GB/T 33584.6-2017 海水冷却水质要求及分析检测方法 第6部分：异养菌的测定

　　ICS 07 . 060 ; 13 . 060 Z 17

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33584 . 6—2017

　　海水冷却水质要求及分析检测方法

　　第 6 部分：异养菌的测定

　　Seawaterqualityrequirementsandanalysismethodsforseawater coolingsystem—part6：Determinationofheterotrophicbacteria

　　2017-05-12 发布 2017-12-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33584 . 6—20 17

　　前 言

　　GB/T 33584《海水冷却水质要求及分析检测方法》分为 6 个部分：

　　— 第 1 部分：钙、镁离子的测定;

　　— 第 2 部分：锌的测定;

　　— 第 3 部分：氯化物的测定;

　　— 第 4 部分：硫酸盐的测定;

　　— 第 5 部分：溶解固形物的测定;

　　— 第 6 部分：异养菌的测定。

　　本部分为 GB/T 33584 的第 6 部分。

　　本部分按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本部分由国家海洋局提出。

　　本部分由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC 283)归口 。

　　本部分起草单位：国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所、浙江国华浙能发电有限公司。

　　本部分主要起草人：李亚红、周筝、赵小芳、张益、元昊、张连涛、吴彭杰。

　　GB/T 33584 . 6—20 17

　　引 言

　　在以海水为水源的海水冷却水系统中易于滋生微生物污垢沉积等危害，因此，在系统运行过程中常需测定微生物量，用以评估系统生物污染程度，以及所采用的生物防治技术的有效性和经济性，其中最常测定的是黏液形成菌总数。 但在黏液形成菌的测定过程中，需采用成套的黏泥采集装置，样品为生物黏泥样，样品状态为含水固体，须经研磨后定量稀释测定，导致这种采样方式在实践中受到限制，且研磨、稀释黏泥样品后再进行测定，也增加了测定步骤和污染机率，使得黏液形成菌的检测很难日常化。

　　本部分测定的异养菌是一类生活于海水冷却水中的浮游细菌，其存在和数量可以直接反映海水冷却系统的生物污染程度。 本部分舍弃黏泥采集装置，直接采集水样测定异养菌数，简化了采样和制样步骤，使得异养菌的测定得以 日常化，提高了海水冷却水的运行管理水平。

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　　海水冷却水质要求及分析检测方法

　　第 6 部分：异养菌的测定

　　1 范围

　　GB/T 33584 的本部分规定了海水冷却水质要求和采用平皿计数法测定海水冷却水中异养菌的方法原理、试剂与材料、仪器与设备、分析测定、菌落计数、菌落总数的计算和报告方式。

　　本部分适用于海水冷却水中异养菌的测定，也适用于原海水中异养菌的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　异养菌 heterotrophicbacteria

　　利用有机物分子作为能源的微生物。

　　3.2

　　菌落形成单位 colony-formingunit;CFU

　　采用平皿计数法测定的菌落数量。

　　3.3

　　蔓延菌落 spreadingcolony

　　在琼脂培养基表面呈弥漫生长的菌落。

　　4 水质要求

　　海水冷却水主要水质指标应符合表 1 的规定。

　　表 1 海水冷却水主要水质要求

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　　表 1(续)

　　5 方法原理

　　待测水样经适当稀释后，倾注接种到的营养琼脂中，于有氧条件下，在 29 ℃ ± 1 ℃下培养 72 h 后 ，水样中的单个异养菌将在营养琼脂上形成肉眼可见的单菌落。 统计每个平皿的菌落数，根据其对应的稀释倍数和接种量，即可换算出待测水样中的异养菌数。

　　6 试剂与材料

　　除非另有说明，在分析中化学试剂仅使用分析纯试剂和 GB/T 6682 规定的三级水。

　　6 . 1 氯化钠。

　　6 . 2 硫酸镁。

　　6 . 3 氯化镁。

　　6 . 4 氯化钙。

　　6 . 5 氯化钾。

　　6 . 6 碳酸氢钠。

　　6 . 7 牛肉膏。

　　6 . 8 蛋白陈。

　　6 . 9 磷酸氢二钾。

　　6 . 10 琼脂 。

　　6. 1 1 氢氧化钠溶液：160 g/L。

　　6. 12 盐酸溶液：1+11。

　　6 . 13 硫代硫酸钠：将硫代硫酸钠置于称量纸上，转入无菌箱(室)或超净工作台(7 . 1) 内，并均匀地摊放在离紫外线灯的垂直距离 30 cm处灭菌 30 min备用。

　　6. 14 陈海水：取天然海水避光保存 3 个月以上，使用时取其清液或经 0 . 45 μm 滤膜过滤的滤液。

　　6. 15 人工海水：将 31.8 g NaCl、7.74 g MgSO4 、6.0 g MgCl2 、1.53 g CaCl2 、0.07 g KCl 和 2.0 g NaH- CO 3 加入到 1 L水中，混匀后备用。

　　6. 16 培养基：将 3.0 g 牛肉膏、10.0 g蛋白陈、0.05 g磷酸氢二钾和 15.0 g 琼脂加入到 500 mL 陈海水 (6 . 14)或人工海水(6 . 15)和 500 mL蒸馏水配制的混合水中，加热溶解(如用含杂质较多的琼脂配制时，应趁热用四层医用脱脂纱布过滤)，用热水补充至 1 000 mL 后，用氢氧化钠溶液(6 . 11) 或盐酸溶液 (6.12) 调节 pH 值至 7.2±0.2,并分装于三角瓶(7.9) 中，于 121 ℃ ± 1 ℃下蒸汽压力灭菌 20 min, 冷却后备用。

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　　6. 17 无菌稀释水：将陈海水(6.14)或人工海水(6.15)分装在试管(7.11)中，每管 9 mL, 于 121 ℃ ± 1 ℃下蒸汽压力灭菌 20 min,冷却后备用。

　　6 . 18 称量纸 。

　　6 . 19 牛皮纸 。

　　6 . 20 医用脱脂纱布。

　　7 仪器与设备

　　7 . 1 无菌箱(室)或超净工作台。

　　7 . 2 蒸汽压力灭菌器。

　　7 . 3 恒温培养箱。

　　7 . 4 电热干燥箱。

　　7 . 5 电热恒温水浴锅。

　　7.6 天平：称量范围 0 g ~220 g,感量 0.01 g。

　　7 . 7 冰箱 。

　　7.8 量筒：500 mL、1 000 mL。

　　7.9 刻度三角瓶：250 mL、500 mL, 配硅胶塞。

　　7. 10 烧杯：1 000 mL。

　　7. 1 1 试管：直径 18 mm,长度 180 mm, 配硅胶塞。经蒸汽压力灭菌器 121 ℃ ± 1 ℃灭菌 20 min 后， 50 ℃ ~60 ℃ 烘干冷却备用。

　　7. 12 培养皿：直径 90 mm。经蒸汽压力灭菌器 121 ℃ ± 1 ℃灭菌 20 min 后，50 ℃ ~60 ℃烘干冷却备用。

　　7. 13 刻度吸管或移液器和枪头：1 000 μL、1 mL~ 10 mL。经蒸汽压力灭菌器 121 ℃ ± 1 ℃灭菌20 min 后，50 ℃ ~60 ℃烘干冷却备用。

　　7 . 14 采样瓶：广口玻璃瓶或聚丙烯塑料瓶，1 000 mL。 洗净后经蒸汽压力灭菌器 121 ℃ ± 1 ℃灭菌20 min 后，50 ℃ ~60 ℃烘干冷却备用。

　　7. 15 pH 计或精密 pH 试纸：pH 计，(0 pH~14.00 pH) ±0.02 pH;精密 pH 试纸，6.4~8.0。

　　7 . 16 放大镜(3×)或菌落计数器。

　　8 分析测定

　　8 . 1 样品的采集

　　8 . 1 . 1 采用采样瓶(7 . 14)在海水冷却水的给水总管或回水总管处采集约 500 mL样品，在取样过程中，应避免瓶口和颈部受杂菌污染。 采样前用酒精灯灼烧管口，并放水 5 min后再采集。

　　8 . 1 . 2 若采集的水中有余氯，或不能判断水中是否有余氯，应在采样前，在无菌操作下，向采样瓶(7 . 14)中加入灭菌的硫代硫酸钠(6 . 13),硫代硫酸钠的加入量为每升水样约加入 0 . 1 g。 若确定水样不含余氯，则无需加入硫代硫酸钠。

　　8 . 1 . 3 水样采集后，应立即进行测定，如果在 2 h 内不能进行测定，应把水样放在冰箱(7 . 7) 中冷藏保存，存放时间不宜超过 24 h。 经冷藏保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，在培养箱(7 . 3) 中 29 ℃ ± 1 ℃ 下活化 4 h~5 h,再进行测定。

　　8 . 2 水样的稀释与接种

　　8 . 2 . 1 将水样摇匀，采取无菌操作方法，按 l0 倍稀释法对水样进行系列稀释，直至需要的稀释度为止。

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　　8 . 2 . 2 采取无菌操作方法，将不同稀释度的水样分别接种到无菌培养皿(7 . 12)中，每个稀释度重复接种3 皿 ~5 皿，每皿接种 1 mL,每接种一个稀释度更换一支无菌吸管或枪头(7 . 13) 。然后倾注入 15 mL~ 20 mL 已融化并冷却至 45 ℃ ± 1 ℃的灭菌培养基(6 . 16),并立即轻轻旋摇培养皿，使水样与培养基充分混匀。 测定一个水样从接种到灌入培养基不得超过 20 min。

　　8 . 2 . 3 另取一组无菌培养皿(7 . 12),采取无菌操作方法，接种 1 mL无菌稀释水(6 . 17)并倾注灭菌培养基(6 . 16)作为空白对照。

　　8 . 3 培养

　　待培养皿中的培养基固化后，倒置平皿，在培养箱(7 . 3)中于 29 ℃ ± 1 ℃培养 72 h。

　　9 菌落计数

　　9 . 1 培养结束后，取出培养皿，用肉眼观察(若菌落太小，采用放大镜或菌落计数器观察)，记录稀释倍数和相应的菌落数量。 菌落计数以 CFU表示。

　　9 . 2 计数时，根据平皿上的菌落形态，按下述情况处理：

　　a) 当无蔓延菌落生长时，对每个平皿上的菌落计数。 每个稀释度的菌落数采用一组平皿的平均数;

　　b ) 同一稀释度下，当部分平皿出现较大片状菌落生长时，应选择无片状菌落生长的平皿计算该稀释度的菌落数;

　　c) 同一稀释度下，当所有平皿均出现不同程度的片状菌落，应选取片状菌落不到平皿面积的 一半，而其余一半多的平皿中菌落分布又很均匀的平皿进行计数，即对分布均匀的半个平皿计数，计数结果乘以 2,代表一个平皿菌落数;

　　d) 同一稀释度下，当所有平皿均出现超过平皿面积一半的片状菌落时，该稀释度的平皿不应计数;

　　e) 当平皿上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

　　10 菌落总数的计算和报告方式

　　10 . 1 若空白对照培养皿出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定无效。

　　10 . 2 选择平均菌落数在 30 CFU~300 CFU之间的稀释度，进行计算。 若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表 2 例 1) 。

　　10 . 3 若有两个稀释度，其生长菌落数均在 30 CFU~300 CFU之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于 2,应报告两者平均数(见表 2 例 2);若大于 2 则报告其中稀释度较小的菌落数(见表 2 例 3);若等于 2 亦报告其中稀释度较小的菌落数(见表 2 例 4) 。

　　10 . 4 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 CFU,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表 2 例 5) 。

　　10 . 5 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30 CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表 2 例 6) 。

　　10 . 6 若所有稀释度均无菌落生长，则以“小于 1 乘以最低稀释倍数”报告(见表 2 例 7) 。

　　10 . 7 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30 CFU~300 CFU 之间，其中一部分大于 300 CFU 而另 一部分小于 30 CFU 时，则选择最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表 2例 8) 。

　　10 . 8 若所有平皿均密布菌落，则不宜用“多不可计”报告，而宜在稀释度最高的各平皿上，任意计数

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　　1 cm2 中的菌落数，求出每平方厘米内的平均菌落数，乘以皿底面积 63 . 6 cm2 ,再乘以其稀释倍数报告。

　　10 . 9 若所有平皿上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

　　10 . 10 菌落总数修约原则如下：

　　a) 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告;

　　b) 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数;也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字(见表 2 报告方式栏)。

　　表 2 计数与报告示例

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　　参 考 文 献

　　[1] J. 尼 克 林，K. 格 雷 米-库 克，R. 基 林 顿 著，林 稚 兰 译.微 生 物 学[ M] . 北 京：高 等 教 育 出 版

　　社，2004 .