GB/T 40176-2021 植物源性产品中木二糖的测定 亲水保留色谱法

　　ICS 07 . 080 CCS A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40176—2021

　　植物源性产品中木二糖的测定

　　亲水保留色谱法

　　Determinationofxylobioseinplant-derivedproducts—

　　Hydrophilicintentionchromatography

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40176—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)归口 。

　　本文件起草单位：江南大学、中国农业科学院农产品加工研究所、北京工商大学、北京萨姆伯科技有限公司、华谱科仪(北京)科技有限公司、利津县检验检测中心。

　　本文件主要起草人：胥传来、王锋、马爱进、顾丰颖、郝帅、李博、朱金锦、许润琦、丁雅楠、刘培瑜、李秀婷、李鹏。

　　GB/T 40176—202 1

　　植物源性产品中木二糖的测定

　　亲水保留色谱法

　　1 范围

　　本文件规定了植物源性产品中木二糖的高效液相亲水保留色谱测定方法。

　　本文件适用于植物源性产品中的木二糖的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 原理

　　试样用水提取，去除脂肪、蛋白质、淀粉、非淀粉糖等杂质，木二糖的还原端与 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)发生衍生反应，生成具有强紫外吸收的稳定产物，对其采用高效液相亲水保留色谱紫外检测，外标法定量。

　　5 试剂和材料

　　除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。

　　5 . 1 试剂

　　5 . 1 . 1 乙腈(CH 3 CN)：色谱纯 。

　　5 . 1 . 2 无水乙醇(CH 3 CH 2 OH) 。

　　5 . 1 . 3 丙酮(CH 3 COCH3) 。

　　5 . 1 . 4 甲醇(CH 3 OH) 。

　　5 . 1 . 5 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(C10 H 10 N2 O) 。

　　5. 1 .6 三氯甲烷(CHCl3)。

　　5. 1 .7 盐酸 (HCl)。

　　5. 1 .8 氢氧化钠(NaOH)。

　　5 . 1 . 9 磷酸(H 3 PO4)：色谱纯 。

　　5. 1 . 10 木二糖(C10 H18 O9 , CAS号：6860-47-5)：纯度 ≥99.0 %。

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　　5 . 2 试剂配制

　　5.2. 1 PMP 甲醇溶液(0.5 mol/L)：称取 87.1 g PMP,加甲醇溶解并定容至 1 L。

　　5 . 2 . 2 氢氧化钠溶液(0 . 3 mol/ L) ：称取 1 . 2 g氢氧化钠，加水溶解并定容至 100 mL。

　　5 . 2 . 3 盐酸溶液(0 . 3 mol/ L) ：量取 25 mL浓盐酸，加水溶解并定容至 1 L。

　　5 . 2 . 4 磷酸水溶液(0 . 1 % ) ：量取 1 mL磷酸，加水溶解并定容至 1 L。

　　5 . 3 标准溶液配制

　　5 . 3 . 1 标准储备液

　　称取 0 . 1 g 木 二 糖，精 确至 0 . 000 1 g, 用 水 溶 解 并 定 容 至 100 mL, 配 制 成 质 量 浓 度 约 为1 000 μg/mL 的标准储备液，储存于 4 ℃条件下，在 1 个月内使用。

　　5 . 3 . 2 标准工作液

　　移取 2 . 5 mL 标 准 储 备 液(5 . 3 . 1) 用 水 定 容 至 25 mL 容 量 瓶，分 别 从 容 量 瓶 中 移 取 0 . 1 mL、

　　0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL 于 10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成质量浓度分别为1.0 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 的系列标准溶液，现用现配。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 高效液相色谱仪：带紫外检测器。

　　6 . 2 色谱柱：亲水保留色谱柱(基质键合两性离子或中性酰胺官能团)。

　　6.3 天平：感量为 0.01 g、0.000 1 g。

　　6 . 4 涡漩混合器。

　　6.5 离心机：离心力 ≥10 000 g。

　　6 . 6 样品粉碎机。

　　6.7 微孔滤膜(水相)：0.45 μm。

　　6 . 8 通风橱。

　　7 试样的制备和保存

　　7 . 1 试样制备

　　7 . 1 . 1 固体样品

　　取植物源性样品至少 200 g,用粉碎机粉碎，并通过孔径为 0 . 25 mm( 60 目)标准筛，混匀，装入洁净容器，密封并标记。

　　7 . 1 . 2 半固体和液体样品

　　取植物源性样品至少 200 g(mL),充分混匀，装入洁净容器，密封并标记。

　　7 . 2 保存

　　易变质试样置于 0 ℃ ~4 ℃保存。

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　　8 分析步骤

　　8 . 1 提取纯化

　　8 . 1 . 1 高蛋白质类样品

　　取 1 g(精确至 0 . 000 1 g)混匀后的样品于烧杯中，用水分散，转移至 50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度;混匀后，取 4 mL溶液于离心管中，25 ℃下 360 W 超声 10 min, 10 000 g 高速离心 10 min;取上清

　　液 1 mL 于 5 mL容量瓶中，在通风橱内用丙酮定容至刻度，混匀后转移至离心管中，25 ℃下 360 W 超声 10 min, 1 500 g 离心 10 min,取 2 mL上清液，氮吹除去丙酮，余渣加水充分溶解，转移至 5 mL容量瓶中，用水定容至刻度，备用。

　　8 . 1 . 2 高淀粉类样品

　　取 1 g(精确至 0 . 000 1 g)混匀后的样品于烧杯中，用水分散，转移至 100 mL容量瓶中，用水定容至刻度;混匀后 ，25 ℃下 360 W 超声 10 min,静置 30 min, 取 5 mL上清液于 20 mL容量瓶中 ，加入

　　无水乙醇定容至刻度，取 5 mL 溶液于离心管中，25 ℃下 360 W 超声 10 min, 10 000 g 高 速 离 心10 min;取 2 mL上清液，氮吹除去乙醇;余渣加水充分溶解，转移至 5 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，备用。

　　8 . 1 . 3 非淀粉糖类样品

　　取 1 g(精确至 0 . 000 1 g)混匀后的样品于烧杯中，用 50 mL水溶解，混匀后转移至 200 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取 5 mL溶液于离心管中，10 000 g 高速离心 10 min;取 1 mL上清液，氮吹除去乙醇，余渣加水充分溶解，转移至 5 mL容量瓶中，用水定容至刻度，备用。

　　注：8 . 1 . 1 、8 . 1 . 2 和 8 . 1 . 3 中的样品分类参见附录 A。

　　8 . 2 柱前衍生化反应

　　吸取不同浓度标准溶液或样品溶液 400 μL,加 0.5 mol/L 的 PMP 甲醇溶液(5.2.1)与 0.3 mol/L 的氢氧化钠溶液(5.2.2)各 400 μL,混匀，70 ℃水浴反应 100 min。再加入 0.3 mol/L 的盐酸溶液(5.2.3)

　　500 μL,在通风橱内用三氯甲烷洗涤 3 次，每次 2 mL,弃去下层三氯甲烷相，取上层水相，0 . 45 μm 水相膜过滤，备用。

　　8 . 3 色谱参考条件

　　色谱参考条件如下。

　　a) 液相色谱柱：亲水保留色谱柱(基质键合两性离子或中性酰胺官能团)，柱长 150 mm, 内径

　　4 . 6 mm,粒径 5 μm,或相当规格色谱柱。

　　b ) 流动相：A 为 0 . 1 %磷酸水溶液，B 为乙腈。

　　c) 流动相流速：1 . 0 mL/min,梯度洗脱程序参见表 1 。

　　d) 柱温：40 ℃ 。

　　e) 进样量：5 μL。

　　f) 检测波长：250 nm。

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　　表 1 梯度洗脱程序

　　8 . 4 标准曲线的制作

　　将系列标准工作液按从低到高的浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的响应值(峰面积)，以标准工作液中木二糖的浓度为横坐标，以响应值(峰面积)为纵坐标，绘制标准曲线。 标准溶液色谱图参见附录 B 中图 B. 1 。

　　8 . 5 样品溶液的测定

　　将待测样品液上机测定。 若待测样品液中木二糖含量超出标准工作曲线 1.0 μg/mL~100 μg/mL范围，应稀释合适倍数后重新测定，记录色谱图。 根据保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线计算待测样品液中木二糖的浓度。 样品溶液色谱图参见附录 B 中图 B. 2、图 B. 3 和图 B. 4 。

　　9 分析结果的表述

　　试样中木二糖含量按照式(1)计算：

　　∞ = ρ × × f ……………………( 1 )

　　式中：

　　∞ —试样中木二糖的含量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

　　ρ —根据样液的峰面积由直线回归方程计算出的木二糖的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL); V —试样定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　f —试样溶液稀释倍数;

　　m —试样称样量，单位为克(g)。

　　计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留 3 位有效数字。

　　10 精密度

　　在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。

　　1 1 其他

　　本方法中植物源产品中木二糖的检出限分别是：高蛋白类产品为 0 . 6 mg/g, 高淀粉类产品为0.6 mg/g,非淀粉糖类产品为 0 . 3 mg/g;定量限分别是：高蛋白类产品为 2 mg/g, 高淀粉类产品为2 mg/g,非淀粉糖类产品为 1 mg/g。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　样品分类说明

　　植物源性样品分类举例参见表 A. 1 。

　　表 A.1 样品分类举例

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　色谱图

　　B.1 木二糖标准品亲水保留色谱图

　　木二糖标准品亲水保留色谱图参见图 B. 1 。

　　图 B.1 木二糖标准品亲水保留色谱图

　　B.2 试样(高蛋白质类产品)中木二糖亲水保留色谱图试样(高蛋白质产品)中木二糖色谱图参见图 B. 2 。

　　图 B.2 试样(高蛋白质类产品)中木二糖亲水保留色谱图

　　B.3 试样(非淀粉糖类产品)中木二糖亲水保留色谱图 试样(非淀粉糖类产品)中木二糖色谱图参见图 B. 3 。

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　　图 B.3 试样(非淀粉糖类产品)中木二糖亲水保留色谱图

　　B.4 试样(高淀粉类产品)中木二糖亲水保留色谱图 试样(高淀粉类产品)中木二糖色谱图参见图 B. 4 。

　　图 B.4 试样(高淀粉类产品)中木二糖亲水保留色谱图