物体、如何进入生物体、进入生物体后是否影响生物体的功能;二是对进入生物体的纳米材料的测试缺乏足够的技术及测试标准;三是纳米材料对生物体的安全性效应测试也无标准可寻，造成纳米材料对生物体安全性的不明确。 因此，制定这三方面的标准体系是纳米材料在生命科学研究中的重要基础。

　　目前用于碳基纳米材料生物效应研究的方法很多，但用电子显微镜观察细胞超微结构更加直观。因此，研究碳基纳米材料对生物组织细胞乃至生物体形态结构的影响，目前还是以电子显微镜为主，建立其相关检测标准是碳基纳米材料应用于生物医学的关键。 为了规范含碳基纳米材料生物样品的制备程序，正确指导透射电镜检测工作，有必要制定本标准。

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　　基于生物效应含碳基纳米材料

　　生物样品的透射电子显微镜检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了用透射电子显微镜(以下简称透射电镜)检测含有碳基纳米材料的生物样品超微结构的技术和规范。

　　本标准适用于含碳基纳米材料的生物薄试样透射电镜分析检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 18873—2008 生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则

　　GB/T 19619—2004 纳米材料术语

　　3 术语和定义

　　GB/T 19619—2004 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　碳基纳米材料 carbon-basednanomaterials

　　分散相尺度至少有一维小于 100 nm 的碳材料。

　　注：分散相由碳原子组成。 碳基纳米材料主要包括三种类型，即一维碳基纳米材料(包括碳纳米管和碳纳米纤维等)，二维碳基纳米材料(包括石墨烯和纳米石墨片等)以及零维碳基纳米材料(包括碳纳米颗粒和富勒烯球等)。

　　3.2

　　生物效应 biologicaleffect

　　纳米材料与生命过程的相互作用导致生物体形态结构及功能的变化。

　　3.3

　　生物薄试样 biologicalthinspecimen

　　采用超薄切片机切片、厚度为 40 nm~100 nm 的生物试样，用于透射电镜观察。

　　4 方法原理

　　碳基纳米材料的表面理化特性使其易形成团聚，经分散后与生物体接触。 碳基纳米材料与生物体接触后，需采用超微结构制样方法，制成生物薄试样。 在透射电镜下检测碳基纳米材料作用于生物体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化，以确定碳基纳米材料对生物体的生物效应。 用高能电子束照射生物薄试样的微小区域，入射的电子束大部分透过薄试样，透射电子携带有生物薄试样内部信息，成像形成生物薄试样的超微结构图像。

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　　5 仪器设备、试剂和环境条件

　　5 . 1 仪器设备

　　5 . 1 . 1 透射电镜 。

　　5 . 1 . 2 超薄切片机。

　　5 . 1 . 3 制刀机 。

　　5 . 1 . 4 玻璃刀或钻石刀。

　　5 . 1 . 5 恒温烘箱。

　　5 . 1 . 6 超声波清洗仪。

　　5 . 2 试剂

　　5 . 2 . 1 戊二醛 。

　　5 . 2 . 2 四氧化餓。

　　5 . 2 . 3 乙醇 。

　　5 . 2 . 4 丙酮 。

　　5 . 2 . 5 环氧树脂包埋剂。

　　5 . 2 . 6 醋酸双氧铀。

　　5 . 2 . 7 枸橼酸铅。

　　5 . 3 环境条件

　　超薄切片机、透射电镜的工作环境应符合以下要求：

　　a) 超薄切片机：相对湿度小于 60%,温度(20±5) ℃ , 电源电压(220±22)V。

　　b ) 透射电镜：相对湿度小于 60%, 温度(20±5) ℃, 电源电压稳定(220±22) V,具备仪器专用地线，接地电阻值参照仪器说明书的要求。

　　6 含碳基纳米材料的生物薄试样制备

　　6 . 1 碳基纳米材料的分散

　　6 . 1 . 1 将碳基纳米材料与溶剂按一定的比例充分混和。

　　6 . 1 . 2 采用超声波进行分散。

　　6. 1 .3 将不同浓度、已分散的碳基纳米材料悬液约 10 μL滴在有支持膜(Fomvar 膜或碳膜)的透射电镜专用载网上，干燥后待检。

　　6 . 2 含碳基纳米材料的生物组织

　　6 . 2 . 1 取材：将含碳基纳米材料的生物组织在 2%或 3%戊二醛固定液(4 ℃) 中迅速切成小于 1 mm3的小块。 配制戊二醛固定液可参考附录 A。

　　6 . 2 . 2 前固定：将小块组织浸泡在 20 倍体积、4 ℃ 的 2%或 3%戊二醛固定液中固定 1 h~ 4 h, 用0 . 1 mol/L磷酸缓冲液充分漂洗。

　　6 . 2 . 3 后固定：将生物小块组织浸泡在 1%四氧化餓固定液，4 ℃ 固定 2 h。 配置四氧化餓固定液可参考附录 B。

　　6 . 2 . 4 脱水：用乙醇或丙酮梯度脱水。 建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为：30%、50%、70%、90%乙醇

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　　各一次;90%丙酮 1 次，100%丙酮 3 次;每次 10 min~15 min。

　　6 . 2 . 5 包埋：在按比例配制好的 Epon812 环氧树脂包埋剂中浸透后，在胶囊(或硅胶包埋板)内进行包埋 。建议浸 透 比 例 为，丙 酮：包 埋 剂(浸 透 时 间)：1 ∶ 1 ( 1 h~ 2 h ) ; 1 ∶ 2 ( 12 h ) ;纯 包 埋 剂 ( 1 h ) 。 Epon812 环氧树脂包埋剂配制比例可参考附录 C。

　　6 . 2 . 6 聚合：在恒温烘箱内进行聚合，37 ℃聚合 12 h后，升温至 60 ℃聚合 36 h~48 h。

　　6 . 2 . 7 修块：包埋块在进行超薄切片之前，将分析部位修成易于超薄切片的形状。

　　6 . 2 . 8 超薄切片：采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片，并将切片捞至载网晾干，切片厚度一般要求在 40 nm~100 nm。

　　6 . 2 . 9 染色：采用醋酸双氧铀和枸橼酸铅对超薄切片进行重金属盐染色后待检。

　　6 . 3 含碳基纳米材料的培养细胞

　　6 . 3 . 1 前固定：用细胞刮将细胞从培养皿底部刮下或胰酶消化下来，低速离心(2 500 r/ min, 5 min)成小团块于离心管底部，弃上清液，加入 3%戊二醛，吹散细胞团块，4 ℃冰箱固定 1 h~4 h。

　　6 . 3 . 2 凝 块：用 1 mol/ L 磷 酸 缓 冲 液 漂 洗 3 次 后，加 入 小 牛 血 清，使 细 胞 悬 浮 于 血 清 中 后，离 心(4 000 r/ min, 5 min)成小团块，弃上清液，沿管壁加入 2%或 3%戊二醛固定液，放入 4 ℃冰箱固定过夜 。将细胞团块切成小于 1 mm3 的小块，用 1 mol/L磷酸缓冲液轻轻充分漂洗。

　　6 . 3 . 3 后固定：将细胞小块浸泡于 1%四氧化餓，放入 4 ℃冰箱固定 1 . 5 h~2 h。

　　6 . 3 . 4 脱水(同 6 . 2 . 4) 。

　　6 . 3 . 5 包埋(同 6 . 2 . 5) 。

　　6 . 3 . 6 聚合(同 6 . 2 . 6) 。

　　6 . 3 . 7 修块(同 6 . 2 . 7) 。

　　6 . 3 . 8 超薄切片(同 6 . 2 . 8) 。

　　6 . 3 . 9 重金属盐染色(同 6 . 2 . 9)后待检。

　　7 测量方法

　　7 . 1 测量前的准备

　　7 . 1 . 1 透射电镜准备工作

　　7 . 1 . 1 . 1 开机，抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定 30 min 以上。

　　7 . 1 . 1 . 2 选择加速电压，检测生物薄试样所需的加速电压选择在 60 kV~120 kV之间。

　　7 . 1 . 1 . 3 调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。

　　7 . 1 . 1 . 4 对电子光学系统进行对中调整，消除像散，使透射电镜处于最佳工作状态。

　　7 . 2 测量步骤

　　7 . 2 . 1 碳基纳米材料

　　7 . 2 . 1 . 1 将干燥的碳基纳米材料试样放入透射电镜。

　　7 . 2 . 1 . 2 在低倍(3 000 倍 ~4 000 倍)下寻找合适的试样部位，要求被分析试样无破损、无污染。

　　7 . 2 . 1 . 3 在高倍(40 000 倍 ~50 000 倍)时观察碳基纳米材料的分散情况和形貌，测量其尺寸并记录实验结果。

　　7 . 2 . 2 生物薄试样

　　7 . 2 . 2 . 1 在低倍(小于 4 000 倍)下寻找合适的生物薄试样部位，要求被分析试样无破损、无污染、无振

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　　颤条纹。

　　7 . 2 . 2 . 2 将确定的试样分析部位置于电子显微镜的观察中心。

　　7 . 2 . 2 . 3 逐步增加放大倍数(一般放大倍数在 10 000 倍 ~50 000 倍即可)，寻找细胞内外、细胞器内外有无碳基纳米材料。

　　7 . 2 . 2 . 4 仔细分析纳米材料分布的位置，注意区分样品制备过程中引入的污染物和碳基纳米材料。 无法判别时，建议按 GB/T 18873—2008 规定的 X射线能谱分析方法对颗粒物进行定性分析。

　　7 . 2 . 2 . 5 精确聚焦图像并存储实验结果。

　　8 检测报告

　　分析结果报告应包括以下信息：

　　a) 分析报告的唯一编号;

　　b) 送样人姓名、单位和地址;

　　c) 样品的接收日期;

　　d) 分析仪器及其工作条件;

　　e) 分析结果和必要的说明;

　　f) 分析报告负责人的签字;

　　g) 分析报告的页码;

　　h) 实验室名称和地址;

　　i) 分析报告的 日期。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　戊二醛固定液配制

　　A.1 配制 2 . 0%戊二醛固定液(磷酸缓冲液，pH7 . 3) :

　　量取 0 . 2 mol/ L 磷酸缓冲液(pH7 . 3) 50 mL,加入纯化的 25%戊二醛水溶液 8 mL,最后用双蒸水定容至 100 mL。 充分混匀。

　　A.2 配制 3 . 0%戊二醛固定液(磷酸缓冲液，pH7 . 3) :

　　量取 0 . 2 mol/L磷酸缓冲液(pH7 . 3) 50 mL,加入纯化的 25%戊二醛水溶液 12 mL,最后用双蒸水定容至 100 mL。 充分混匀。

　　注：戊二醛固定液宜现配现用。

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　四氧化餓固定液配制

　　B.1 配制 2%四氧化餓贮存液：

　　将装有四氧化餓的安瓿(共 2 g)洗净，用玻璃划割器刻痕，再用双蒸水冲洗几次，放入洁净棕色广口玻璃瓶内，加上 100 mL双蒸水，用洁净玻璃棒捣破安瓿。 然后用封口膜将广口玻璃封口，贴上标签，置于干燥器中，4 ℃保存备用。

　　B.2 配制 1%四氧化餓固定液(磷酸缓冲液，pH7 . 3) :

　　等量 0 . 2 mol/L磷酸缓冲液(pH7 . 3)与 2%四氧化餓贮存液混合，现配现用。

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　环氧树脂 Epon8 12 包埋剂配制

　　环氧树脂 Epon812 包埋剂配制比例见表 C. 1 。

　　表 C.1 环氧树脂 Epon8 12 包埋剂配制比例