GB/T 31787-2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31787—2015

　　香石竹环斑病毒分子生物学检测方法

　　Moleculardetection ofCarnation ringspotvirus

　　2015-07-03发布 2015-11-27实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31787—2015

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中华人民共和国天津出入境检验检疫局 、上海市标准化研究院 、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 。

　　本标准主要起草人 :杨翠云 、于翠 、魏亚东 、杨瑞钰 、张卫东 、郭京泽 、胡培龙 、崔学慧 。

　　香石竹环斑病毒分子生物学检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了香石竹环 斑 病 毒 的 RT-PCR、IC-RT-PCR 和 实 时 荧 光 RT-PCR 等 分 子 生 物 学 检 测方法 。

　　本标准适用于植物种苗中携带的香石竹环斑病毒的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 仪器设备、用具和试剂

　　3. 1 仪器设备

　　PCR仪 、实时荧光定量 PCR 仪 、超净工作台 、电子天平(1/10 000 g) 、电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像系统 、水浴锅 、高速冷冻离心机 、-80 ℃超低温冰箱 、高压灭菌锅 、制冰机 、微波炉 、漩涡振荡器 。

　　3.2 用具

　　可调式微量移液器(2μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)及相应的无 RNase吸头 、无 RNase离心管 、PCR管和研钵等 。

　　3.3 试剂

　　RT-PCR试剂(见附录 B) ,IC-RT-PCR试剂(见附录 C) 。

　　4 症状观察及抽样

　　4. 1 症状观察

　　现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状 ,CRSV为害症状描述参见附录 A。

　　4.2 抽样

　　发现有病毒为害症状的植物材料直接送检 ;未发现症状的 ,则按 SN/T 2122 中规定进行抽样 ,并送实验室进行病毒检测鉴定 。

　　5 病毒检测

　　5. 1 RT-PCR方法

　　将送检植物样品中有疑似病毒为害症状的植物组织液氮研细 ,取 0. 1 g用于提取植物总 RNA,然后

　　GB/T 31787—2015

　　反转录获得 cDNA,再进行 PCR反应 。具体操作步骤见附录 B。

　　5.2 免疫捕获 RT-PCR方法(IC-RT-PCR)

　　将送检样品中 有 疑 似 病 毒 为 害 症 状 的 植 物 组 织 放 入 研 钵 内 研 磨 , 并 按 重 量 和 病 毒 抽 提 缓 冲 液1 ∶ 10的比例稀释 ,制备的汁液分别盛装于离心管中 ,离心后吸取上清液作为待测样品 。

　　用香石竹环斑病毒抗血清包被 PCR管 ,洗涤后在 PCR 管中加入制备的待测样品,进行免疫捕获 ,然后反转录获得 cDNA,再进行 PCR反应 。具体操作步骤见附录 C。

　　5.3 实时荧光 RT-PCR方法

　　采用 5. 1 或者 5. 2方法获得 cDNA,进行实时荧光 PCR反应 。具体操作步骤见附录 D。

　　6 防污染措施

　　香石竹环斑病毒分子生物学检测过程的防污染措施应符合 SN/T 1193 的规定 。 制样用的研钵经过洗涤液清洗后 ,160 ℃干热处理 2 h。

　　7 结果判定

　　样品经 RT-PCR、IC-RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR三种方法之一检测为阴性时 ,证明样品不携带香石竹环斑病毒 。

　　样品经 RT-PCR或 IC-RT-PCR检测为阳性 ,需要进行序列测定 ,如果序列测定结果证实与所检测的香石竹环斑病毒一致 ,可判定样品携带香石竹环斑病毒 。

　　样品经实时荧光 RT-PCR检测为阳性时 ,也可判定样品携带香石竹环斑病毒 。

　　8 样品保存和结果记录

　　8. 1 样品保存

　　经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品,应妥善保存在 -80 ℃冰箱中 。并做好登记和标记工作 。保存期满后 ,需经灭活处理 。

　　8.2 结果记录

　　记录包括 :样品来源 、种类 、取样人员 、实验的时间 、地点 、方法和结果 、检验检疫员的签字等 。 RT- PCR 和 IC-RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析结果 , 实时荧光 RT-PCR 应有荧光曲线图与 Ct值 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　香石竹环斑病毒背景资料

　　A. 1 背景资料

　　A. 1. 1 香石竹环斑病毒基本信息

　　中文名 :香石竹环斑病毒 。

　　学 名 :Carnationringspotvirus。

　　缩 写 :CRSV。

　　分类地位 :番茄丛矮病毒科(Tombusviridae) ,香石竹环斑病毒属(Dianthovirus) 。

　　传播途径 :该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播 , 近距离主要是由于植物间的接触 、土壤污染和农事操作等引起病毒传播 。 尚未见种传报道 。

　　A. 1.2 方法原理

　　用特异性抗体吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒 RNA,或直接从待测样品材料中提取植物总 RNA,然后在逆转录酶的作用下合成 cDNA, 以 cDNA 为模板再通过普通 PCR或实时荧光 PCR进行检测 。分析 PCR结果即可明确材料中是否含有香石竹环斑病毒的核酸成分 。

　　A.2 寄主范围

　　香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广 ,在自然条件下 ,CRSV 主要侵染香石竹 ,还可侵染李树 、梨树 、苹果 、葡萄 、酸樱桃和甜樱桃等多种果树及果园里的杂草 ,如 :繁缕 。

　　在实验条件下 ,CRSV可侵染 25科共 133种植物 , 可系统侵染茄科 、豆科和葫芦科的植物 ,非系统侵染的寄主范围更广 。

　　A.3 为害症状

　　CRSV侵染香石竹引起叶片环斑、斑驳 ,导致叶和花的扭曲及畸变 ,严重可致叶尖坏死 。 当 CRSV与香石竹斑驳病毒(Carnationmotlevirus)共同侵染时 ,症状加重 。CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现 。

　　CRSV接种如下几种鉴别寄主可产生相应的症状 ,可用来作为该病毒的鉴定方法之一 。

　　苋色藜(Chenopodium amaranticolor)和昆诺藜(C.quinoa) :接种叶出现局部褪绿或坏死斑 ,通常无系统症状 。

　　三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN) :接种叶出现退绿环斑 、枯斑及坏死斑 ,后期病斑连成一片 。

　　豇豆(Vignaunguiculata ssp.Sinensis) :接种叶产生局部坏死斑 , 接着系统感染叶产生斑驳 、坏死斑 、叶片卷曲或脉缩 。

　　美国石竹(Diathusbarbatus) :接种叶产生环状病斑 ,接着为系统褪绿及坏死斑 。

　　千日红(Gomphrena globosa) :接种叶产生局部坏死环斑 ,接着系统感染叶产生病斑 、斑驳和畸形 。

　　菜豆(Phaseolusvulgaris) :接种叶产生局部坏死斑 ,接着叶变白 、坏死 ,产生不规则系统斑 ,坏死叶

　　脉斑 ,最后无症带毒 。

　　番杏(Tetragonia expansa) :接种后叶片产生局部白斑 ,有时也产生系统坏死斑 。

　　A.4 分布

　　欧洲 :丹麦 、芬兰 、法国 、德国 、意大利 、立陶宛 、荷兰 、波兰和英国 。

　　美洲 : 巴西 、加拿大 、哥伦比亚 、墨西哥和美国 。

　　大洋洲 :澳大利亚和新西兰 。

　　A.5 病毒粒体形态

　　粒子粒。体为直径 34 nm 的正二十面体(T= 3) , 由 180个分子质量为 37900 u 的蛋白亚基组成病毒

　　A.6 基因组

　　基因组由 RNA-1和 RNA-2两条单链 RNA 分子组成 , 分别为 3. 8 kb和 1. 4 kb。 RNA-1在 缺 少RNA-2时可单独在植物原生质体中进行复制 ,但侵染植物需 RNA-1和 RNA-2的共同作用 。

　　附 录 B (规范性附录) RT-PCR方法

　　B. 1 试剂

　　B. 1. 1 RNA提取试剂

　　Trizol裂解液 、三氯甲烷 、异丙醇 、75%乙醇 。

　　B. 1.2 反转录试剂

　　AMV反转录酶(5U/μL) 、5×AMV酶缓冲液 、dNTP(10 mmol/L) 、RNA酶抑制剂(40U/μL) 。

　　B. 1.3 PCR试剂

　　10×PCR缓冲液 、氯化镁(25 mmol/L) 、dNTP(10 mmol/L) 、Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 。

　　B. 1.4 50× TAE

　　B.2 实验步骤

　　B.2. 1 引物序列

　　上游引物 :CRSV-F: 5’-CCGATGTGCCCAAGTATGT-3’;

　　下游引物 :CRSV-R: 5’-GGCTATGACGCCGTGAAT-3’;

　　扩增片段长度 406bp。

　　B.2.2 RNA提取

　　取适量待测样品液氮研细 ,然后取 0. 1 g磨碎的样品放入 1. 5 mL离心管中 ,加入 1 mL Trizol,混匀 ;加入 0. 2 mL三氯甲烷 ,猛烈振荡 15 s,4 ℃ 11 000 r/min离心 10 min,小心吸取上层无色水相到新离心管中 ;加入等体积异丙醇 ,混匀 , -20 ℃静置 10 min,4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min,保留沉淀 ;加入 1 mL 75%冷乙醇 ,悬浮沉淀 ,4 ℃ 8000 r/min离心 10min,干燥沉淀 ;加入 30μL DEPC-H2 O,溶解沉淀(必要时 ,55 ℃ ~ 60 ℃水浴 10 min,加速溶解) ,存于 -80℃备用 。

　　或者按照植物总 RNA提取试剂盒说明书进行操作 。

　　B.2.3 反转录

　　反应体系及反应条件见表 B. 1,试剂加样量可根据具体情况进行适当调整 。也可采用 RT-PCR 一步法试剂盒 ,操作步骤按使用说明进行 。

　　表 B. 1 反转录反应体系与反应条件

　　B.2.4 核酸扩增

　　PCR反应体系见表 B. 2,每个样品设 2个平行处理 。 反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 。检测时以含香石竹环斑病毒材料的 cDNA 或含有香石竹环斑病毒材料目标片断的质粒作为阳性对照 , 以健康植物材料(尽量与所检测样品一致)cDNA作为阴性对照 , 以水代替模板作为空白对照 。

　　PCR反应条件设置如下 :94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,30个循环 ; 72 ℃ 10 min延伸 。

　　表 B.2 PCR反应体系

　　B.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测

　　用 1×TAE配制 1. 5%琼脂糖凝胶 ,加热溶化后冷却至 55 ℃左右 ;将溴化乙锭(EB) 加入到配制好的凝胶中 ,EB终浓度为 0. 5 μg/mL。将凝胶倒入凝胶槽中 ,插上样品梳子 。冷却凝固后拔掉梳子 ,在电泳槽内加入 1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约 1 mm;将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔 ,并加入

　　分子质量标准物(Marker) ;接通电源 , 以 3 V/cm~ 5 V/cm 电场强度进行电泳 ,0. 5 h后观察结果 ;将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察 ,记录结果 。

　　B.2.6 结果判定

　　通过观察 , 阳性对照出现 406bp条带 , 阴性和空白对照不会出现相应条带 ,此时如果检测样品呈现相应条带应被判为阳性 ,否则应被判为阴性 。

　　如果是阳性可通过测序的方式进一步确认 。如果 PCR产物序列与香石竹环斑病毒的序列同源 ,则可判定样品为香石竹环斑病毒阳性 ,若序列不同源 ,则可判定样品为香石竹环斑病毒阴性 。

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　免疫捕获 RT-PCR方法(IC-RT-PCR方法)

　　C. 1 试剂

　　C. 1. 1 CRSV抗体

　　C. 1.2 反转录试剂

　　AMV反转录酶(5U/μL) 、5×AMV酶缓冲液 、dNTP(10 mmol/L) 、RNA酶抑制剂(40U/μL) 。

　　C. 1.3 包被缓冲液(pH 9. 6)

　　碳酸钠(Na2CO3 ) 1. 59 g

　　碳酸氢钠(NaHCO3 ) 2. 93 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　溶于蒸馏水中 ,并用蒸馏水定容至 1 L。

　　C. 1.4 PBST缓冲液(pH 7. 4)

　　氯化钠(NaCl) 8. 0 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 ) 0. 2 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 · 12H2 O) 1. 15 g

　　氯化钾(KCl) 0. 2 g

　　叠氮钠(NaN3 ) 0. 2 g

　　吐温 20(Tween-20) 0. 5 mL

　　溶于蒸馏水中 ,并用蒸馏水定容至 1 L。

　　C. 1.5 样品抽提缓冲液(pH 7. 4)

　　亚硫酸钠(Na2SO3 ) 1. 3 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) 20 g

　　溶于 PBST 中 ,并用 PBST定容至 1 L。

　　C.2 实验步骤

　　C.2. 1 引物序列

　　见 B. 2. 1。

　　C.2.2 抗体吸附

　　将 CRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释 , 吸取 200 μL包被 PCR 管 , 37 ℃ ,孵育 2 h;用 PBST 洗3 次 ,取样品 50 mg,加入样品抽提缓冲液进行研磨 , 吸取 100μL包被 PCR管 ,4 ℃过夜(或 37 ℃ ,孵育2 h) ;PBST洗 3 次 ,DEPC-H2 O 洗 1 次 ,短暂离心后吸去管底余液 。

　　C.2.3 反转录

　　直接在吸附了 病 毒 的 PCR 管 中 进 行 反 转 录 。 反 转 录 体 系 总 体 积 20 μL, 其 中 1 μL反 向 引 物(20 μmol/L) ,4 μL5×AMV酶 buffer,2 μLdNTP(10 mmol/L) ,10μLDEPC-H2 O,稍离心混匀后 ,置85 ℃变性 5 min,迅速置冰上 2 min~ 3 min,然后加入 2 μLAMV反转录酶(5U/μL) ,1 μL RNA酶抑制剂(40U/μL) ,42 ℃反应 1 h。

　　C.2.4 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测

　　操作方法见 B. 2. 4 和 B. 2. 5。

　　C.3 结果判断

　　通过观察 , 阳性对照出现 406bp条带 , 阴性和空白对照不会出现相应条带 ,此时如果检测样品呈现相应条带应被判为阳性 ,否则应被判为阴性 。

　　如果是阳性可通过测序的方式进一步确认 。如果 PCR产物序列与香石竹环斑病毒的序列同源 ,则可判定样品为香石竹环斑病毒阳性 ,若序列不同源 ,则可判定样品为香石竹环斑病毒阴性 。

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　实时荧光 RT-PCR方法

　　D. 1 实验步骤

　　D. 1. 1 引物和探针序列

　　引物序列 :上游引物 :CRSV-F-163:5’-TTACCTGGCGCGCACTATT-3’;

　　下游引物 :CRSV-R-163:5’-GCTCTTGAGTATGAGAGCAAG-3’;

　　探针序列 :FAM-5’CAGCAACCAGAACCG 3’-TAQMAN-MGB。

　　D. 1.2 cDNA合成

　　可通过对样品进行 RNA提取 ,再反转录获得 cDNA,操作方法见 B. 2. 2 和 B. 2. 3;也可以通过抗体吸附样品中的病毒粒子 ,直接反转录获得 cDNA,操作方法见 C. 2. 2 和 C. 2. 3。

　　D. 1.3 实时荧光 PCR反应体系

　　实时荧光 PCR反应体系见表 D. 1,每个样品设 2 个平行处理 。并设阳性对照 、阴性对照和空白对照 , 以含有香石竹环斑病毒的 cDNA 为阳性对 照 ; 以 健 康 植 物 材 料 的 cDNA 作 为 阴 性 对 照 ; 以 水 代 替DNA模板作为空白对照 。每种对照各做 2个平行管 。

　　表 D. 1 实时荧光 PCR反应体系

　　D. 1.4 实时荧光 PCR反应参数

　　反应条件 :预变性 94 ℃ 10min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,共 40个循环 。本反应条件适用于 ABI7500型荧光 PCR仪 ,如使用其他荧光 PCR 仪 , 可根据仪器性能进行适当调整 。操作方法按照仪器的使用说明进行 ,反应结束后保存各项数据和图像 。

　　D.2 结果判定

　　D.2. 1 阈值设定

　　阈值设定根据仪器噪音情况进行调整 ,或以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点 ,结果显示阴性为准 。

　　D.2.2 质控标准

　　阳性对照的 Ct值应 <30. 0,并出现典型的扩增曲线 。否则 ,此次实验结果无效 。 阴性对照和空白对照无 Ct值 。

　　D.2.3 结果判定

　　在阳性样品和阴性样品 Ct值正确的情况下 ,进行以下判定 :

　　— 待测样品的 Ct值为 40或无 Ct值时 ,则判定结果阴性 ;

　　— 待测样品的 Ct值小于或等于 35时 ,则判定结果阳性 ;

　　— 待测样品的 Ct值小于 40而大于 35时 ,应重新进行测试 ,如果重新测试的 Ct值为 40时 ,则判定结果阴性 。如果重新测试的 Ct值小于 40而大于 35时 ,则判定结果阳性 。