GB/T 33249-2016 纳米技术 活细胞内金纳米棒含量测定 消光光谱法

　　ICS 71. 040.50 G 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33249—2016

　　纳米技术 活细胞内金纳米棒含量测定

　　消光光谱法

　　Nanotechnology—Quantification ofgold nanorodsin living cells—

　　Extinction spectroscopy

　　2016-12-13发布 2017-07-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33249—2016

　　GB/T 33249—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中国科学院提出 。

　　本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国医学科学院基础医学研究所 、国家纳米科学中心 。

　　本标准主要起草人 :许海燕 、吴晓春 、张卫奇 、纪英露 、温涛 。

　　引 言

　　金纳米棒是由金原子构成的棒状纳米结构 。 由于具有独特的物理化学性质 ,金纳米棒应用于生物医学检测 、生物医学成像 、肿瘤光热治疗和药物递送等方面 。 当金纳米棒应用于上述生物医学领域时 ,细胞内金纳米棒的含量是一个十分关键的指标 ,可以定量地反映其进入细胞的效率 ,对于新型纳米载体和造影剂的设计具有参考价值 。

　　本方法基于金纳米棒的消光特性 ,应用消光光谱法快速测定金纳米棒在活细胞内的含量 , 同时还可以获得金纳米棒在细胞内的聚集状态信息 。

　　纳米技术 活细胞内金纳米棒含量测定

　　消光光谱法

　　1 范围

　　本标准规定了采用紫外/可见/近红外消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的方法 。

　　本标准适用于定量测量活细胞内金纳米棒结构的含量 ,定量测量活细胞内其他棒状贵金属纳米结构的含量亦可参照本标准执行 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 24369. 1—2009 金纳米棒表征 第 1部分 :紫外/可见/近红外吸收光谱方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　消光光谱 extinction spectrum

　　待测物质浓度和消光池厚度不变时 ,消光度(或消光度的任意函数)对应波长(或波长的任意函数)的曲线 。

　　注 : 修改 GB/T 9721—2006,定义 3. 2。

　　3.2

　　表面等离激元共振 surfaceplasmon resonance;SPR

　　当入射电磁波照射到金属表面上时 ,金属中的自由电子在电场的驱动下相对于正离子的晶格以 一定的频率发生相干振荡 。

　　[GB/T 24369. 1—2009,定义 3. 2] 3.3

　　金纳米棒 gold nanorods(AuNRs)

　　由金元素构成的纳米尺度的棒状颗粒 ,其在一个维度上的尺度与其他两个维度之比均大于 1。 在尺度较小的两个维度上的尺寸应介于 1 nm~ 100 nm 之间 。

　　4 基本原理

　　金纳米棒 表 面 等 离 激 元 共 振 具 有 两 个 特 征 消 光 带 , 根 据 紫 外/可 见/近 红 外 吸 收 光 谱 方 法 (见GB/T 24369. 1—2009)得到金纳米棒的消光光谱图 ,见图 1a) ,其中横向等离激元共振峰(1) 在 480 nm~ 600 nm 之间 ,其峰面积与金纳米棒的浓度正相关 ;纵向表面等离激元共振峰(2) 位于近红外光谱区 ,其峰位由金纳米棒的轴比 、形状和外部介电环境决定 。体外活细胞的磷酸盐缓冲液(PBS) 悬液对峰 1 无

　　影响[图 1b)曲线 a] ,计算时作为背景曲线扣除后 ,就获得了细胞内金纳米棒的消光光谱 。PBS和聚集状态基本上都不影响峰 1。通过计算扣除背景后的横向表面等离激元共振峰面积得到细胞中的金纳米棒含量 。

　　a) 金纳米棒水溶胶的消光光谱 b) 人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)摄取金纳米棒前(曲线 a) 、后(曲线 b)的消光光谱

　　说明 :

　　实线 — 曲线 a;

　　虚线 — 曲线 b;

　　1 — 横向等离激元共振峰 ;

　　2 — 纵向等离激元共振峰 。

　　图 1 金纳米棒的消光光谱

　　5 仪器设备

　　具有测量消光光谱测 量 功 能 的 酶 标 仪 , 波 长 扫 描 范 围 : 400 nm ~ 999 nm。 使 用 前 对 酶 标 仪 进 行校准 。

　　6 制备

　　6. 1 金纳米棒的制备

　　金纳米棒的制备实例参见附录 A。

　　6.2 PBS缓冲液

　　称取 8 g NaCl、0. 2 g KCl、1. 44g Na2 HPO4 和 0. 24g KH2PO4,加超纯水定容至 1000mL。所用试剂均为分析纯 。

　　6.3 细胞悬液

　　与金纳米棒孵育后 ,贴壁细胞用常规胰酶消化 ,非贴壁细胞直接室温离心 ,弃上清液 。 收获的细胞加入适量 PBS缓冲液洗涤 3遍 ,用于细胞计数和后续的测定 。

　　7 测量方法

　　7. 1 细胞计数

　　利用细胞计数板计数不少于 3 次 ,取平均值 。

　　7.2 测量步骤

　　7.2. 1 在酶标仪上设定波长范围 、吸光度范围 、扫描速度等测量参数 。

　　7.2.2 向酶标板中加入与金纳米棒共同孵育后的细胞悬液 200 μL,未经金纳米棒处理的细胞悬液作为对照 。扫描后扣除对照光谱 ,得到细胞中金纳米棒的光谱 。

　　7.2.3 平行样品数不少于 3个 。

　　8 细胞内金纳米棒的计算

　　8. 1 峰面积计算方法

　　计算图 2 中阴影部分(峰 1)的面积 。参照附录 B。

　　说明 :

　　1— 横向等离激元共振峰 ;

　　2— 纵向等离激元共振峰 。

　　图 2 峰面积的计算

　　8.2 细胞中金纳米棒含量模拟标准曲线的建立

　　8.2. 1 将未经金纳米棒处理的活细胞悬液计数 ,室温离心 ,弃上清液 ,加入超纯水 ,按常规方法制备细胞裂解液 。

　　8.2.2 将呈梯度浓度的金纳米棒溶胶分散于 8. 2. 1 的细胞裂解液中 ,测试体积为 200 μL,得到消光光谱 ;扣除细胞裂解液的背景光谱 。参见 8. 1 的方法计算峰面积 ,做标准曲线 ,见图 3。

　　图 3 峰 1 面积与裂解液中金纳米棒浓度的标准曲线

　　8.3 细胞内金纳米棒含量的计算

　　根据标准曲线 ,计算出金纳米棒的含量 ,除以细胞总数 ,获得单细胞中金纳米棒的含量 。

　　9 不确定度来源

　　样品测试结果的标准不确定度来源包括但不仅限于 : 由测量平均值时重复性引起的不确定度 、浓度校准 、仪器校准 、标准曲线的不确定度分量组成 。不确定度评定参见附录 C。

　　10 测量结果

　　10. 1 活细胞内金纳米棒定量测定实例参见附录 B。

　　10.2 用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对消光光谱法进行验证参见附录 D。

　　10.3 消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式参见附录 E。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　金纳米棒制备实例

　　A. 1 金纳米棒水溶液的制备

　　A. 1. 1 概述

　　金纳米棒水溶液的制备采用种子调制的生长方法 ,分两步完成 。所用试剂纯度均为分析纯 ,所用水为超纯水 , 电阻率为 18MΩ · cm。

　　A. 1.2 金纳米晶晶种的制备

　　在 30 ℃下恒 温 水 浴 中 向 浓 度 为 0. 1 mol/L 的 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 水 溶 液 中 加 入 浓 度 为10 mmol/L的四氯金酸水溶液 。在搅拌的条件下再向上述混合溶液中加入浓度为 0. 01 mol/L的放置于冰水浴中的硼氢化钠水溶液 。其中十六烷基三甲基溴化铵水溶液 、四氯金酸水溶液和硼氢化钠水溶液混配的摩尔比为 0. 75 ∶ 0. 002 5 ∶ 0. 006。搅拌该混合溶液 2 min后静置 2 h,得到含有金纳米晶的金晶种溶胶 ,所述金晶种溶液中金元素的浓度为 0. 25 mmol/L。

　　A. 1.3 金纳米棒的制备

　　浓度为 0. 1 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中分别加入浓度为 10 mmol/L的四氯金酸水溶液和浓度为 10 mmol/L的硝酸银水溶液 ,混合均匀后加入浓度为 0. 1 mol/L的抗坏血酸水溶液 ,称之为生长溶液 。 向其中加入(A. 1. 1)中制备的浓度为 0. 25 mmol/L的金晶种溶胶 ,置入 30 ℃下恒温水浴中水浴 12 h,得到含金纳米棒的金纳米棒溶胶 。其中 , 十六烷基三甲基溴化铵水溶液 、四氯金酸水溶液 、硝酸银水 溶 液 、抗 坏 血 酸 水 溶 液 与 金 晶 种 溶 胶 混 配 的 摩 尔 比 为 5 ∶ 0. 025 ∶ 0. 005 ∶ 0. 027 5 ∶ 0. 000 015。

　　A.2 聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDAC)包覆金纳米棒的制备

　　按 A. 1制备 1 L金纳米棒溶胶 ,并在 8600×g转速下离心 7 min,去掉上清液 。加入 1 g 聚苯乙烯磺酸钠(PSS)和 0. 176g氯化钠 ,定容到 1 L,混合均匀 。将样品置于室温(20 ℃ ~ 30 ℃)下放置 1 天 ~ 2 天 , 即可获得 PSS包覆的金纳米棒 。将上述所得 PSS包覆的金纳米棒 ,在 8 600× g 下离心 10 min,去掉上清液 ,加入 5 mL质量分数为 20% PDDAC溶液和 0. 176g氯化钠 ,定容到 1 L,混合均匀 。将样品置于室温(20 ℃ ~ 30 ℃)下放置 1 天 ~ 2 天 , 即可获得 PDDAC包覆的金纳米棒 。

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　活细胞内金纳米棒定量测定实例

　　B. 1 实验样品

　　金纳米棒(AuNRs,长径比为 4. 2) , 以质量浓度为单位表示 。

　　人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231。

　　B.2 实验内容

　　消光光谱法测定活细胞内金纳米棒的含量 。

　　B.3 实验分析方法

　　用软件将光谱曲线进行平滑处理 ,然后用软件确定峰 1 的起点和终点 ,连接两点形成一条线段 ,对横向峰与此线段围成的区域进行积分 , 即获得对应的峰面积 。见图 2。

　　取 1. 6×105 MDA-MB-231细胞接种于 6孔板中 ,过夜培养 。细胞与 8 μg/mL浓度的 AuNRs孵育12 h,然后将细胞收集并重悬于 PBS 中 ,经细胞计数仪计数并调整浓度至 7. 5×105/mL。取 200 μL细胞悬液(含细胞数 1. 5×105 )加入到酶标板中 ,进行 UV-Vis-NIR 光谱扫描 。 未经 AuNRs暴露的细胞作为对照样品 。扣除对照样品的消光光谱后 , 即获得了细胞内 AuNRs 的消光光谱 。

　　B.4 测试条件

　　Bio-rad TC10全自动细胞计数仪 。

　　BioTek Synergy4 多功能酶标仪 :波长扫描范围 :400 nm~ 999nm;扫描速度 :慢 ;波长间隔 :1 nm。

　　B.5 分析结果和表达方式

　　注 : 图中阴影区域为峰面积 。

　　图 B. 1 8 μg/mL金纳米棒与细胞孵育 12h后 ,细胞内金纳米棒的消光光谱图

　　由图 B. 1 计 算 出 峰 1 面 积 为 0. 565, 由 图 3 的 标 准 曲 线 得 到 对 应 的 单 个 细 胞 内 金 纳 米 棒 含 量 为6. 75 pg。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　不确定度评定示例

　　C. 1 说明

　　测量重复性引入的不确定度和标准曲线引入的不确定度评定示例 。

　　C.2 测量重复性引入的标准不确定度 u1 的评估

　　测量重复性引入的标准不确定度 u1采用 A类方法进行评定 ,关系式见式(C. 1) :

　　u

　　式中 :

　　s(xi) — 单次测量试验标准差 ;

　　m — 给出测量结果时所作的测量次数 ;

　　n — 给出单次测量试验标准差时的测量次数 ;

　　xi — 表示第 i次测量值 ;

　　x- — 为测量的平均值 。

　　C.3 标准曲线引入的不确定度

　　线的,k—+0(2棒,,计,k。标s准2()2斜()为,,

　　r(b,k)=s(b,k)/s(b)s(k)是估计的相关系数 ,其中 s(b,k)是估计的协方差 。

　　D =n ∑ (cj - c-) 2

　　式中 :

　　j= 1,2, … ,n;

　　则 , 当测试结果为 x- 时 ,标准曲线引入的不确定度 :

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对消光光谱法进行验证

　　D. 1 实验样品

　　金纳米棒(AuNRs,轴比为 4. 2) , 以质量浓度表示 。

　　人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231。

　　D.2 实验内容

　　用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对消光光谱法测定活细胞内金纳米棒的含量进行验证 。

　　D.3 实验分析方法

　　取 1. 6×105 MDA-MB-231细胞接种于 6 孔板中 ,过夜培养 。 细胞与 1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、 8 μg/mL 和 16μg/mLAuNRs孵育 6 h,然后将细胞收集并重悬于 PBS 中 ,经细胞计数仪计数并调整浓度至 7. 5×105/mL。取 200 μL细胞悬液(含细胞数 1. 5×105 )加入到酶标板中 ,进行 UV-Vis-NIR光谱扫描 。未经 AuNRs暴露的细胞作为对照样品 。扣除对照样品的消光后 , 即获得了细胞内 AuNRs 的消光光谱 。用 8. 1 的方法计算出峰面积 ,用 8. 3 的标准曲线转换为细胞中的金纳米棒含量 。

　　另取 200 μL细胞悬液(含细胞数 1. 5×105 ) 转入聚四氟乙烯消解管中 ,加入 3 mL浓硝酸(质量分数 63%) 、6 mL浓盐酸(质量分数 37%)和 1 mL 双氧水原液(质量分数 30%) , 于微波消解仪上消解 。将所得的液体定容至 40 mL,然后用电感耦合等离子体质谱仪测定金元素含量 。

　　比较两种方法测定的细胞中金纳米棒含量 。

　　D.4 实验结果

　　消光光谱法测定的细胞内金纳米棒含量与 ICP-MS方法的测定结果趋势一致 ,见图 D. 1。

　　图 D. 1 消光光谱法测定细胞内金纳米棒含量与 ICP-MS方法比较

　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式

　　消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告

　　报告编号 :

　　1 委托者

　　名称 : 地址 :

　　联系方式 :

　　2 测试样品

　　名称 : 编号 :

　　3 测试依据 :

　　4 紫外/可见/近红外吸收光谱仪

　　制造单位 : 型号 : 编号 :

　　仪器检定/校准证书编号 : 检定/校准结果 :

　　5 样品的测试条件

　　比色皿 : 温/湿度 :

　　扫描波长范围 : 扫描间隔 : 扫描速度 : 光谱带宽 :

　　6 测试结果

　　原始谱图 :

　　标准曲线图及其方程 :

　　k: b: 峰面积 : 待测样品中金纳米棒的浓度 :

　　7 测试机构

　　测试人员 : 校验人员 : 测试日期 :

　　结构名称 : 地址 :

　　8 授权结构 : 授权证书编号 :

　　参 考 文 献

　　[1] NikoobakhtB,El-SayedMA. Chem. Mater.2003,15,1957.

　　[2] Mohamed MB,IsmailKZ,LinkS,El-SayedMA.J. Phys. Chem. B 1998,102,9370.

　　[3] BrioudeA,Jiang XC,PileniMP.J. Phys. Chem. B 2005,109,13138.

　　[4] OrendorffCJ,Murphy CJ.J. Phys. Chem. B 2006,110,3990.

　　[5] LinkS,Mohamed MB,El-SayedMA.J. Phys. Chem. B 1999,103,3073.

　　[6] Yan BH ,Yang Y,Wang YC.J. Phys. Chem. B 2003,107,9159.

　　[7] LinkS,El-SayedMA.J. Phys. Chem. B 2005,105,10531.