资料介绍
ICS 67. 050 CCS X 04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5875—2025
出口食品及加工环境中李斯特菌属
计数方法
Enumeration of Listeria spp. in exported food and processing environment
2025‑12 ‑ 11 发布 2026‑07‑01 实施
中华人民共和国海关总署 发 布
SN/T 5875—2025
前 言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国济南海关、中华人民共和国青岛海关、北京陆桥技术股份有限公司、中华人民共和国合肥海关。
本文件主要起草人：赵晗、段效辉、郝莹、于娟娟、许文娟、姚静、史青、刘秀丽、贾俊涛、韩芳、刘娟娟、黄小华、王云霞、丛中笑、徐娟。
Ⅰ
SN/T 5875—2025
出口食品及加工环境中李斯特菌属
计数方法
1 范围
本文件描述了出口食品及加工环境中李斯特菌属的计数方法。
本文件适用于出口食品和加工环境中李斯特菌属的菌落计数。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
李斯特菌属 Listeria spp.
包括单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绵羊李斯特菌(Listeria ivanvii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)。
4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
4.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃ 、36 ℃±1 ℃ 。
4.2 冰箱：2 ℃~8 ℃ 。
4.3 无菌涂抹棉签或其他涂抹材料。
4.4 拍击式均质器。
4.5 振荡器。
4.6 显微镜物镜：10×~100× ,如有条件可配相差显微镜。
4.7 天平：感量 0.1 g。
4.8 无菌移液管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
4.9 无菌培养皿：直径 90 mm(或其他商业用一次性无菌平皿)。
4.10 无菌涂布棒。
4.11 载玻片和盖玻片。
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5 培养基和试剂
5.1 缓冲蛋白胨水(BPW)：见附录 A 中 A.1。
5.2 无抑制剂的 Fraser 肉汤：见 A.2。
5.3 ALOA 李斯特菌琼脂培养基：见 A.3。
5.4 含 0.6% 酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)：见 A.4。
5.5 含 0.6% 酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)：见 A.5。
5.6 革兰氏染色液：见 A.6。
5.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(VP 试验用)：见 A.7。
5.8 过氧化氢试剂：见 A.8。
6 检验程序
李斯特菌属平板计数程序见图 1。当按照本程序检测时，测定每克、每毫升或每平方厘米的李斯特菌属菌落形成单位(CFU)数。
检样
25 g (mL)样品+225 mL稀释液(表面涂拭样品,记录取样面积与对应的样品匀液体积),均质
10倍系列稀释
选择 2 个~3 个适宜连续稀释度的样品匀液,
接种 AL0A 李斯特菌琼脂培养基
36 ℃±1 ℃ , 24 h~48 h
计数及确证实验
报告
图 1 李斯特菌属平板计数程序
7 操作步骤
7.1 样品制备和稀释
7.1.1 食品：以无菌操作称取样品 25 g(mL)，放入盛有 225 mL 缓冲蛋白胨水或无抑制剂的 Fraser 肉汤的无菌均质袋(或均质杯)内，在拍击式均质器上连续均质 1 min~2 min 或以 8 000 r/min~10 000 r/min均质 1 min~2 min，混合均匀，制成 1 ∶10 的样品匀液。
7.1.2 需表面涂拭检测的样品：以无菌操作将灭菌后的涂抹棉签或其它材料，例如，滤纸片、涂抹海绵等，蘸取缓冲蛋白胨水或无抑制剂的 Fraser 肉汤，在确定的采样面积内横竖往返涂抹各 5 次，放回其蘸取的稀释液中。折断涂抹材料根部(如果有)让棉签完全浸入稀释液中，振荡或反复挤压使其成为初始样品匀液。注意手不应触碰落入稀释液中的材料部分。将混合液置于室温(20 ℃~30 ℃)1 h~1.5 h，以修复损
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伤的李斯特菌。记录下单位涂抹面积对应初始样品匀液的体积，例如，涂抹 25 cm2 的表面，浸入 25 mL稀释液，1 mL 初始样品匀液代表 1 cm2 的涂抹面积。
7.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取样品匀液，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 缓冲蛋白胨水或无抑制剂的 Fraser 肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面)，振摇试管或换用 1 支 1 mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀。根据对样品污染状况的估计，按前述操作，依次制成 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。
7.2 样品接种和培养
每个稀释度的样品匀液分别吸取 1 mL，以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加入 3 个 ALOA 李斯特菌琼脂平板，尽快用无菌涂布棒涂布整个平板，注意不应触及平板边缘。使用前，如琼脂平板表面有水珠，可放在 25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
在通常情况下，涂布后将平板静置 10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱 36 ℃±1 ℃培养 1 h;等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 ℃±1 ℃培养 24 h~48 h。
7.3 典型菌落计数和确认
7.3.1 李斯特菌属在 ALOA 李斯特菌琼脂平板上的菌落为蓝绿色菌落，有或无不透明光环。
7.3.2 选 择 有 典 型 李 斯 特 菌 属 特 征 菌 落 的 平 板 ，且 同 一 稀 释 度 3 个 平 板 所 有 菌 落 数 合 计 在 15 CFU~
150 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。
7.3.3 从 典 型 菌 落 中 任 选 5 个 菌 落(小 于 5 个 全 选)，划 线 转 接 于 TSA-YE 平 板 ，于 36 ℃ ±1 ℃ 培 养
18 h~24 h ，对新鲜纯培养物进行确证试验 。
——染色镜检：李斯特菌属为革兰氏阳性短杆菌或球杆菌。
——过氧化氢酶试验：挑取纯培养的单个典型菌落于洁净载玻片上，滴加 1 滴 3% 的过氧化氢溶液，如果在 30 s 内出现气泡则为阳性。李斯特菌属呈过氧化氢酶阳性反应。
——VP 试验：将纯培养的单个典型菌落接种于 1 mL 缓冲葡萄糖蛋白胨水中，36 ℃±1 ℃培养 48 h。加入 6% α-萘酚-乙醇溶液 0.5 mL 和 40% 氢氧化钾溶液 0.2 mL，充分振摇试管，10 min~30 min内观察结果，出现红色为阳性反应。李斯特菌属呈 VP 阳性反应。
——25 ℃生长的运动性试验(可选)：挑取纯培养的单个典型菌落接种于 TSB-YE 肉汤，25 ℃±1 ℃培养 8 h~24 h，直至培养基变浑浊。用接种环将菌液滴到洁净载玻片上，压上盖玻片，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。球菌、大型杆状菌或游动迅速的杆状菌不属于李斯特菌属。
8 结果计算
8.1 若只有一个稀释度的平板菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落，按 8.7 中式(1)计算。
8.2 若所有稀释度的平板菌落数均小于 15 CFU 且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落，按 8.7 中式(1)计算。
8.3 若某一稀释度的平板菌落数大于 150 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按 8.7 中式(1)计算。
8.4 若所有稀释度的平板菌落数均大于 150 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落，按 8.7 中式(1)计算。
8.5 若 所 有 稀 释 度 的 平 板 菌 落 数 均 不 在 15 CFU~150 CFU 之 间 且 有 典 型 菌 落 ，其 中 一 部 分 小 于
15 CFU 或 大 于 150 CFU 时 ，应 计 数 最 接 近 15 CFU 或 150 CFU 的 稀 释 度 平 板 上 的 典 型 菌 落 ，按
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8.7 中 式(1)计算 。
8.6 若 2 个连续稀释度的平板菌落数均在 15 CFU~150 CFU 之间，按 8.7 中式(2)计算。
8.7 计算公式
式(1)：
T …………………………( 1 )
式中：
T ——样品中李斯特菌属菌落数;
A ——某一稀释度典型菌菌落的总数;
B ——某一稀释度确证为李斯特菌属的菌落数;
C ——某一稀释度用于李斯特菌属确证试验的菌落数;
d ——稀释因子。
式(2)：
T …………………………( 2 )
式中：
T ——样品中李斯特菌属菌落数;
A1 ——第一稀释度(低稀释倍数)典型菌菌落的总数;
B1 ——第一稀释度(低稀释倍数)确证为李斯特菌属的菌落数;
C1 ——第一稀释度(低稀释倍数)用于李斯特菌属确证试验的菌落数;
A2 ——第二稀释度(高稀释倍数)典型菌菌落的总数;
B2 ——第二稀释度(高稀释倍数)确证为李斯特菌属的菌落数;
C2 ——第二稀释度(高稀释倍数)用于李斯特菌属确证试验的菌落数;
1.1——计算系数;
d ——稀释因子(第一稀释度)。
最后，根据计算结果和样品匀液所代表的样品重量、体积或面积，换算出单位重量、单位体积或单位面积的样品中李斯特菌属数量。
9 结果报告
9.1 食品样品称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
9.2 表面涂拭样品，以 CFU/cm2 表示。
如 T 值为 0，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告。
10 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测，所有培养物和废弃物应按 GB 19489中的有关规定执行。
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附 录 A
(规范性)
培养基和试剂及配制方法
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW )
A.1.1 成分
蛋白胨
10.0 g
氯化钠
5.0 g
磷酸氢二钠
9.0 g
磷酸二氢钾
1.5 g
蒸馏水
1 000 mL
A.1.2 制法
加热搅拌至溶解，调节 pH 至 7.2±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.2 无抑制剂的 Fraser 肉汤
A.2.1 成分
酪蛋白酶消化物
5.0 g
动物组织酶消化物
5.0 g
牛肉浸膏
5.0 g
酵母浸膏
5.0 g
氯化钠
20.0 g
磷酸氢二钠
12.0 g
磷酸二氢钾
1.35 g
七叶苷
1.0 g
蒸馏水
1 000 mL
A.2.2 制法
加热搅拌至溶解，调节 pH 至 7.2±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.3 ALOA 李斯特菌琼脂培养基
A.3.1 基础培养基
动物组织酶消化物 18.0 g
酪蛋白酶消化物 6.0 g
酵母浸膏 10.0 g
丙酮酸钠 2.0 g
葡萄糖 2.0 g
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甘油磷酸镁
1.0 g
无水硫酸镁
0.5 g
氯化钠
5.0 g
氯化锂
10.0 g
无水磷酸氢二钠
2.5 g
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷
0.05 g
琼脂
15.0 g
蒸馏水
930 mL
a如使用两性霉素 B 溶液，则为 925 mL(见 A.3.5.2)。
将上述成分煮沸溶解，调节 pH 至 7.2±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.3.2 萘啶酮酸溶液
萘啶酮酸钠 0.02 g
0.05 mol/L 氢氧化钠溶液 5.0 mL
将萘啶酮酸钠溶解于氢氧化钠溶液中，用 0.45 μm 滤膜过滤除菌，备用。
A.3.3 头孢他啶溶液
头孢他啶 0.02 g
蒸馏水 5.0 mL
将头孢他啶溶解于水中，用 0.45 μm 滤膜过滤除菌，备用。
A.3.4 多黏菌素 B 溶液
硫酸多黏菌素 B 76 700 IU
蒸馏水 5.0 mL
将多黏菌素 B 溶解于水中，用 0.45 μm 滤膜过滤除菌，备用。
A.3.5 抗生素添加剂
A.3.5.1 放线菌酮溶液
放线菌酮
0.05 g
乙醇
2.5 mL
蒸馏水
2.5 mL
将放线菌酮溶于 2.5 mL 乙醇，然后加入 2.5 mL 水，用 0.45 μm 滤膜过滤除菌，备用。
A.3.5.2 两性霉素 B 溶液(可替代放线菌酮溶液)
两性霉素 B
0.01 g
1 mol/L HCl
2.5 mL
二甲基甲酰胺(DMF)
7.5 mL
将两性霉素溶于 HCl/DMF 溶液，用 0.45 μm 滤膜过滤除菌，备用。警告：HCl/DMF 溶液有毒，请小心操作。
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A.3.6 补充添加剂
将 2.0 g L-α-磷脂酰肌醇溶于 50 mL 蒸馏水中。
2.0 g 含 9%~15% 普通磷脂酰肌醇的大豆卵磷脂可替代 L-α-磷脂酰肌醇。
搅拌约 30 min 直至获得均匀的悬浮液，121 ℃高压灭菌 15 min，冷却至 47 ℃~50 ℃ ,备用。
A.3.7 完全培养基
A.3.7.1 成分
基础培养基
930 mL
萘啶酮酸溶液
5.0 mL
头孢他啶溶液
5.0 mL
多黏菌素 B 溶液
5.0 mL
放线菌酮溶液
5.0 mL
或两性霉素 B 溶液
10.0 mL
补充添加剂
50.0 mL
a如使用两性霉素 B 溶液，则为 925 mL(见 A.3.5.2)。
A.3.7.2 制法
当基础培养基的温度约为 47 ℃~50 ℃时，依次加入各添加剂，每种添加剂加入时均需充分混匀。将完
全培养基 pH 调节至 25℃下7.2±0.2，培养基应为均匀的乳白色。完全培养基配制后倾注无菌平皿，备用。 A.4 含 0.6% 酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA‑YE)
A.4.1 成分
胰胨
17.0 g
多价胨
3.0 g
酵母膏
6.0 g
氯化钠
5.0 g
磷酸氢二钾
2.5 g
葡萄糖
2.5 g
琼脂
15.0 g
蒸馏水
1 000 mL
A.4.2 制法
加热搅拌至溶解，调节 pH 至 7.2±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.5 含 0.6% 酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB‑YE)
A.5.1 成分
胰胨 17.0 g
多价胨 3.0 g
酵母膏 6.0 g
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氯化钠 5.0 g
磷酸氢二钾 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
蒸馏水 1 000 mL
A.5.2 制法
加热搅拌至溶解，调节 pH 至 7.2±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.6 革兰氏染色液 A.6.1 结晶紫染色液A.6.1.1 成分
结晶紫 1.0 g
95% 乙醇 20.0 mL
1% 草酸铵水溶液 80.0 mL
A.6.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
A.6.2 革兰氏碘液
A.6.2.1 成分
碘 1.0 g
碘化钾 2.0 g
蒸馏水 300 mL
A.6.2.2 制法
将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL 。
A.6.3 沙黄复染液
A.6.3.1 成分
沙黄 0.25 g
95% 乙醇 10.0 mL
蒸馏水 90.0 mL
A.6.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
A.6.4 染色法
A.6.4.1 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1 min，水洗。
A.6.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。
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A.6.4.3 滴加 95% 乙醇脱色约 15 s~30 s，直至染色液被洗掉，不应过分脱色，水洗。
A.6.4.4 滴加沙黄复染液，复染 1 min，水洗、待干、镜检。
A.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(VP 试验用)
A.7.1 成分
多价胨 7.0 g
葡萄糖 5.0 g
磷酸氢二钾 5.0 g
蒸馏水 1 000 mL
A.7.2 制法
加热搅拌至溶解，调节 pH 至 7.0±0.2，分装试管，每管 1 mL，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.7.3 VP 试验
A.7.3.1 6% α ‑萘酚‑乙醇溶液
成分及制法：取 α-萘酚 6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至 100 mL 。
A.7.3.2 40% 氢氧化钾溶液
成分及制法：取氢氧化钾 40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL 。
A.7.3.3 试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，36 ℃±1 ℃培养 48 h。加入 6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL 和 40% 氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在 36 ℃±1 ℃继续培养1 h 再进行观察。
A.8 过氧化氢试验
A.8.1 试剂
3% 过氧化氢溶液：临用时配制。
A.8.2 试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净平皿内，滴加 3% 过氧化氢溶液 2 滴，观察气泡产生情况。
A.8.3 结果
于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
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