GB/T 40179-2021 植物中有机酸的测定 液相色谱-质谱+质谱法

　　ICS 07 . 080 CCS A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40179—2021

　　植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法

　　Determinationoforganicacidsinplant—

　　Liquidchromatography-tandem massspectrometry

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40179—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、四川大学、中国计量大学、北京工商大学、河北省食品检验研究院。

　　本文件主要起草人：李怀平、冯德建、宋航、吴微、许洋、邹燕、叶善蓉、周李华、叶子弘、马爱进、张岩。

　　GB/T 40179—202 1

　　植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法

　　1 范围

　　本文件规定了植物中有机酸的液相色谱-质谱/质谱测定方法。

　　本文件适用于柑橘、苹果、草莓、黄瓜、西红柿、金银花、党参、山楂、枸杞中富马酸、反式-乌头酸、己二酸、没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、2,5-二羟基苯甲酸和 3,4-二羟基苯甲酸的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　有机酸 organicacids

　　植物材料中一类具有酸性的有机化合物。

　　4 原理

　　试样用 50%甲醇溶液加热回流提取后，经反相色谱柱分离，液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，内标工作曲线法定量。

　　5 试剂或材料

　　除非另有说明，本方法使用的试剂均为色谱纯。 水为 GB/T 6682 规定的一级水。

　　5 . 1 甲醇 。

　　5 . 2 甲酸 。

　　5.3 0.1%甲酸溶液：移取甲酸 1 . 0 mL 于 1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

　　5.4 50%甲醇溶液：移取甲醇 500 . 0 mL 于 1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

　　5 . 5 有机酸标准品：富马酸、反式-乌头酸、己二酸、没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸 、阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸和琥珀酸-2,2,3,3-d4,化合物信息详见附录 A 中表 A. 1,纯度均 ≥98%。

　　5 . 6 单一标准储备液：分别准确称取各有机酸标准品适量(精确到 0 . 01 mg),其中富马酸、反式-乌头酸

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　　和没食子酸用水溶解，己二酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、2,5-二羟基苯甲酸和 3,4-二羟基苯甲酸用甲醇溶解，混匀，配制成浓度均为 1 000 . 0 mg/L 的有机酸单一标准储备液，于 0 ℃ ~4 ℃下密封保存，有效期为 3 个月。

　　5 . 7 混合标准储备液：分别准确吸取适量各有机酸单一标准储备液于同一 10 mL容量瓶中，用 50%甲醇溶液稀释并定容至刻度，混匀，配制成浓度均为 10 . 0 mg/L 的混合标准储备液，于 0 ℃ ~4 ℃下密封保存，有效期为 3 个月。

　　5 . 8 内标储备液：准确称取琥珀酸-2 , 2 , 3 , 3-d4 标准品适量(精确到 0 . 01 mg) ,用 50%甲醇溶液溶解，混匀，配制成浓度为 100 mg/L 的内标储备液，于 0 ℃ ~4 ℃下密封保存，有效期为 3 个月。

　　5 . 9 内标溶液：准确吸取内标储备液 1 . 0 mL 于 100 mL 容量瓶中，用 50%甲醇溶液稀释并定容至刻度，混匀，配制成浓度为 1 . 0 mg/L 的内标溶液，现配现用。

　　5 . 10 混合标准工作溶液：分别准确吸取适量混合标准储备液于 10 mL 容量瓶中，再分别准确加入

　　2.5 mL 内标溶液，用 50% 甲醇溶液稀释配制成浓度均为 0. 10 mg/L、0. 25 mg/L、0. 50 mg/L、0. 75、 1 . 0 mg/L、1 . 25 mg/L 的系列混合标准工作溶液，现配现用。

　　5. 1 1 0.22 μm 亲水性尼龙微孔滤膜。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 液相色谱-质谱/质谱联用仪：配电喷雾离子源(ESI) 。

　　6.2 电子天平：感量为 0.000 1 g 和 0.01 mg。

　　6 . 3 高速离心机：转速不低于 10 000 r/ min。

　　6 . 4 高速均质器。

　　6 . 5 高速粉碎机。

　　6 . 6 冷凝回流装置。

　　7 分析步骤

　　7 . 1 样品制备

　　取金银花、党参、山楂、枸杞等有代表性干制样品约 1 kg,用粉碎机粉碎，混匀，制备好的试样均分成两份，装入洁净的盛样容器内，密封并标识，于 0 ℃ ~4 ℃下避光保存，一周内测定。

　　取柑橘、苹果、草莓、黄瓜、西红柿等有代表性新鲜样品约 1 kg,用均质器制成匀浆，制备好的试样均分成两份，装入洁净的盛样容器内，密封并标识，现制现用。

　　7 . 2 试样处理

　　称取约 1 . 5 g 干样或 10 g鲜样(精确至 0 . 001 g)于 100 mL 圆底烧瓶中，加入内标储备液 625 μL 和50%甲醇溶液 30 mL,加热回流 2 . 5 h,趁热过滤，滤液转入 50 mL容量瓶中，用 15 mL 50%甲醇溶液分三次洗涤圆底烧瓶和样品残渣，洗液合并入容量瓶中，用 50%甲醇溶液定容至刻度，混匀，于 10 000 r/min下离心 5 min,取 2 . 0 mL上清液于 10 mL容量瓶中，用 50%甲醇溶液定容至刻度，混匀，过 0 . 22 μm 尼龙滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

　　7 . 3 仪器参考条件

　　7 . 3 . 1 液相色谱参考条件

　　a) 色谱柱：HSS T3 柱，2.1 mm×150 mm,粒径 1.8 μm,或同等性能的色谱柱;

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　　b ) 流动相：流动相 A 为 0 . 1%甲酸溶液，流动相 B为甲醇，梯度洗脱程序见表 1 ;

　　c) 流速：0.2 mL/min;

　　d) 柱温：30 ℃ ;

　　e) 进样量：1 μL。

　　表 1 流动相梯度洗脱程序

　　7 . 3 . 2 质谱参考条件

　　a) 离子源：电喷雾离子源(ESI) ;

　　b ) 扫描方式：负离子模式;

　　c) 检测方式：多反应监测(MRM) ;

　　d) 干燥气、雾化气、碰撞气均为高纯氮气;使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录 B ;

　　e) 喷雾电压、源内碎裂电压、碰撞气能量等参数应优化至最佳灵敏度，参考条件参见附录 B。

　　7 . 4 液相色谱-质谱/质谱测定

　　7 . 4 . 1 定性测定

　　在相同实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物质的保留时间和标准工作溶液中对应的保留时间一致(变化范围在 ±2 . 5%以内)，且样品谱图中待测组分监测离子的相对丰度和浓度相当的标准品的相对丰度一致，允许偏差不超过表 2 规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

　　表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

　　7 . 4 . 2 定量测定

　　在相同实验条件下，将有机酸系列混合标准工作溶液由低到高浓度依次进样分析，以被测物和内标物的定量离子峰面积之比为纵坐标，以被测物的浓度为横坐标，绘制内标标准工作曲线，用内标标准工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中各被测物的响应值在仪器测定的线性范围内，如果含量超过内标标准工作曲线范围上限，应适当减少取样量后重新测定。 在上述条件下，各有机酸的参考保留时间参见附录 B 中表 B. 1,多反应监测图参见附录 C。

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　　7 . 5 平行试验

　　按 7 . 2~7 . 4 的规定对同一试样进行两次平行测定。

　　8 试验数据处理

　　样品中待测物含量的计算见式(1) :

　　犡 …………………………( 1 )

　　式中：

　　犡 —试样中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

　　ρ —从内标标准工作曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　犞 —试样溶液总体积，单位为毫升(mL) ;

　　犿 —试样的质量，单位为克(g)。

　　计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位小数。

　　9 精密度

　　在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　10 其他

　　本方法测定 14 种有机酸的定量限参见附录 A 中表 A. 1 。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　有机酸化合物信息及定量限

　　有机酸化合物信息及定量限见表 A. 1 。

　　表 A.1 有机酸化合物信息及定量限

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　液相色谱-质谱/质谱参数参考条件

　　参考条件如下：

　　a) 离子源：电喷雾离子源(ESI) ;

　　b ) 扫描方式：负离子模式;

　　c) 检测方式：多反应监测(MRM) ;

　　d) 干燥气、雾化气、碰撞气均为高纯氮气;

　　e) 干燥气温度：290 ℃ ;

　　f) 雾化气压力：207 kPa(30 psi) ;

　　g) 干燥气流速：7.0 L/min;

　　h) 鞘气温度：350 ℃ ;

　　i) 鞘气流速：12.0 L/min;

　　j) 离子源喷雾电压：3 500 V ;

　　k) 定性离子对、定量离子对、碰撞能量、源内碎裂电压见表 B. 1 。

　　表 B.1 15 种有机酸的保留时间、监测离子对、源内碎裂电压和碰撞能量

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　15 种有机酸的液相色谱-质谱/质谱 MRM 图

　　15 种有机酸的液相色谱-质谱/质谱 MRM 图见图 C. 1~图 C. 15 。

　　图 C.1 富马酸的 MRM 图

　　图 C.4 2,5-二羟基苯甲酸的

　　MRM 图

　　图 C.2 反式-乌头酸的 MRM 图

　　图 C.5 己二酸的 MRM 图

　　图 C.3 没食子酸的 MRM 图

　　图 C.6 绿原酸的 MRM 图

　　图 C.7 对羟基苯甲酸的MRM 图

　　图 C.8 3,4-二羟基苯甲酸的

　　MRM 图

　　图 C.9 香草酸的 MRM 图

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　　图 C.10 咖啡酸的 MRM 图

　　图 C.13 阿魏酸的 MRM 图

　　图 C.1 1 丁香酸的 MRM 图

　　图 C.14 水杨酸的 MRM 图

　　图 C.12 对香豆酸的 MRM 图

　　图 C.15 琥珀酸-2 ,2 , 3 , 3-d4 的

　　MRM 图