GB/T 13091-2018 饲料中沙门氏菌的测定

　　ICS 65 . 120 B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 13091—2018

　　代替 GB/T 13091—2002

　　饲料中沙门氏菌的测定

　　Determinationofsalmonellainfeeds

　　2018-09-17 发布 2019-04-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 13091—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准代替 GB/T 13091—2002《饲料中沙门氏菌的检测方法》。

　　本标准与 GB/T 13091—2002 相比，除编辑性修改外，主要变化如下：

　　— 删除了术语和定义(见 2002 年版的第 3 章);

　　— 删除了原理(见 2002 年版的第 4 章);

　　— 增加了试验程序图(见附录 A 图 A. 1) ;

　　— 修改了增菌器具，并增加了均质袋及均质器选项(见 6 . 1 , 2002 年版的 9 . 1 . 2) ;

　　— 将分离培养基由“酚红煌绿琼脂和 DHL琼脂”改为“BS琼脂，DHL琼脂或沙门氏菌显色培养基”(见 6 . 3 , 2002 年版的 9 . 4) ;

　　— 修改了鉴定流程和鉴定表(见 6 . 4 , 2002 年版的 9 . 5) ;

　　— 增加了“利用三糖铁试验和赖氨酸脱羧酶试验进行初步判断”步骤(见 6 . 4 . 1) ;

　　— 增加了“生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统”进行沙门氏菌鉴定选项(见 6 . 4 . 3) 。

　　本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]。

　　本标准主要起草人：饶正华、刘晓露、樊霞。

　　本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

　　—GB/T 13091—1991、GB/T 13091—2002 。

　　GB/T 13091—2018

　　饲料中沙门氏菌的测定

　　1 范围

　　本标准规定了饲料中沙门氏菌的检验方法。

　　本标准适用于饲料和饲料添加剂中沙门氏菌的检验。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 培养基或材料

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。

　　3 . 1 水：应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。

　　3 . 2 缓冲蛋白陈水(BPW) ：见附录 B 中 B. 1 。

　　3 . 3 氯化镁孔雀绿(RV)增菌液：见附录 B 中 B. 2 。

　　3 . 4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：见附录 B 中 B. 3 。

　　3 . 5 亚硫酸铋(BS)琼脂：见附录 B 中 B. 4 。

　　3 . 6 胆硫乳(DHL)琼脂：见附录 B 中 B. 5 。

　　3 . 7 沙门氏菌属显色培养基。

　　3 . 8 营养琼脂(NA) ：见附录 B 中 B. 6 。

　　3 . 9 三糖铁琼脂(TSI) ：见附录 B 中 B. 7 。

　　3 . 10 蛋白陈水、靛基质试剂：见附录 B 中 B. 8 。

　　3. 1 1 尿素琼脂(pH 7.2)：见附录 B 中 B.9。

　　3 . 12 氰化钾(KCN)培养基：见附录 B 中 B. 10 。

　　3 . 13 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 B 中 B. 11 。

　　3 . 14 糖发酵管：见附录 B 中 B. 12 。

　　3. 15 邻硝基酚 β-D半乳糖苷(ONPG)培养基：见附录 B 中 B. 13 。

　　3 . 16 半固体琼脂：见附录 B 中 B. 14 。

　　3 . 17 丙二酸钠培养基：见附录 B 中 B. 15 。

　　3 . 18 沙门氏菌因子 O 和 H 多价诊断血清，Vi 因子诊断血清。

　　4 仪器设备

　　4. 1 冰箱：2 ℃ ~5 ℃。

　　4.2 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃ , 42 ℃ ± 1 ℃。

　　4 . 3 均质器。

　　4 . 4 振荡器。

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　　4 . 5 电子天平：感量 0 . 1 g。

　　4 . 6 无菌锥形瓶：容量 500 mL、250 mL,或无菌均质袋。

　　4 . 7 无菌吸管：1 mL(具 0 . 01 mL刻度)、10 mL(具 0 . 1 mL刻度)或微量移液器及吸头。

　　4.8 无菌培养皿：直径 60 mm, 90 mm。

　　4.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。

　　4 . 10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。

　　4 . 1 1 全自动微生物生化鉴定系统。

　　5 样品

　　5 . 1 采样原则

　　样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。 采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。

　　5 . 2 采样方法

　　5 . 2 . 1 应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于500 g(mL)。

　　5 . 2 . 2 独立包装不大于 500 g 的固态产品或不大于 500 mL 的液态产品，取完整包装。

　　5 . 2 . 3 独立包装大于 500 mL 的液态产品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均匀后采集适量样品，放入无菌采样容器内作为一件样品。

　　5 . 2 . 4 独立包装大于 500 g 的固态产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件样品。

　　5 . 3 采集样品的贮存和运输

　　5 . 3 . 1 应尽快将样品送往实验室检验。

　　5 . 3 . 2 应在运输过程中保持样品完整。

　　5 . 3 . 3 应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。

　　6 试验方法(试验程序图见附录 A)

　　6 . 1 前增菌

　　无菌条件下称取 25 g(mL)样品，加入装有 225 mL灭菌 BPW 的 500 mL无菌锥形瓶内，置于振荡器中，以 8 000 r/min~10 000 r/min振荡 2 min~3 min;若样品为液态，振荡混匀即可。36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h±2 h。

　　注：可用无菌均质袋代替锥形瓶，然后用均质器拍打 2 min~ 3 min,但有坚硬或棱角的样品不能够使用均质袋，只能使用锥形瓶，以防均质和增菌过程中均质袋破裂泄漏，造成污染。

　　6 . 2 选择性增菌

　　前增菌培养物摇匀后，取 1 mL接种于装有 10 mL RV 的试管中，于 42 ℃ ± 1 ℃培养 18 h~24 h。另取前增菌培养物 1 mL,接种于装有 10 mL SC 的试管中，36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h~24 h。

　　6 . 3 分离培养

　　用接种环取 1 环选择性增菌液，划线接种于 BS琼脂平板上，于 36 ℃ ± 1 ℃培养 40 h~48 h。 另取

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　　1 环选择性增菌液，划线接种于 DHL琼脂平板或沙门氏菌显色培养基平板上，36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h~ 24 h,观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌在各个平板上的菌落特征见表 1 。

　　表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

　　6 . 4 生化试验

　　6 . 4 . 1 从选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺;接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃ ± 1 ℃培养18 h~24 h,必要时可延长至 48 h。 三糖铁琼脂培养基特征变化见表 2 。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 3 。

　　表 2 三糖铁培养基特征变化表

　　表 3 沙门氏菌属在三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

　　6 . 4 . 2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH 7 . 2)、氰化钾(KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种 。 于 36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h ~24 h,必要时可延长至 48 h。 将已挑菌落的平板储存于 2 ℃ ~5 ℃或室

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　　温至少保留 24 h, 以备必要时复查。

　　表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

　　根据表 4 对结果进行判定，具体如下：

　　a) 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。 如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异

　　常，按表 5 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。

　　表 5 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

　　b ) 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体的两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

　　c) 反应序号 A3：补做 ONPG试验。 ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

　　d) 必要时按表 6 进行沙门氏菌生化群的鉴别。

　　表 6 沙门氏菌属各生化群的鉴别

　　6 . 4 . 3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 6 . 4 . 1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

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　　6 . 5 血清学鉴定

　　6 . 5 . 1 检查培养物有无自凝性

　　采用 1 . 2%~1 . 5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 首先排除自凝集反应，在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水内，使成为均一性的混浊悬液，将玻片轻轻摇动 30 s~60 s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察)，若出现可见的菌体凝集，即认为有 自凝性，反之无自凝性。 对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。

　　6.5.2 o抗原的鉴定

　　在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体 O 血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。 再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。 将玻片倾斜摇动混合 1 min,并对着暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的( 2% ~ 3%)细菌培养基上再检查;如果因 Vi抗原的存在而阻止了 O 凝集反应，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

　　6 . 5 . 3 H 抗原的鉴定

　　操作同 6 . 5 . 2 。 H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0 . 55%~0 . 65%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有 0 . 3%~0 . 4%半固体琼脂的小玻管 1 次 ~ 2 次，自远端取菌培养后再检查。

　　6.5.4 vi抗原的鉴定

　　操作同 6 . 5 . 2 。用 Vi 因子血清检查。

　　7 结果表示

　　综合以上生化试验和血清学试验的结果，得出 25 g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　试验程序图

　　沙门氏菌试验程序见图 A. 1 。

　　图 A.1 试验程序图

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　培养基和试剂的制备及试验方法

　　B.1 缓冲蛋白陈水(BPW)

　　B.1 . 1 成分

　　蛋白陈 10 . 0 g

　　氯化钠 5 . 0 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ·12H2 O) 9.0 g

　　磷酸二氢钾(KH2 PO4) 1.5 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B.1 . 2 制备

　　将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min,煮沸溶解，调节 pH 至 7 . 2 ± 0 . 2 , 121 ℃高压灭菌 20 min, 临用时分装在 500 mL 瓶中，每瓶 225 mL, 或配好后校正 pH, 分装于 500 mL 瓶中，每瓶225 mL, 121 ℃高压灭菌，20 min后备用。

　　B.2 氯化镁孔雀绿(RV)增菌液

　　B.2 . 1 溶液 A

　　B.2 . 1 . 1 成分

　　B.2 . 1 . 2 制备

　　将各成分加入蒸馏水中，加热至约 70 ℃溶解，调节 pH 至 7 . 0 此溶液需当天使用。

　　B.2 . 2 溶液 B

　　B.2 . 2 . 1 成分

　　氯化镁(MgCl2 ·6H2 O) 400 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B.2 . 2 . 2 制备

　　将 MgCl2 ·6H2 O 溶于水中。

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　　B.2.3 溶液 C

　　B.2 . 3 . 1 成分

　　孔雀绿 0 . 4 g

　　蒸馏水 100 mL

　　B.2 . 3 . 2 制备

　　将孔雀绿溶于水中。 溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中。

　　B.2 . 4 完全培养基

　　B.2 . 4 . 2 制备

　　按上述比例配制，调节 pH,使灭菌后 pH 为 5 . 2,分装于试管中，每管 10 mL。 115 ℃高压灭菌 15 min。冰箱保存。

　　B.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液

　　B.3 . 1 基础液

　　B.3 . 1 . 1 成分

　　胰蛋白陈 5 . 0 g

　　乳糖 4 . 0 g

　　磷酸氢二纳(Na2 HPO4 ·12H2 O) 10.0 g

　　亚硒酸氢钠 4 . 0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B.3 . 1 . 2 制备

　　溶解前三种成分于水中，煮沸 5 min,冷却后，以无菌操作加入亚硒酸氢钠。

　　B.3 . 2 L-胱氨酸溶液

　　B.3 . 2 . 1 成分

　　B.3 . 2 . 2 制备

　　在灭菌条件下，用灭菌水将上述成分稀释到 100 mL,无须蒸汽灭菌。

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　　B.3 . 3 完全培养基制备

　　基础液 1 000 mL

　　L-胱氨酸溶液 10.0 mL

　　基础液冷却后，以无菌操作加入 L-胱氨酸溶液，调节 pH 至 7 . 0±0 . 2 后将培养基分装于适当容量的试管中，每管 10 mL。

　　注：培养基在配制当 日使用。

　　B.4 亚硫酸铋(BS)琼脂

　　B.4 . 1 成分

　　B.4 . 2 制备

　　将前三种成分加入 300 mL 蒸馏水(制作基础液)，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和30 mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另 一 20 mL 和 30 mL蒸馏水中，琼脂加入 600 mL蒸馏水中。 然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。 冷至 80 ℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混合均匀，将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。 调节 pH 至 7 . 5±0 . 2, 随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至 50 ℃ ~55 ℃ 。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。

　　注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 48 h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。

　　B.5 胆硫乳(DHL)琼脂

　　B.5 . 1 成分

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　　中性红 0 . 03 g

　　琼脂 18.0 g~20.0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B.5 . 2 制备

　　将除中性红和琼脂以外的成分溶解于 400 mL蒸馏水中，调节 pH 至 7 . 3±0 . 2,再将琼脂于 600 mL蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，加入 0 . 5%中性红溶液 6 mL,待冷却至 50 ℃ ~55 ℃,倾注平皿。

　　B.6 营养琼脂(NA)

　　B.6 . 1 成分

　　B.6 . 2 制备

　　将上述各成分煮沸溶解，调节 pH 至 7 . 2~7 . 4 , 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　B.6 . 3 平皿制备

　　将制备的营养琼脂在水浴锅里溶解，冷却至 50 ℃ ~55 ℃时，倾注入灭菌平皿中，每皿约 15 mL。

　　B.7 三糖铁琼脂(TSI)

　　B.7 . 1 成分

　　B.7 . 2 制备

　　将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节 pH 至 7 . 4±0 . 1,加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂，再加入酚红，摇匀，分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层，121 ℃高压灭菌 20 min,放置高层斜面备用。

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　　B.8 蛋白陈水、靛基质试剂

　　B.8 . 1 蛋白陈水

　　B.8 . 1 . 1 成分

　　蛋白陈(或胰蛋白陈) 20 . 0 g

　　氯化钠 5 . 0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　B.8 . 1 . 2 制备

　　将上述成分加入蒸馏水，煮沸溶解，调节 pH 至 7 . 4±0 . 2,分装小试管，121 ℃高压灭菌 15 min。

　　B.8 . 2 靛基质试剂

　　B.8 . 2 . 1 柯凡克试剂：将 5 g对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。

　　B.8 . 2 . 2 欧-波试剂：将 1 g对二甲氨基甲醛溶解于 95 mL 95%乙醇内。 然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。

　　B.8 . 3 试验方法

　　挑取小量培养物接种，在 36 ℃ ± 1 ℃培养 1 d~2 d,必要时可培养 4 d~5 d。 加入柯凡克试剂约0 . 5 mL,轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约 0 . 5 mL,沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

　　B.9 尿素琼脂(PH 7.2)

　　B.9 . 1 基础液

　　B.9 . 1 . 1 成分

　　B.9 . 1 . 2 制备

　　将上述成分溶于水中，煮沸 ，调节 pH 至 7 . 2±0 . 2 , 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　B.9 . 2 尿素溶液

　　B.9 . 2 . 1 成分

　　尿素 400 g

　　蒸馏水 加至 1 000 mL

　　GB/T 13091—2018

　　B.9 . 2 . 2 制备

　　将尿素溶于水中，通过滤器除菌，并应检查灭菌情况。

　　B.9 . 3 完全培养基制备

　　基础液 950 mL

　　尿素溶液 50 mL

　　在无菌条件下，将尿素溶液加到事先溶化并冷却至 45 ℃基础液中，分装试管，放置成斜面备用。

　　B.9 . 4 试验方法

　　挑取琼脂培养物接种，在 36 ℃ ± 1 ℃培养 24 h,观察结果。 尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

　　B.10 氰化钾(KCN)培养基

　　B.10 . 1 成分

　　B.10 . 2 制备

　　将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后 121 ℃高压灭菌 15 min。 放在冰箱内使其充分冷却。 每 100 mL培养基加入 0 . 5%氰化钾溶液 2 . 0 mL(最后浓度为 1 ∶ 10 000),分装于无菌试管内，每管约 4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧，放在 4 ℃冰箱内，至少可保存 2 个月。 同时，将不加氰化钾的培养基作为培养基，分装试管备用。

　　B.10 . 3 试验方法

　　将琼脂培养物接种于蛋白陈水内成为稀释菌液，挑取 1 环接种于氰化钾(KCN) 培养基。 并另挑取1 环接种于对照培养基。 在 36 ℃ ± 1 ℃培养 1 d~2 d,观察结果。 如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2 d 细菌不生长为阴性(抑制)。

　　注：氰化钾是剧毒物，切勿沾染，以免中毒。 夏天分装培养基应在冰箱内进行。 试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。 试验时对每一环节都要特别注意。

　　B.1 1 赖氨酸脱羧酶试验培养基

　　B.1 1 . 1 成分

　　蛋白陈 5 . 0 g

　　酵母浸膏 3 . 0 g

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　　葡萄糖 1 . 0 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　1 . 6%溴甲酚紫-乙醇溶液 1 . 0 mL

　　L-赖氨酸或 DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL或 1.0 g/100 mL

　　B.1 1 . 2 制备

　　将除赖氨酸以外的成分加热溶解后，每瓶 100 mL分装，分别加入赖氨酸。 L-赖氨酸按 0 . 5%加入， DL-赖氨酸按 1%加入。 调节 pH 至 6 . 8±0 . 2,对照培养基不加入赖氨酸。 分装于无菌小试管内，每管

　　0 . 5 mL,上面滴加一层液体石蜡，115 ℃高压灭菌 10 min。

　　B.1 1 . 3 试验方法

　　从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h~24 h,观察结果。 氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。 阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。 对照管应为黄色。

　　B.12 糖发酵管

　　B.12 . 1 成分

　　B.12 . 2 制备

　　B.12 . 2 . 1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节 pH 至 7 . 4±0 . 2 。按 0 . 5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121 ℃高压灭菌 15 min。

　　B.12 . 2 . 2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶 100 mL, 121 ℃高压灭菌 15 min。 另将各种糖类分别配好 10%溶液，同时高压灭菌。 将 5 mL糖溶液加入于 100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。 若蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

　　B.12 . 3 试验方法

　　从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于 36 ℃ ± 1 ℃培养，一般 2 d~3 d。 迟缓反应需观察 14 d~ 30 d 。

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　　B.13 . 2 制备

　　将 ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白陈水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管 0 . 5 mL,用橡皮塞塞紧。

　　B.13 . 3 试验方法

　　自琼脂斜面上挑取培养物 1 满环接种于 36 ℃ ± 1 ℃培养 1 h~3 h 和 24 h 观察结果。 如果 β-半乳糖苷酶产生，则于 1 h~3 h变黄色，如无此酶则 24 h不变色。

　　B.14 半固体琼脂

　　B.14 . 2 制备

　　将上述成分溶于水中，煮沸溶解，调节 pH 至 7 . 4±0 . 2,分装小试管，121 ℃高压灭菌 20 min。 直立凝固备用。

　　注：供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验用。

　　B.15 丙二酸钠培养基

　　B.15 . 1 成分

　　B.15 . 2 制备

　　除指示剂以外的成分溶解于水，调节 pH 至 6 . 8±0 . 2,再加入指示剂，分装试管，121 ℃高压灭菌15 min 。

　　B.15 . 3 试验方法

　　用新鲜的琼脂培养物接种，于 36 ℃ ± 1 ℃培养 48 h,观察结果。 阳性者由绿色变为蓝色。