GB/T 33417-2016 过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法

　　ICS 11. 080 C 50

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33417—2016

　　过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法

　　Testmethod ofbiologicalindicator forhydrogen peroxidevapour

　　sterilization processes

　　2016-12-30发布 2017-07-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33417—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 、中国人民解放军疾病预防控制所 、中国医学科学院协和医院 。

　　本标准主要起草人 :张流波 、张剑 、姚楚水 、张青 、王立飞 、张玮 、王香 、王洪敏 、史绍毅 、王妍彦 、邱侠 、马玲 、朱亭亭 。

　　过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法

　　1 范围

　　本标准规定了过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验方法 。

　　本标准适用于过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB 18281. 1 医疗保健产品灭菌 生物指示物 第 1部分 :通则

　　GB/T 24628 医疗保健产品灭菌 生物与化学指示物 测试设备

　　消毒技术规范 (2002年版) 卫生部

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　生物指示物 biologicalindicator;BI

　　对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力 ,并装在内层包装中可供使用的染菌载体 。 3.2

　　过氧化氢气体灭菌 hydrogen peroxidevapoursterilization

　　以汽化的过氧化氢作为主要杀灭微生物因子的灭菌方式 。

　　3.3

　　载体 carrier

　　试验微生物的支持物 。

　　3.4

　　存活时间 survivaltime;ST

　　测定生物指示物抗力时 ,受试样本经杀菌因子作用后 ,全部有菌生长的最长作用时间 。 3.5

　　杀灭时间 killingtime;KT

　　测定生物指示物抗力时 ,受试样本经杀菌因子作用后 ,全部无菌生长的最短作用时间 。 3.6

　　D 值 D value

　　杀灭微生物数量达到 90%所需要的时间 。

　　3.7

　　自含式生物指示物 self-contained biologicalindicator

　　含有微生物复苏生长所需培养基的生物指示物 。

　　GB/T 33417—2016

　　3. 8

　　生物指示物抗力测试仪 biologicalindicatorevaluatorresistometer

　　产生限定条件下灭菌过程中物理变化规定组合 , 以测量抗力的专用设备 。

　　4 检验指标与方法

　　4. 1 抗力

　　4. 1. 1 菌种

　　用于制作过氧化氢气体灭菌生物指示物的菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢(Geobacillusstearothermophilus ATCC7953或 SSIK31)或被证明具有本标准所要求的同等性能的微生物 。

　　4. 1.2 菌量

　　回收菌量大于或等于 1×106CFU/片 ,对于成品的指示物 ,载体回收的菌量与说明书上的菌量误差在 -50% ~ +300%之间 。测定菌量时 ,应最少测试 4个样本 ,具体检测方法参见附录 A。

　　4. 1.3 D 值

　　测试时应使用生物指示物抗力测试仪 , 生物指示物抗力测试仪要求见 GB/T 24628。 在使用浓度为 59%±2%过氧化氢 ,灭菌舱内作用浓度为 2. 3 mg/L±0. 4 mg/L,作用温度 50 ℃±0. 5 ℃的条件下 , D 值的要求为 0. 75 s~ 8 s。对于成品的生物指示物 ,测试的 D 值应在说明书上的 D 值 ±20%范围内 。应使用下列 2种方法进行测试 :

　　a) 部分阴性法测试 D 值 ,参见附录 B;

　　b) 验证法测试 D 值 ,将 a)测试出的 D 值和 4. 1. 2 的回收菌量的平均数带入式(1) 和式(2) ,计算出 ST值和 KT值 。参见附录 C。

　　式中 :

　　N0— 每批生物指示物的回收菌量的平均数 。

　　4.2 载体

　　按 GB 18281. 1 的要求进行灭菌过程兼容性的测试 。

　　4.3 恢复培养基

　　4.3. 1 恢复培养基应满足下列要求 :

　　a) 有使 10CFU~ 100CFU 的微生物恢复生长的能力 ;

　　b) 有使损伤的微生物恢复生长的能力 ,并且有中和残留的灭菌因子对微生物抑制生长的能力 ;

　　c) 经过过氧化氢气体灭菌后不会产生抑制微生物生长的物质 。

　　4.3.2 恢复培养基按以下方法检验 :

　　每个样本的恢复培养基中 ,接种 10CFU~ 100 CFU 的嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC7953) , 同时设置阴性对照和阳性对照 ,培养至规定时间后观察有无嗜热脂肪杆菌芽孢生长(一般观察培养基的颜色变化) 。如果恢复培养基有菌生长 ,并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长 ,判断恢复培养液合格 。

　　4.4 稳定性试验

　　取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下 ,存放至标签和说明书规定的有效期限 ,取出再次进行评价 ,生物指示物应符合 4. 1、4. 2 和 4. 3 的要求 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　活菌培养计数方法

　　A. 1 取含有 10 mLTPS(0. 1%胰蛋白胨的生理盐水溶液)的无菌试管 ,加入适量无菌玻璃珠 ,将计数菌片投入试管 ,用电动混合器混合 ,到菌片被完全打碎 ,制成菌悬液 。

　　A.2 将试管按需要数量分组排列于试管架上 ,每管加入 4. 5 mL TPS。各组由左向右 ,逐管标上 10- 1 、 10-2 、10-3 ……等 。

　　A.3 将菌悬液样本用电动混匀器混合 20 s,或在手掌上用力振打 80次 , 随即吸取 0. 5 mL加至 10- 1管内 。

　　A.4 将 10-1管依前法用电动混匀器混合 20 s,或在手掌上用力振打 80次 ,混匀 ,再吸取出 0. 5 mL加入 10-2管内 。如此类推 ,直至最后一管 。必要时 ,还可作某稀释度的 1 ∶ 1 或 1 ∶ 4稀释 。

　　A.5 选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为 15CFU~ 300 CFU 者为宜) , 吸取其中混合均匀的悬液 1. 0 mL加于无菌平皿内 。每一稀释度接种 2个平皿 。一般需接种 2个 ~ 3个不同稀释度 。

　　A.6 将熔化的 40 ℃ ~45 ℃嗜热脂肪杆菌芽孢恢复培养基 ,见《消毒技术规范(2002年版)》,倾注于已加入样液的平皿中 ,每平皿 15 mL~ 20 mL。

　　A.7 将平皿盖好 , 即刻轻轻摇动混匀 ,平放 。待琼脂凝固后 ,翻转平皿使底向上 ,置 56 ℃ ±2 ℃恒温培养箱内培养 。

　　A.8 培养至 72h,计数菌落数 。一般以肉眼观察 ,必要时用放大镜检查 。 以每平板菌落数在 30 CFU~ 300 CFU 的稀释度为准记录结果 。

　　A.9 根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片(染菌载体)上的平均菌落数 。

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　部分阴性法计算 D 值

　　B. 1 随机选取 120个样本 。分成 6组 ,每组 20个样本 。

　　B.2 生物指示物抗力测试仪设置如下 :

　　a) 暴露温度 :50 ℃±0. 5 ℃ ;

　　b) 暴露剂量 :2. 3 mg/L±0. 4 mg/L;

　　c) 暴露时间至少为 6个时间点 ,至少 1个时间点全部有菌生长 , 至少 2 个时间点部分有菌生长 ,至少 2个时间点全部无菌生长 。

　　B.3 对 6组样本分别暴露 。

　　B.4 暴露完成后将 6组生物指示物在 56 ℃ ±2 ℃温度下 ,按照说明书要求培养到规定时间 ,记录阴性和阳性结果 。 当最短暴露时间点全部为阳性 ,最长的 2个暴露时间全部为阴性 ,并且中间至少 2组有部分样本阳性 ,试验结果有效 ,带入式(B. 1)和式(B. 2)计算 D 值 。

　　B.5 部分阴性法(Limited Spearman-Karber法)D值的计算见式(B. 1) 、式(B. 2) :

　　UHSK =UK ri … … … … … … … … … …

　　D …………………………( B. 2 )

　　式中 :

　　UHSK — 达到无菌生长平均时间 ,单位为秒(s) ;

　　UK — 首次显示所有样本无菌生长的暴露时间 ,单位为秒(s) ;

　　d — 暴露时间的固定间隔 ,单位为秒(s) ;

　　n — 每组的样本量 ,单位为个 ;

　　ri — 每次暴露无菌样本数量 ,单位为个 ;

　　N0 — 回收菌落数 ,单位为 CFU。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　验证法测试 D 值

　　C. 1 ST值验证

　　将 50个试验样本放入过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中 ,作用浓度为 2. 3 mg/L±0. 4 mg/L,在 50 ℃±0. 5 ℃时 ,暴露时间设定为计算出的 ST值 ,暴露完成后 ,将 50个生物指示物样本取出 ,置于56 ℃ ±2 ℃培养至说明书规定时间 。若全部有菌生长 ,则计算的 ST值通过验证 ;若有样本无菌生长 ,则计算的 ST值没有通过验证 。

　　C.2 KT值验证

　　将 50个试验样本放入过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中 ,作用浓度为 2. 3 mg/L±0. 4 mg/L,在 50 ℃±0. 5 ℃时 ,暴露时间设定为计算出的 KT值 ,暴露完成后 ,将 50个生物指示物样本取出 ,置于56 ℃ ±2 ℃培养至说明书规定时间 。若全部无菌生长 ,则计算的 KT值通过验证 ;若有样本有菌生长 ,则计算的 KT值没有通过验证 。

　　C.3 判定

　　计算的 ST值和 KT值都通过验证 ,则判定测出的 D 值有效 。