GB/T 33124-2016 杨树叶锈病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 33124—2016

　　杨树叶锈病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification ofMelampsoramedusae Thümen

　　2016-10-13发布 2017-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 33124—2016

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归 口 。

　　本标准起草单位 : 中华人民共和国云南出入境检验检疫局 、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学研究院 。

　　本标准主要起草人 :杜宇 、岳亮亮 、王宏毅 、黄振 、曹云华 、梅华全 、邓裕亮 、吴品姗 、周剑 、段禄华 。

　　杨树叶锈病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了杨树叶锈病菌 Melampsora medusae Thümen,1878的形态学鉴定方法 。

　　本标 准 适 用 于 白 杨 Populus balsamifera L. 、黑 棉 杨 Populus balsamifera subsp. trichocarpa (Torr. & Gray) Brayshaw、美 洲 黑 杨 Populus deltoids Mars 以 及 落 叶 松 属 Larix spp.、松 属 Pinus spp. 、美国花旗松 Pseudotsuga menziesii(Mirb. )上的杨树叶锈病菌的检疫和鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　SN/T 2758 美国圆柏苹果锈病菌检疫鉴定方法

　　SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样

　　3 术语和定义

　　SN/T 2758界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　冬孢子 teliospore

　　由双核菌丝的顶端细胞发育成的有性休眠孢子 ,该类孢子产生担子 。

　　3.2

　　冬孢子堆 telia

　　由冬孢子聚集而成 。

　　注 : 冬孢子堆多数分布在叶背 ,有些穿过叶表面 。

　　3.3

　　夏孢子 urediniospore

　　由锈孢子产生的双核菌丝体上产生的重复性营养阶段孢子 。

　　注 : 夏孢子开始是在寄主体内生活 ,然后穿破表皮向 外 扩 散 。进 入 细 胞 后 , 以 单 细 胞 的 形 态 , 生 出 密 集 的 刺 状 或 泡状的小棘 ;上有数个发芽孔 , 以芽管发芽 , 同样产生形成夏孢子的菌丝或冬孢子的菌丝 。

　　3.4

　　夏孢子堆 uredinia

　　由锈孢子萌发形成的双核菌丝体上产生的第三种孢子堆 。

　　注 : 栅锈菌属真菌的夏孢子堆没有包被 ,但有周生侧丝 。

　　4 杨树叶锈病菌基本信息

　　中文名 :杨树叶锈病菌

　　英文名 :Poplar rust

　　学名 :Melampsora medusae Thümen,1878

　　GB/T 33124—2016

　　异名 :Uredo medusae(Thümen) Arthur, (1906)

　　无性型 :Caeomafaulliana Hunter(锈孢子器状态)

　　分类地位 : 真菌界 Fungi、担子菌门 Basidiomycota、冬孢菌纲 Teliomycetes、锈菌 目 Uredinales、栅锈菌科 Melampsoraceae、栅锈菌属 Melampsora。

　　传播途径 :带菌杨树 、转主寄主松属和落叶松属植物及美国花旗松 Pseudotsuga menziesii(Mirb. )是远距离传播主要途径 ;锈孢子和夏孢子等可随风较长距离地扩散传播 。

　　杨树叶锈病菌的生物学特性和地理分布等其他信息参见附录 A。

　　5 方法原理

　　主要以夏孢子的形态特征为鉴定依据 ,性孢子器 、锈孢子器 、冬孢子和担子等的形态特征为辅助鉴定依据 。

　　6 仪器设备和试剂

　　6. 1 仪器设备和工具

　　生物显 微 镜 (物 镜 最 大 放 大 倍 数 100倍 , 备 测 量 软 件 或 镜 台 测 微 尺) 、体 视 显 微 镜 (倍 数 不 低 于50倍) 、超净工作台 、滴管 、医用解剖刀 、解剖针 、高压灭菌锅 、载玻片 、盖玻片 、三角瓶(250mL) 。

　　6.2 主要试剂

　　按照 SN/T 2758执行 。

　　7 检测和鉴定

　　7. 1 症状检查与取样

　　7. 1. 1 症状检查

　　7. 1. 1. 1 杨树上的症状检查

　　主要检查杨树叶片是否有淡黄斑 ,特别是叶片背面 ,从植株的下层叶片开始 ,逐步向上层叶片逐 一检查 ,其为害症状参见 A. 3。

　　7. 1. 1.2 针叶树上的症状检查

　　主要检查松针上是否有褪色 、腐烂 ,特别是检查掉落的针叶上是否有褪色和腐烂等症状 ,其为害症状参见 A. 3。

　　7. 1.2 取样

　　如发现病菌为害症状 ,取为害样品送实验室检测 。如果症状不明显或未发现症状 , 随机取样 ,方法按照 SN/T 2122执行 。

　　7.2 样品制备

　　7.2. 1 生长观察

　　7.2. 1. 1 如果在寄主上的症状不明显时 ,将取得的有疑似症状的植株放置于有隔离条件的温室中 ,直到

　　产生夏孢子止(参见 A. 4) 。

　　7.2. 1.2 如果是转主寄主 ,需要将感病松针放置于美洲黑杨或杨树叶锈病菌其他寄主树苗周围 ,杨树叶锈病菌的寄主树苗需要种植于有隔离条件并具备人工吹风的温室中 ,待锈孢子侵染寄主 ,产生夏孢子止(参见 A. 4) 。

　　7.2.2 制片

　　7.2.2. 1 切片法

　　采用徒手切片法将杨树叶片或针叶切成薄片(1. 0 μm~ 1. 5 μm) ,放在载玻片的水滴中 ,加一滴乳酚油作浮载剂 ,加盖玻片 ,备镜检 。

　　7.2.2.2 针刺法

　　用针直接刮取孢子堆上的孢子粉置于离心管中 ,加入适量的席尔氏浮载剂制成孢子悬浮液 ,用可调微量加样器吸取适量(以 加 盖 玻 片 后 悬 浮 液 不 外 溢 为 宜) 悬 浮 液 至 载 玻 片 上 , 加 盖 玻 片 , 制 成 玻 片 , 备镜检 。

　　7.3 形态鉴定

　　7.3. 1 性孢子器

　　性孢子器主要是附着在叶面上 ,包被于角质层下 ,散生 ,淡黄色 ,长 40 μm~ 55 μm。

　　7.3.2 锈孢子器

　　锈孢子器着生在叶背 ,裸生 ,淡黄色 , 大量孢子器堆生 , 直径 0. 5 mm;锈孢子链珠状 , 近球形 , 直径17μm~ 22 μm ,孢子壁无色 ,厚 2. 5 μm~ 3 μm ,表面略粗糙 。

　　7.3.3 夏孢子

　　夏孢子堆着生于叶表皮 下 , 大 多 数 突 出 于 叶 背 面 , 少 量 突 出 叶 表 , 金 黄 色 至 橙 色 , 直 径 150 μm~ 250 μm ,在一些寄主上主要分布在上层叶表 ,表现为淡色小斑 ;夏孢子卵圆形至圆形 ,有时近梨形 ,端部圆形 ,基 部 平 截 , 内 容 物 金 黄 色 , 壁 无 色 ; 长 (23 μm ~ 37 μm) × (13 μm ~ 21 μm) , 端 部 厚 1 μm ~ 1. 5 μm ,基部厚 2 μm ,两侧厚 3 μm~ 5. 5 μm;壁上被棘 ,长 8 μm~ 12μm ,超过腰部的一半的区域光滑 ,极少数几乎整个腰部全部光滑 ;小棘长 1 μm~ 1. 5 μm ,宽 0. 5 μm~0. 7 μm ,棘间距 1. 5 μm~ 3 μm , 临近光滑区域 ,小棘变小 。发芽孔几乎不可见 ,孢子上有 2~4 处可萌芽 。夏孢子萌发的菌丝 ,从夏孢子堆上四散开来 ,呈头状丝序 ,柄长 70 μm ,宽 4 μm~ 6 μm ,顶端近圆形 ,直径 14μm~ 17μm ,或倒卵圆形 ,少数棍棒形 , (18μm~ 22μm) × (12μm~ 16μm) ,壁厚度均匀 ,1. 5 μm~ 3 μm ,少数在端部可厚达 4 μm。杨树叶锈病菌夏孢子的形态特征见附录 B。

　　7.3.4 冬孢子

　　在老叶上 ,冬孢子堆与夏孢子堆混合 ,在落叶上大量发生 , 主要分布在叶背面 ,在严重感病时 ,也分布在叶面 ,开始时呈淡琥珀棕色 ,变黑后 ,呈深红棕色 ,干枯时呈近黑色 ,冬孢子堆微突出 ,在表皮层下 ,近圆形至规则形 , 3 个 ~ 4 个或更多的孢子堆聚集成 1 个较大的孢子堆 ,单个冬孢子堆直 径 90 μm~ 350 μm。有些冬孢子堆穿过叶面 ,在叶两面上产生冬孢子 。冬孢子是单细胞 , 近圆柱形 ,横切面呈圆形至不规则形 ,直径 30 μm~40 μm ,壁厚 11 μm~ 14μm ,有时在端部壁厚 2 μm~2. 5 μm ,包被于寄主表皮层下 。

　　7.3.5 担子

　　担子在越冬冬孢子堆的表面 ,产生于冬孢子端部的小孔 ,呈一层金色 ,着生于短柄上 ,短柄宽 2 μm ~ 2. 5 μm ,长 2 μm~ 3 μm;担子圆柱形 ,端圆 ; 由 4个细胞组成 ,直或微曲 , (40 μm~ 65 μm) × (7 μm~ 8 μm) ; 内容物淡金黄色 ,壁无色 。担子细胞具柄 ,基部宽 2 μm~ 2. 5 μm ,长 10 μm~ 12 μm , 向端部渐窄 。担孢子球形 ,直径 7. 5 μm~ 11μm ,孢子上有 1小突起与小梗联接 , 内容物淡金黄色 ,壁无色 ;通常 ,从长 10 μm~ 12 μm 的小梗上长出次生的小梗上的担孢子较小 。

　　7.4 与近似种的区别

　　杨树叶锈病菌的近似种是阿尔伯塔杨树叶锈病菌 Melampsora albertensis Arthur, 1906和青杨叶锈病菌 Melampsora larici-populina Kleb,1902。其区别参见附录 C。

　　8 结果判定

　　如果检出样品上的病菌形态与 7. 3 的描述相符 ,则判定为杨树叶锈病菌 。

　　9 样品保存

　　9. 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存 。对检出杨树叶锈病菌的样品应保存于 5 ℃ ~ 8 ℃冰箱中 ,保存期 1 个月 , 以备复核 。另外 ,可制作干标本(参见 D. 1) ,长期保存 。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理 。

　　9.2 夏孢子的保存

　　采用超低温保存法(参见 D. 2)进行菌株保存 。

　　9.3 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括 :样品的来源 、种类 、时间 ,实验的时间 、地点 、方法 、结果 、症状和病菌显微照片等 ,并有实验人员和审核人员签字 。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　杨树叶锈病菌的其他信息

　　A. 1 地理分布

　　欧洲 : 比利时 、法国 、葡萄牙 、西班牙 。

　　亚洲 : 日本 。

　　非洲 :南非 、津巴布韦 。

　　北美洲 :加拿大 、墨西哥 、美国 。

　　南美洲 : 阿根廷 、玻利维亚 、巴西 、智利 、乌拉圭 。

　　大洋洲 :澳大利亚 、新西兰 。

　　A.2 寄主范围

　　主要寄主 : 白杨 Populusbalsamifera L. 、黑棉杨 Populusbalsamifera subsp.trichocarpa (Torr. & Gray) Brayshaw、美洲黑杨 Populusdeltoids Mars。

　　转主寄主 :落叶松属 Larix spp.、松属 Pinus spp. 、美国花旗松 Pseudotsuga menziesii(Mirb. ) 。

　　A.3 为害症状

　　杨树叶锈病菌在不同寄主植物上的症状表现有所不同(参见图 A. 1) ,具体如下所示 :

　　a) 在杨树上 :

　　初期侵染表现为淡黄斑 ,夏孢子堆通常在侵染寄主 2 周 ~ 3 周后分布于叶背面(严重时 , 叶表面也有分布) 。首先侵染下层叶片 ,之后扩散到整株树 。 叶片干枯 ,并提前脱落 。 3 周内 ,整株树木的叶片可全部脱落 。杨树上的其他栅锈菌也可能导致同样的为害症状 。

　　b) 在针叶上 :

　　当年的松针褪色 、腐烂 ,并被有夏孢子堆和锈孢子器 。这些孢子器只在针叶上分布 ,极少分布在新芽上 。受侵染的叶片最终枯死并脱落 。

　　说明 :

　　1~ 6— 杨树上的夏孢子堆 ;

　　7 — 冬孢子堆 ;

　　8 — 松针上的性孢子器 ;

　　9 — 美国落叶松上的锈孢子器 ;

　　10 — 松针上的锈孢子器 。

　　注 : 1 和 4 引用 自 Anderson, 2010; 2 和 9 引 用 自 Shain等 , 1989; 3 和 6 引 用 自 Cranshaw, 2008; 5 引 用 自 Ridley &Dick,2010;7引用 自 nature.barkeley. edu,2012;8引用 自 Schippers,2012;10引用 自 Hunt,1978。

　　图 A. 1 杨树叶锈病菌 Melampsoramedusae Thümen为害症状

　　A.4 生物学和生态学特性

　　杨树叶锈病菌属于转主寄生的担子菌 ,但是在自然条件下 ,夏孢子不需要转主寄主 ,可在寄主杨树的叶芽和树皮下越冬 。春季 ,杨树上的冬孢子堆产生担孢子侵染针叶 ,在叶片上形成性孢子器和锈孢子器 。锈孢子可随风长距离扩散 ,在夏季侵染易感病杨树 。锈孢子不再侵染针叶寄主 。在杨树上形成的夏孢子也能随风长距离扩散 。在北半球的湿热地区和南半球 ,夏孢子是主要的侵染源 。夏孢子发育成芽管穿越杨树的叶片 ,芽管在叶面上扩张 ,并通过气孔侵入叶内 , 附着胞有或无 。亚气孔囊泡形成后 ,膨大并包围数个细胞 ,成为吸器的原母细胞 ,形成吸器后 , 即建立寄生关系 。湿润 、温热的气候条件有利于该病害的暴发 。

　　杨树叶具有明显的小种分化 ,不同的小种其侵染力也不同 。杨树叶锈病菌的侵染力主要受到温度的影响 ,另外 ,分布在不同地域中的小种 ,其侵染力也不同 ,分布在北纬的杨树叶锈病菌比分布在南纬的小种侵染力更强 。 同样也有因不同寄主的小种分化 。

　　在美洲黑杨树叶上 ,冬孢子堆经冬破除休眠后发育成担孢子 ,担孢子侵染落叶松属和其他松属 、花旗松属针叶树 。在受侵染的松针上形成性孢子器和锈孢子器 ,锈孢子器释放锈孢子侵染易感病美洲黑杨叶片 。在杨树叶锈病流行的美国东南部 ,夏孢子堆最早于 6 月 出现 。冬孢子堆于晚夏和秋季形成 。

　　夏孢子侵染美洲黑杨需要叶片保持 8 h 的湿润 。夏孢子萌发的最适温度是 15 ℃ ~ 21 ℃ 。

　　杨树叶锈病菌的生活史见图 A. 2。

　　图 A.2 杨树叶锈病菌 Melampsoramedusae Thümen的生活史

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　杨树叶锈病菌夏孢子的形态特征

　　杨树叶锈病菌夏孢子的形态特征图见图 B. 1、图 B. 2。

　　注 : A. 引用 自 Newcombe & Chastagner,1993;B. 引用 自 Spiers,1985。

　　图 B. 1 杨树叶锈病菌 Melampsoramedusae Thümen夏孢子电镜扫描图

　　注 : 引用 自 Newcombe & Chastagner,1993。

　　图 B.2 杨树叶锈病菌 Melampsoramedusae Thümen夏孢子光学显微照片

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　杨树叶锈病菌与近似种的区别

　　杨树叶锈病菌(Melampsora medusae Thümen,1878)的近似种类是阿尔伯塔杨树叶锈病菌(Mel- ampsoraalbertensis Arthur,1906) 。前者与后者在形态和寄主范围上都有明显的区别 ;在澳大利亚 ,杨树叶锈病菌的近似种类是青杨叶锈病菌(Melampsora larici-populina Kleb, 1902) ,该两种锈菌具有相同寄主和转主寄主 ,但是 ,夏孢子形态不同 。三种杨树叶锈病菌的区别见表 C. 1 和图 C. 2。

　　表 C. 1 杨树叶锈病菌与亚伯达杨树锈菌的区别

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　杨树叶锈病菌干标本的制作和孢子保存方法

　　D. 1 杨树叶锈病菌干标本的制作和保存方法

　　将感染杨树叶锈病菌的寄主叶 ,分层压在标本夹中 ,在两层标本纸(每层厚 3 张 ~ 4 张)中放一层标本(不重叠) 。每个标本夹的总厚度以不超过 4 cm 为宜 ,并根据温湿度情况 , 以保证标本不变色发霉为前提 ,及时更换 标 本 纸 。 可 自 然 干 燥 , 也 可 采 用 烘 箱 快 速 干 燥 ; 烘 箱 快 速 干 燥 时 烘 箱 温 度 以 控 制 在(45±3) ℃为宜 , 采 用 快 速 烘 干 法 , 换 标 本 纸 间 隔 时 间 应 不 超 过 2 h。 直 到 标 本 含 水 量 在 20% ~ 30%为宜 。

　　干标本可置于垫有絮棉和樟脑粉的标本盒中进行保存 ,或直接保存在液氮中 。

　　D.2 杨树叶锈病菌孢子的保存方法

　　采用超低温保存方法 :将经(40±2) ℃烘干处理含水量为 20% ~ 30%的夏孢子粉用液氮封存于离心管中 ,或直接密封在离心管中于 -50℃下长期保存 。

　　参 考 文 献

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