资料介绍
ICS 67. 050 CCS X 04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5873—2025
禽肉中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌
血清型鉴定方法
Method for serotyping of Salmonella Typhimurium and
Salmonella Enteritidis in poultry
2025‑12 ‑ 11 发布 2026‑07‑01 实施
中华人民共和国海关总署 发 布
SN/T 5873—2025
前 言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国青岛海关、宁波中钦检测科技有限公司、北京陆桥技术股份有限公司、中华人民共和国济南海关。
本文件主要起草人：唐静、许文娟、于娟娟、殷培军、刘娟娟、贾俊涛、辛学谦、李明哲、赵波、朱琳、刘文、何京澄、李正义、姜英辉、赵晗、段效辉、张敏爱、叶佳楣、黄小华、王小叶、吴丽娜、张秋艳、马云、徐玮。
Ⅰ
SN/T 5873—2025
禽肉中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌
血清型鉴定方法
1 范围
本文件描述了禽肉中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌血清型鉴定方法。
本文件适用于禽肉中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌血清型的鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。
3.1
鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella Typhimurium
一种革兰氏阴性杆菌，属多价 O 抗血清的 B 群，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，三糖铁试验产碱产酸，动力阳性，H2S 试验强阳性，脲酶试验阴性。
3.2
肠炎沙门氏菌 Salmonella Enteritidis
一种革兰氏阴性杆菌，属多价 O 抗血清的 D 群，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，三糖铁试验产碱产酸，动力阳性，H2S 试验强阳性，脲酶试验阴性。
4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
4.1 冰箱：2 ℃~5 ℃ 。
4.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ , 42 ℃±1 ℃ 。
4.3 均质器。
4.4 振荡器。
4.5 电子天平：感量 0.1 g。
4.6 无菌锥形瓶：容量 500 mL，250 mL 。
4.7 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
4.8 无菌培养皿：直径 60 mm 、90 mm 。
4.9 无菌试管：3 mm×50 mm 、10 mm×75 mm 。
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4.10 电位 pH 计：准确度为 0.01 pH 。
4.11 全自动微生物生化鉴定系统。
4.12 无菌毛细管。
4.13 显微镜：光学显微镜，如有条件可配相差显微镜，放大 1 000 倍或以上。
4.14 载玻片和盖玻片。
4.15 微孔板。
5 培养基和试剂
5.1 本文件所涉及培养基和试剂按照 GB 4789.4 的规定。
5.2 沙门氏菌 O 多价、H 多价、Vi、O∶4、O∶5、O∶9、O∶46、H ∶i、H ∶g、H ∶m 、H ∶q、H ∶s、H ∶2 诊断血清。注：影响本文件实验结果的关键因素为沙门氏菌诊断血清，使用过程中参照附录 A 的方法进行质量控制。
5.3 生化鉴定试剂盒。
5.4 脑心浸液肉汤(BHI)。
6 检验程序
禽肉中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌血清型检验程序见图 1。
样品处理、前增菌、增菌、分离和生化鉴定
按照GB 4789.4进行
沙门氏菌
检查培养物有无自凝性,对于无自凝性的培养物进行血清学鉴定
0:9
0:4
+
H:G(或H:g)
-
- +
0:5
+
-
+或- H:i
H:m
- +
-
+
H:2
H:q和H:s
- +
- +
鼠伤寒沙门氏菌
0:46
- +
非鼠伤寒沙门氏菌
肠炎沙门氏菌
非肠炎沙门氏菌
报告
图 1 禽肉中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌血清型检验程序
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7 操作步骤
7.1 前增菌、增菌、分离和生化鉴定
沙门氏菌的前增菌、增菌、分离和生化鉴定按 GB 4789.4 进行。对于生化鉴定确证为沙门氏菌阳性的样品，需取营养琼脂平板上新鲜的纯培养物进行血清学鉴定。
7.2 血清学鉴定
7.2.1 鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的抗原
表 1 列出了鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的抗原。
表 1 鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的抗原表
菌名
拉丁菌名
O 抗原 b
H 抗原
第 1 相
第 2 相
鼠伤寒沙门氏菌
Salmonella Typhimurium
1，4，[5]，12
i
1，2
肠炎沙门氏菌 a
Salmonella Enteritidis
1，9，12
g，m
—
a 除了 H ∶g，m 因子外，有些菌株还会有 H ∶p 或 H ∶f 或 H ∶t 因子。罕有第 2 相为 H ∶1，7 因子的菌株。 b 带有下划线的 O 因子是由噬菌体溶原化产生的。带有中括号的 O 因子与噬菌体转化无关。
7.2.2 检查培养物有无自凝性
在进行血清学分型前，首先要排除自凝集反应。取营养琼脂平板上 36 ℃±1 ℃过夜培养的纯培养物作为玻片凝集试验用的抗原。在洁净的玻片上，滴加一滴生理盐水，将待试抗原混合于生理盐水液滴内，使其成为均一的菌悬液，轻轻摇动玻片 30 s~60 s，观察待试抗原是否发生自凝集反应。推荐在黑色背景下进行观察，必要时可配合使用放大镜，若出现可见的菌体凝集，即认为待试抗原有自凝性，反之无自凝性。
对于待试抗原有自凝性的菌株可以选择下列两种方法其中的任意一种来进一步判定有无自凝性。第一种方法是将无菌生理盐水更换为无菌水，进行自凝集反应。第二种是将该菌株在半固体琼脂上培养，用半固体琼脂上的培养物进行自凝集反应。对于自凝集反应阳性的菌株不能进一步进行血清学分型。对于自凝集反应阴性的菌株可进一步进行鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的血清学分型。
7.2.3 O 抗原检测方法
通常使用载玻片凝集法检测 O 抗原。对于不同制造商生产的血清，可能会存在玻片上滴加血清的量不同，血清和待测抗原的混合方式不同，作用时间长短不同和结果观察判读方式有差别等情况。在使用过程中，务必遵守制造商的说明进行具体操作。常规的操作步骤是在玻片上划出 2 个区域，一个区域滴加 O 抗血清进行检测，一个区域滴加无菌生理盐水作为对照，可以从平板、试管或肉汤中取待测抗原与 O 抗血清或无菌生理盐水混合成菌悬液。将玻片轻轻地前后倾斜摇动混合，混合时间参照产品说明书，随后观察是否凝集。推荐在黑色背景下进行观察，任何程度的凝集现象(有颗粒存在)皆为阳性反应。 O 抗血清不凝集时，将待测菌株接种在琼脂含量较高的(如 2%~3%)培养基上，36 ℃±1 ℃ 培养 18 h~ 24 h 后，再进行 Vi 抗原检测;若 Vi 抗原凝集，说明有 Vi 抗原的存在。当 Vi 抗原的存在而阻止了 O 抗原凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 无菌生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再进行检测。
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7.2.4 H 抗原检测方法
操作同 7.2.3 。O 抗原凝集后，用 H 抗原做凝集实验，H 抗原不凝集可能是由于 H 抗原发育不良。当 H 抗原发育不良时，将待试抗原接种在 0.55%~0.65% 半固体琼脂平板的中央，待试抗原的菌落蔓延生长时，取其菌落边缘部分的菌体进行凝集实验;或将待试抗原接种在装有 0.3%~0.4% 半固体琼脂的小玻璃管 1 次~2 次，培养后，自远端取菌培养后再进行凝集实验。沙门氏菌常具有两种类型的 H 抗原(第 1 相和第 2 相)反应，检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第1 相 H 抗原的，可在琼脂斜面上接种 1 代~2 代后再进行检测。如仍只检出一个相的 H 抗原，需要位相变异的方法进行检测。通过抑制显性的 H 相，使第二个 H 相得以表达和鉴定。位相变异试验方法有很多，如简易平板法、小玻管法、小套管法等。最常用的是简易平板法，具体操作：将 0.35%~0.4% 半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清 1 环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h 后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌进行检测。小玻管法和小套管法可参照 GB 4789.4 进行。
7.3 血清学分型
7.3.1 鼠伤寒沙门氏菌的血清学分型
先用 O∶4 因子血清做凝集试验。如果为阳性反应，则用 O ∶5 因子血清做凝集试验。 O ∶5 因子血清存在阴性和阳性两种反应。无论是哪种情况，都需要做 H ∶i 因子血清的凝集试验。如果为阳性反应，则用 H ∶2 因子血清做凝集试验。如果为阳性反应，则可判定为鼠伤寒沙门氏菌，反之则不是鼠伤寒沙门氏菌。
7.3.2 肠炎沙门氏菌的血清学分型
先用 O ∶9 因子血清做凝集试验。如果为阳性反应，则用 H ∶G 或 H ∶g 因子血清做凝集试验。如果为阳性反应，则用 H ∶m 因子血清做凝集试验。如果为阳性反应，则用 H ∶q 和 H ∶s 因子血清做凝集试验。如果为阴性反应，则用 O∶46 因子血清做凝集试验。如果为阴性反应，则可判定为肠炎沙门氏菌，反之则不是肠炎沙门氏菌。
7.3.3 结果报告
综合生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g(mL)样品中检出或未检出鼠伤寒沙门氏菌或肠炎沙门氏菌。
8 微孔板法进行鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌血清型分型(选做项目)
8.1 实验室需要对大量的沙门氏菌菌株进行血清分型时，可以使用微孔板法。
8.2 实验所使用的血清可以提前用排枪或其他多管分液系统分装到无菌 96 孔板中，每孔 150 µL，制备好的 96 孔板密封后可以在 4 ℃±1 ℃条件下存放两周。需制备新鲜的菌悬液用于 O 抗原和 H 抗原的检测。每株待测菌株需要接种两支脑心浸液肉汤，将肉汤在 36 ℃±1 ℃的条件下孵育 4 h~5 h。分别用做O 抗原和 H 抗原的检测。
8.3 孵育后，用于 O 抗原测定的脑心浸液肉汤煮沸 30 min，然后加入等体积的 0.85% 的无菌生理盐水稀释。将稀释好的 O 抗原菌悬液添加到制备好的微孔板中，每孔 150 µL，O 抗原微孔板密封后在 50 ℃孵育 18 h±3 h。孵育后进行凝集检查，凝集物在底部沉淀，从微孔板下方观察最佳。
8.4 孵育后，用于 H 抗原测定的脑心浸液肉汤加入等体积的 0.85% 的无菌生理盐水，在室温条件下过
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夜培养后进行测定。将过夜培养好的 H 抗原菌悬液添加到制备好的微孔板中，每孔 150 µL，H 抗原微孔板密封后在 50 ℃水浴中孵育 2 h。水浴中液面高度最好与测试样品在同一水平的高度。孵育后进行凝集检查，凝集物在底部沉淀，从微孔板下方观察最佳。
9 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，并按GB 19489 的有关规定执行。
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附 录 A
(资料性)
血清质量控制的方法
A. 1 在使用血清前，需对其进行检查，用于凝集试验的血清应是清澈的(用于乳胶试验的抗血清除外)。
如果发现血清是浑浊的，需参考产品说明书进行操作。
A.2 血清质量控制的方法如下。
a) 比较法：选择两个菌株(或选取本实验室工作菌株总数量 2% 的菌株数量)，将每种所选菌株培养两次。用这两次培养的重复菌株作为两个新的分离株分别进行血清分型。对两次的结果进行比较，如结果未发现任何差异，说明血清没有质量问题。反之，需要进行进一步的调查。
b) 标准物质法：实验室应保存完整特征的沙门氏菌血清标本，定期(例如每周)选取实验室最常使用的 10 种血清中的一到两支进行血清检查，如果实验结果和预期相同，则说明血清没有质量问题。反之，需要进行进一步的调查。用于质量控制的血清每周可能不同，确保在一个检查周期内覆盖全部实验血清即可。
c) 实验室间比对法：定期参加实验室间比对，以确保本实验室的血清分型测试能力。
A.3 标准菌株的选择：标准菌株推荐从标准菌株保藏中心或其他有效的认证的商业机构获得，阳性对照可以选择鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)ATCC 25241 和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteriti⁃ dis)ATCC 13076，也可以使用其他等效的标准菌株或经验证的等效菌株。
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