GB/T 33412-2016 生物制品中羟基柠檬酸的测定 高效液相色谱法

　　ICS 71. 040.30 G 66

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33412—2016

　　生物制品中羟基柠檬酸的测定

　　高效液相色谱法

　　Determination ofhydroxycitricacid in biochemicalproducts—

　　HPLC method

　　2016-12-30发布 2017-07-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33412—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 :上海市计量测试技术研究院 。

　　本标准主要起草人 :刘刚 、李兰英 、丁敏 、闻艳丽 、徐勤 、许丽 。

　　生物制品中羟基柠檬酸的测定

　　高效液相色谱法

　　1 范围

　　本标准规定了用高效液相色谱法测定保健(功能)类生物制品中羟基柠檬酸含量的方法 。

　　本标准适用于口服液 、胶囊 、颗粒冲剂等生物制品中羟基柠檬酸的测定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 原理

　　试样中羟基柠檬酸用水提取 ,经离心后 ,上清液经 0. 45μm 微孔滤膜过滤 ,经高效液相色谱分离 ,紫外检测器检测 ,外标法定量 ,测定羟基柠檬酸的含量 。

　　4 试剂和溶液

　　除另有说明 ,本方法使用的试剂均为分析纯 ,水为 GB/T 6682规定的一级水 。

　　4. 1 甲醇 :色谱纯 。

　　4.2 磷酸 。

　　4.3 体积分数 0. 1%磷酸水溶液 :准确吸取 1 mL分析纯磷酸 ,用水稀释并定容至 1 000 mL。

　　4.4 羟基柠檬酸标准品(CAS号 :6205-14-7) :纯度 ≥98% 。

　　4. 5 羟基柠檬酸标准储备液 :准确称取 1 g(精确至 0. 001 g)经过 95℃ ±2℃干燥 2 h 的羟基柠檬酸标准品,加 适 量 水 溶 解 , 转 移 至 100 mL 容 量 瓶 中 , 用 水 定 容 , 摇 匀 。 羟 基 柠 檬 酸 标 准 储 备 液 浓 度为10. 000 mg/mL。

　　4.6 羟基柠檬酸标准溶液 :使用前 ,将 10. 000 mg/mL 的羟基柠檬酸标准储备液用水逐级稀释 ,制成浓度为 1. 000 mg/mL、0. 500 mg/mL、0. 200 mg/mL、0. 100 mg/mL、0. 010 mg/mL、0. 001 mg/mL 的羟基柠檬酸标准溶液 。

　　5 仪器与设备

　　实验室常规设备及下列各项 :

　　5. 1 高效液相色谱仪 :配紫外检测器 。

　　5.2 分析天平 :感量 0. 01 g,0. 001 g。

　　5.3 高速离心机 :10 000g。

　　5.4 滤膜 :0. 45 μm ,水相 。

　　GB/T 33412—2016

　　5.5 超声波清洗器 。

　　5.6 研钵 。

　　5.7 常用玻璃量器 ,A级 。

　　6 试样的制备

　　6. 1 固体试样

　　从研磨成粉末(胶囊取胶囊内容物)的混匀试样中称量 1. 0 g试料(精确至 0. 01 g) ,置于烧杯中 ,加水 40 mL,超声波清洗器 100W 超声 20 min,冷却至室温后转移至 50 mL容量瓶 ,并加水定容 。

　　6.2 液体试样

　　从试样中准确移取试料 1. 00 mL,加水稀释并定容至 10 mL。

　　上述上清液即为试料溶液 。

　　7 分析步骤

　　7. 1 液相色谱参考条件

　　色谱柱 :Atlantis T3C18色谱柱(150 mm×4. 6 mm ,5 μm) ,或相当者 ;

　　流动相 :0. 1%磷酸水溶液 +甲醇 ,体积比(99+1) ;

　　流量 :0. 6 mL/min;

　　柱温 :室温 ;

　　检测波长 :210 nm;

　　进样量 :10 μL。

　　7.2 绘制标准曲线

　　分别吸取羟基柠檬酸系列标准溶液 ,用 0. 45 μm 滤膜过滤 ,注入高效液相色谱仪 ,进样 10 μL,进行测定 , 以各标准溶液浓度峰面积为纵坐标 , 以标准溶液标准浓度值为横坐标 ,绘制标准曲线 ,并关联获得标准曲线公式 ,标 准 曲 线 的 相 关 系 数 应 该 不 小 于 0. 999。 羟 基 柠 檬 酸 标 准 品 色 谱 图 参 见 附 录 A 中图 A. 1。

　　7.3 样品分析

　　吸取试料溶液(6. 2) ,用 0. 45 μm 滤膜过滤 ,注入高效液相色谱仪 ,在 7. 2 相同条件下进行测定 。根据色谱峰面积 ,利用线性回归方程计算试料溶液中羟基柠檬酸的含量 。典型样品色谱图参见图 A. 2。

　　8 结果计算

　　8. 1 固体试样

　　固体试样中羟基柠檬酸的含量(质量分数)按式(1)和式(2)计算 :

　　…………………………( 1 )

　　w …………………………( 2 )

　　式中 :

　　ρ — 从标准曲线求得试料的质量浓度 ,单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　A — 试料的色谱峰面积(高) ;

　　a — 标准曲线截距 ;

　　b — 标准曲线斜率 ;

　　w — 样品中被测组分质量分数 ,单位为毫克每克(mg/g) ;

　　V — 试料溶液定容体积 ,单位为毫升(mL) ;

　　mi— 称取试料的质量 ,单位为克(g) 。

　　8.2 液体试样

　　液体试样中羟基柠檬酸的浓度按式(3)计算 :

　　…………………………( 3 )

　　式中 :

　　ρi — 试样中被测组分质量浓度 ,单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　Vi— 移取试料的体积 ,单位为毫升(mL) 。

　　9 方法特性

　　9. 1 测定范围

　　进样 10 μL, 在 相 关 系 数 大 于 或 等 于 0. 999 的 前 提 下 , 羟 基 柠 檬 酸 的 线 性 测 量 浓 度 响 应 范 围 为0. 001 mg/mL~ 1. 000 mg/mL。

　　9.2 回收率和精密度

　　参见附录 B。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　色谱图

　　羟基柠檬酸(HCA)标准品色谱图 ,见图 A. 1。

　　图 A. 1 羟基柠檬酸标准品色谱图

　　典型样品色谱图 ,见图 A. 2。

　　图 A.2 典型样品色谱图

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　回收率和精密度

　　本方法中羟基柠檬酸添加回收率和精密度 ,见表 B. 1。

　　表 B. 1 生物制品中羟基柠檬酸添加回收率及精密度(n=6)