GB/T 35906-2018 猪瘟抗体间接ELISA检测方法

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35906—2018

　　猪瘟抗体间接 ELISA检测方法

　　IndirectELISA todetectantibodyagainstclassicalswinefevervirus

　　2018-02-06 发布 2018-09-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 35906—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出。

　　本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 。

　　本标准起草单位：中国兽医药品监察所。

　　本标准主要起草人：王琴、徐璐、范学政、赵启祖、邹兴启、朱元源、宁宜宝。

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　　引 言

　　牛病毒性腹泻/粘膜病病毒在牛的感染比较严重，偶尔也有猪自然感染的报道。 在田间，牛病毒性腹泻/粘膜病病毒通常对出生后的猪无致病性，仅对胎猪有致病性。 虽然牛病毒性腹泻/粘膜病病毒可在猪群中传播，但这种传播是很有限的。 在没有新的传染源引入的前提下，猪群中已经存在的牛病毒性腹泻/粘膜病病毒会被逐渐清除，病毒的传染链会终止。 牛源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒是猪感染牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的主要来源，主要与牛猪混养程度或使用了污染牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的牛源材料有关。 在我国生猪饲养的主力主要为大中型养殖场，很少存在猪牛混养情况，因此不会导致牛病毒性腹泻/粘膜病病毒在猪群中的流行传播。 另外，猪用疫苗生产中的所使用的牛源原材料均需进行牛病毒性腹泻/粘膜病病毒等外源病毒检测，因此，疫苗生产工艺的提高也彻底切断了牛病毒性腹泻/粘膜

　　病病毒在猪群中传播途径。最后，猪瘟疫苗在我国的免疫率接近 100%。而猪瘟病毒与牛病毒性腹泻/

　　粘膜病病毒为同属病毒，免疫上存在一定的交叉保护。 猪群中存在牛病毒性腹泻/粘膜病抗体阳性的可能性微乎其微。 因此，本标准主要针对猪群中猪瘟疫苗免疫后的抗体检测，不用于对个体进行猪瘟抗体和牛病毒性腹泻/粘膜病抗体的鉴别检测。

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　　猪瘟抗体间接 ELISA检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了猪瘟抗体的间接 ELISA 检测方法。

　　本标准适用于猪瘟抗体检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡标注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　兽医实验室生物安全技术管理规范(中华人民共和国农业部公告第 302 号)

　　3 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CSFV：猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)

　　ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

　　HRP：辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase)

　　OD：光密度(Optical Density)

　　4 试剂

　　4 . 1 猪瘟病毒 E2 蛋白：见附录 A。

　　4.2 标准阳性血清：猪瘟疫苗免疫仔猪制备，荧光抗体病毒中和试验检测中和抗体效价 ≥1 ∶ 20 480。

　　4 . 3 标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清，荧光抗体病毒中和试验病毒抗体检测为阴性。

　　4.4 酶结合物：商品化的 HRP 标记的抗猪 IgG抗体，工作浓度参照产品说明书。

　　4 . 5 包被液：见附录 B 中的 B. 1 。

　　4 . 6 磷酸盐缓冲液：见 B. 2 。

　　4 . 7 封闭液：见 B. 3 。

　　4 . 8 1×洗涤液：见 B. 4 。

　　4 . 9 稀释液：见 B. 5 。

　　4 . 10 底物液 A：见 B. 6 。

　　4 . 1 1 底物液 B：见 B. 7 。

　　4 . 12 终止液：见 B. 8 。

　　4 . 13 商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒。

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　　5 器材和设备

　　5 . 1 37 ℃温箱 。

　　5 . 2 酶标仪。

　　5.3 各种规格的微量移液器(20 μL、200 μL、1 000 μL)和吸头。

　　5.4 多道移液器(200 μL)。

　　5 . 5 酶联反应板。

　　5 . 6 血清稀释板：96 孔一次性 U 型血凝板或 96 孔细胞培养板。

　　5.7 一次性注射器(5 mL~10 mL)。

　　6 血清样本的采集及处理

　　6 . 1 样本采集及处理

　　采集静脉血时，每头猪使用一个注射器。建议进行前腔静脉或耳静脉无菌采血，不少于 2 mL。室温静置于斜面 2 h,待血液自然凝固后，置 2 ℃ ~8 ℃冰箱中放置不少于 2 h, 4 000 r/min 离心 10 min。

　　用移液器小心吸出上层血清。

　　6 . 2 血清样本的存放与运送

　　血清样本若在一周内检测，可置 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存。若超过一周检测，应置- 20 ℃以下冷冻

　　保存。 运输时注意冷藏，确保样品有效。 采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。 按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。

　　7 操作步骤

　　7. 1 包被：用包被液将猪瘟病毒 E2 蛋白稀释至 0. 25 μg/mL,按 100 μL/孔加入到酶联反应板中， 2 ℃ ~8 ℃包被 16 h。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入 1×洗涤液 300 μL,洗涤 1 次。

　　7.2 封闭：每孔加入新鲜配制的封闭液 300 μL, 2 ℃ ~8 ℃封闭 24 h。封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加入 1×洗液 300 μL,洗涤 1 次，即为抗原包被板。抗原包被板若不及时使用，则可将孔中液体在吸水材料上拍干，于室温中干燥(温度 25 ℃ ±2 ℃ ,湿度 ≤40%) 1 h。装于铝箔袋中，抽真空，置于 2 ℃ ~ 8 ℃保存备用。

　　7.3 加稀释液：进行血清检测时，向抗原包被板中加入稀释液，50 μL/孔。

　　7.4 血清的稀释和加样：将待检血清、标准阴性、阳性对照血清于血清稀释板中分别作 1 ∶ 50 稀释后，按位序分别向抗原包被板中加入稀释后的样本，50 μL/孔，其中标准阴、阳性对照血清各加 2 孔。充分混匀后，37 ℃温箱中反应 30 min。吸取不同血清时需要更换吸头。

　　7.5 洗涤：弃去孔中液体，每孔加入 300 μL洗涤液，室温放置 3 min,洗涤 3 次，甩干洗涤液。

　　7.6 加酶结合物和孵育：用稀释液将酶结合物稀释至工作浓度，向每反应孔加入 100 μL。37 ℃温箱孵育 30 min。

　　7 . 7 洗涤：同 7 . 5 。

　　7 . 8 加底物和显色：将底物液 A 和底物液 B 等体积混合，混合后立即加入到抗原包被板中，每孔

　　100 μL,室温避光显色 10 min,每孔加入 100 μL终止液(见 B.8)。

　　7.9 每孔加入终止液 100 μL。

　　7. 10 在酶联免疫检测仪 450 nm 波长处读取各孔的 OD值数，并以 620 nm 或 650 nm 作为背景参考波

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　　长，以去除背景值，15 min 内完成。样本 OD值=OD450 nm-OD620 nm/650 nm 。

　　7 . 1 1 结果计算：

　　阴性对照平均值见式(1) :

　　…………………………( 1 )

　　式中：

　　-

　　N — 阴性对照孔平均值;

　　N1 — 阴性对照孔 1 的 OD值;

　　N2 — 阴性对照孔 2 的 OD值。

　　阳性对照平均值见式(2) :

　　…………………………( 2 )

　　式中：

　　-

　　P — 阳性对照孔平均值;

　　P1 — 阳性对照孔 1 的 OD值;

　　P2 — 阳性对照孔 2 的 OD值。

　　阳性率见式(3) :

　　…………………………( 3 )

　　式中：

　　IE — 阳性率;

　　s — 样本 OD值;

　　-

　　P — 阳性对照孔平均值。

　　7. 12 试验成立条件：当标准阳性对照样本 OD值在 1.0~3.5 范围内，标准阴性对照 IE 值 ≤8%时，试验成立。 否则，应重新检测。

　　7. 13 结果判定：当待检血清样本的 IE值 ≥10%时，判为猪瘟抗体阳性;当血清样本的 IE 值 ≤8%时，判为猪瘟抗体阴性;当血清样本的 IE 值在 8%~10%之间时，判为可疑。可疑结果可在数 日后重新采样检测。 如仍在此范围，判为阴性。

　　7 . 14 采用商品化试剂盒时，按其说明书进行操作和判定。

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　猪瘟病毒 E2 蛋白的表达及纯化

　　A.1 材料和试剂

　　猪瘟兔化弱毒疫苗株;大肠杆菌感受态细胞、pFastBac1 质粒、DH10Bac 感受态细胞、Sf9 细胞、质

　　粒提取试剂盒、转染试剂、无血清培养基均为商品化试剂。

　　A.2 引物序列

　　P1-1 : 5′>ATAGGATCCACCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAAAAGTATTAAG<3′

　　P2-1 : 5 >TAAGCTTACTTGGTACCGTGATGGTGATGGTGATGTCCCATACCAGCGGCG AGTTGTTCTGTTAGAACTACGTAGGTCACTATCAGC<3′

　　M13F: 5 >GTTTTCCCAGTCACGAC<3′

　　M13R: 5′>CAGGAAACAGCTATGAC<3′

　　A.3 方法

　　A.3 . 1 重组转移载体的构建

　　猪瘟兔化弱毒疫苗株 RNA 的提取、反转录合成病毒 cDNA。再用引物 P1-1 和 P2-1 扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株基因，琼脂糖凝胶纯化，将纯化产物和载体 pFastBac1 分别用 BamHI/HindIII酶切、连接，

　　转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得的重组转移载体。

　　A.3 . 2 重组杆粒的构建

　　将重组转移载体转化 DH10Bac 感受态细胞，在筛选培养基上进行蓝白斑筛选，取白斑培养，用PCR方法进行鉴定，引物为 M13F/M13R, 目的片段长度为 3 500 bp。

　　A.3 . 3 转染及病毒鉴定

　　将鉴定正确的克隆菌在培养基中扩大培养，用质粒提取试剂盒提取重组杆粒 DNA,用转染试剂转

　　染 Sf9 细胞，转染后 28 ℃培养 96 h,获得重组病毒。将病毒液在 Sf9 细胞上传 3 代后，以 1%的比例感染 Sf9 细胞，28 ℃培养 96 h后，收集培养上清。

　　A.3 . 4 猪瘟病毒 E2 蛋白的纯化

　　将收集的培养上清 12 000 r/m 离心 10 min,除去细胞碎片，然后将上清用离心超滤法浓缩;浓缩的上清在镍离子亲和层析洗液(50 mmol/L磷酸钠、300 mmol/L氯化钠，pH 7.0)中 4 ℃透析过夜。平衡过的上清加入洗液平衡过镍离子亲和层析柱，4 ℃吸附 30 min 后，用 40 mmol/L 咪唑洗脱，收集洗脱

　　液 。用 SDS-PAGE 电泳检测纯化效果。

　　A.3 . 5 蛋白浓度测定

　　用 BCA 法测定蛋 白浓度，按说明书配制 BSA 蛋 白标准 250 μg/mL、125 μg/mL、50 μg/mL、

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　　25 μg/mL、5 μg/mL、0 μg/mL,将 E2 蛋白稀释 10 倍，其他均按说明书操作。测定 OD592 nm,绘制标

　　准曲线，计算 E2 蛋白浓度。纯化后的 E2 蛋白浓度应 ≥0.1 mg/mL。

　　A.3 . 6 蛋白纯度测定和特异性测定

　　取 5 μL、2 μL、1 μL 纯化产物进行 SDS-PAGE 电泳，用凝胶成像仪中成像并用薄层扫描法测定蛋白纯度，蛋白纯度应 90% 。同时用猪瘟阳性血清对纯化后的 E2 蛋白进行 Western blot 鉴定和 ELISA

　　鉴定，猪瘟阳性血清应仅与目的蛋白发生特异性反应，杂蛋白无反应。

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　试剂配制

　　B.1 包被液的配制

　　称取碳酸钠 1.0 g 和碳酸氢钠 3.0 g,溶于 1 000 mL 去离子水，调节 pH 值至 9.4~9.6。

　　B.2 磷酸盐缓冲液的配制

　　称取十二水合磷酸氢二钠 0.25 g、二水合磷酸二氢钠 3.5 g 和氯化钠 8.5 g,溶于 800 mL 去离子水中，调节 pH 值至 7.2~7.6,用去离子水定容至 1 000 mL。

　　B.3 封闭液的配制

　　称取牛血清白蛋白 3.0 g,溶于 100 mL 磷酸盐缓冲液中。

　　B.4 1 × 洗涤液的配制

　　先配制 20 倍浓缩洗液。称取十二水合磷酸氢二钠 5. 0 g, 二水合磷酸二氢钠 70. 0 g, 氯化钠

　　170.0 g,吐温-20 16.0 mL,加去离子水至 800 mL, 调 pH 值至 7. 4~7. 6,定容至 1 000 mL。121 ℃ 15 min 高压灭菌后，室温存放备用。使用前，将 20 倍浓缩洗液用蒸馏水或去离子水按 1 ∶ 19 的比例混合即可。

　　B.5 稀释液的配制

　　量取 5.0 mL 马血清溶于 95.0 mL磷酸盐缓冲液中。

　　B.6 底物液 A 的配制

　　称取 TMB 200.0 mg,无水乙醇(或二甲基亚砜)100 mL,加双蒸水至 1 000 mL。

　　B.7 底物液 B 的配制

　　十二水合磷酸氢二钠 14.60 g,柠檬酸 9.33 g,0.75%过氧化脲 6.4 mL,加三蒸水至 1 000 mL,调pH 值至 5.0~5.4。

　　B.8 终止液的配制

　　将去离子水与浓盐酸(36%~38%)以 9 ∶ 1 的比例混合即可，室温保存。